本發(fā)明屬于植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種菜心炭疽病菌中長(zhǎng)期保存方法。

背景技術(shù)：

菜心是廣東省乃至華南地區(qū)重要特色蔬菜，其栽培面積大，復(fù)種指數(shù)高，可周年生產(chǎn)供應(yīng)。菜心炭疽病是菜心生產(chǎn)上最重要的病害之一，嚴(yán)重影響菜心的品質(zhì)與產(chǎn)量。測(cè)定不同地區(qū)菜心炭疽病菌(也即希金斯炭疽菌colletotrichumhigginsanum)致病力差異、監(jiān)測(cè)病菌的抗藥性變化、評(píng)價(jià)菜心品種的抗病性水平、篩選對(duì)病菌有活性的殺菌劑等研究，均需要有大量的中長(zhǎng)期保存且生物學(xué)特性穩(wěn)定的菜心炭疽病菌株。

目前，植物病原真菌保存方法主要有3種。(1)斜面低溫保存法：即將菌株接種在裝有適宜的固體斜面培養(yǎng)基的玻璃試管內(nèi)，用棉塞和牛皮紙將管口包扎好，待菌株充分生長(zhǎng)后，移至4℃～10℃的冰箱中保藏。該保存方法操作簡(jiǎn)單，使用方便，無需專用儀器設(shè)備，但斜面培養(yǎng)基容易干燥，保存時(shí)間通常不超過一年；此外，保存菌株需要的貯存空間大，器皿保管困難，污染雜菌的機(jī)會(huì)較多，不宜大批量長(zhǎng)時(shí)間保存菌株。(2)冷凍真空干燥保存法：將待保藏菌株的孢子懸液懸浮于保護(hù)劑(如脫脂牛奶、甘油)中，在低溫(-45℃左右)下快速冷凍，在真空條件下使冰升華，以除去大部分水，密封安瓿管，4℃冰箱保存。該方法保藏菌種時(shí)間長(zhǎng)、存活率高，但需要昂貴的冷凍干燥等專業(yè)設(shè)備，保存成本高，不適用于普通實(shí)驗(yàn)室。(3)液氮超低溫保藏法：將菌株菌絲或孢子混懸于含保護(hù)劑(如20％甘油)的液體培養(yǎng)基中，分裝入耐低溫的安瓿瓶或塑料離心管后預(yù)冷，然后移至液氮罐中(-196℃)保存。該方法保存菌株時(shí)間長(zhǎng)，且適合保藏各類微生物，但需要液氮罐等特殊設(shè)備，存在液氮易揮發(fā)需要經(jīng)常添加、管理費(fèi)用高、使用不便等不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種菜心炭疽病菌中長(zhǎng)期保存方法。該方法簡(jiǎn)便、實(shí)用，用于長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)菜心炭疽病菌致病力差異，抗藥性變化、評(píng)價(jià)菜心品種的抗病性水平以及篩選高活性殺菌劑等研究。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種菜心炭疽病菌中長(zhǎng)期保存方法，包括如下步驟：

(1)菜心炭疽病菌分離與培養(yǎng)；

(2)制備sna斜面培養(yǎng)基：取融解后sna培養(yǎng)基，加入到凍存管內(nèi)，傾斜放置，待sna培養(yǎng)基凝固后即制成sna斜面培養(yǎng)基；

(3)菜心炭疽病菌保存：取步驟(1)已純化的菜心炭疽病菌的菌落邊緣菌絲塊接種到步驟(2)凍存管sna斜面培養(yǎng)基上，擰緊封蓋口并用封口膜密封管口，培養(yǎng)后置于4～15℃保存。

為了更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，還包括：

(4)保存菌株的活化：從4℃冰箱中取出裝有菜心炭疽病菌的凍存管，挑取帶菌的培養(yǎng)基塊，置于pda培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，即可見菌絲長(zhǎng)出，備用。

步驟(1)中所述的菜心炭疽病菌分離與培養(yǎng)，包括如下步驟：

采集菜心炭疽病樣，選取帶有典型病斑的組織，用清水沖洗干凈，在病健交界處剪取組織塊；依次在75％的酒精和1％的次氯酸鈉溶液中消毒處理后，在無菌水中漂洗3次；取出后用滅菌的濾紙吸去多余的水分，在超凈工作臺(tái)吹干后置于pda平板上培養(yǎng)；待長(zhǎng)出菌絲后，挑取菌落邊緣菌絲塊進(jìn)行再培養(yǎng)；采用單菌絲挑取法或單孢分離法對(duì)所分離的菌株進(jìn)行純化，經(jīng)科赫氏法則驗(yàn)證后得到菜心炭疽病菌。

所述的組織塊為0.3cm×0.5cm大小的組織塊。

所述的消毒的時(shí)間為15s～45s，優(yōu)選為30s。

所述的培養(yǎng)的溫度為25℃～30℃，優(yōu)選為27℃。

步驟(2)中所述的sna(合成低營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基)培養(yǎng)基：1g/lkh2po4，1g/lkno3，0.5g/lmgso4·7h2o，0.5g/lkcl，0.2g/l葡萄糖，0.2g/l蔗糖，15g/l瓊脂粉；120℃滅菌20min后備用。

步驟(3)中所述的培養(yǎng)的條件為25℃～30℃培養(yǎng)2d～5d，優(yōu)選為27℃培養(yǎng)2d。

步驟(3)中所述的保存時(shí)間至少長(zhǎng)達(dá)4年。

步驟(4)中所述的活化培養(yǎng)的條件為25℃～30℃活化培養(yǎng)3d～7d，優(yōu)選為27℃培養(yǎng)5d。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

(1)操作簡(jiǎn)便：保存菌株在超凈工作臺(tái)操作，保存在潔凈、普通冰箱即可，無需昂貴的設(shè)備。

(2)無需較大空間：2ml凍存管體積小，長(zhǎng)12cm的方形塑料盒可放入81管，相當(dāng)于可以保存81株菌株。

(3)保存時(shí)間較長(zhǎng)：菜心炭疽病菌在sna斜面培養(yǎng)基上低溫保存的環(huán)境下可以存活4年以上，且保持較強(qiáng)的致病力。

附圖說明

圖1是保存菜心炭疽病菌的操作流程圖。

圖2是菜心炭疽病菌在pda上27℃培養(yǎng)5d時(shí)的菌落形態(tài)圖。

圖3是菜心炭疽病菌保存用的凍存管及凍存管盒圖。

圖4是保存4年后菜心炭疽病菌27℃活化5d的菌落生長(zhǎng)形態(tài)圖。

圖5是保存4年后菜心炭疽病菌的致病效果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

原材料規(guī)格：

所述的sna(合成低營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基)培養(yǎng)基：1g/lkh2po4，1g/lkno3，0.5g/lmgso4·7h2o，0.5g/lkcl，0.2g/l葡萄糖，0.2g/l蔗糖，15g/l瓊脂粉；120℃滅菌20min后備用。

sna培養(yǎng)基配方組份的材料均為分析純化學(xué)試劑。

其它實(shí)驗(yàn)操作所需要的2ml凍存管、pda培養(yǎng)基、蒸餾水、培養(yǎng)皿、移液器、滅菌鍋、冰箱、超凈工作臺(tái)等均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)材料或工具。

保存菜心炭疽病菌的操作流程圖，如圖1所示。

實(shí)施例1對(duì)來源于田間的菜心炭疽病樣中病菌分離和保存效果

(1)在田間挑選典型的菜心炭疽病新鮮病樣，清水沖洗干凈后剪取病健交界處組織塊(約0.3cm×0.5cm)，在超凈工作臺(tái)上分別用75％酒精和1％次氯酸鈉溶液各消毒30s，無菌水沖洗三遍后晾干水分，然后移至pda平板上，27℃培養(yǎng)5d后挑選菌落邊緣菌絲塊純化培養(yǎng)即可獲得分離菌。

(2)用無菌的經(jīng)曬干的豇豆組織塊(去掉籽粒)插入到分離菌的菌落邊緣處，27℃培養(yǎng)5d后鏡檢豇豆組織塊，若能在豇豆組織塊表皮鏡檢到大量的長(zhǎng)橢圓形分生孢子，即可初步確定為菜心炭疽病的病原菌(希金斯炭疽菌)。將獲得的分生孢子接種菜心，確認(rèn)其對(duì)菜心致病并引起典型的炭疽病癥狀；然后進(jìn)行單孢分離和純化培養(yǎng)，從而獲得菜心炭疽病菌。菜心炭疽病菌菌落形態(tài)如圖2所示。

(3)將純化后的菜心炭疽病菌置于pda培養(yǎng)基上27℃培養(yǎng)5d，然后用無菌牙簽挑取菌落邊緣菌絲塊接種到2ml凍存管內(nèi)的sna斜面培養(yǎng)基上，擰緊封蓋口并用封口膜密封管口，放入凍存管盒，27℃培養(yǎng)2d后，置于4℃冰箱保存。菜心炭疽病菌保存用凍存管及凍存管盒如圖3所示。

(4)將保存1年、2年和3年的菜心炭疽病菌，各挑取一小塊帶菌絲的培養(yǎng)基到pda平板上，27℃培養(yǎng)3d，觀察有無菌絲長(zhǎng)出。長(zhǎng)出新的菌絲，即判定是存活；未長(zhǎng)出新的菌絲，即判定為死亡。如此隨機(jī)各挑取20個(gè)保存的凍存管中的菌株到pda平板上活化，檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)存活管比例。檢測(cè)結(jié)果顯示，隨機(jī)挑選的保存1年、2年和3年的管中菌株全部存活，存活率為100％。

實(shí)施例2對(duì)中長(zhǎng)期保存的菜心炭疽病菌保存效果的檢測(cè)

(1)保存的菜心炭疽病菌存活率檢測(cè)

從實(shí)施例1保存4年的2ml凍存管內(nèi)隨機(jī)挑取一小塊帶菌絲的培養(yǎng)基到pda平板上，27℃培養(yǎng)3d，觀察有無菌絲長(zhǎng)出。長(zhǎng)出新的菌絲，即判定是存活；未長(zhǎng)出新的菌絲，即判定為死亡。如此隨機(jī)挑取50個(gè)保存4年的凍存管中的菌到pda平板上活化，檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)存活管比例。檢測(cè)結(jié)果顯示，隨機(jī)挑選的保存4年的管中菌全部是存活的，存活率為100％(圖4)。

(2)保存的菜心炭疽病菌致病力測(cè)定

從實(shí)施例1保存4年的2ml凍存管內(nèi)隨機(jī)挑取一小塊帶菌絲的培養(yǎng)基到pda平板上，27℃培養(yǎng)，待其長(zhǎng)出菌絲后在平板上插入無菌的曬干豇豆莢，黑暗培養(yǎng)7d后，用清水洗下分生孢子，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)量孢子懸浮液濃度，并稀釋至1×10⁵個(gè)孢子/ml。將孢子懸浮液用手持噴霧器接種到3～4片真葉期的菜心葉片上，葉面布滿小水珠但不下滴，黑暗保濕12h后，置于25±2℃溫室內(nèi)，早上和傍晚花灑澆一次水。接種5d后調(diào)查葉片的發(fā)病情況。如此隨機(jī)測(cè)試3株不同來源的菌株的致病力。測(cè)定結(jié)果表明，保存4年的3株菜心炭疽病菌均能使菜心葉片發(fā)病，發(fā)病葉面積占全部葉面積的50％以上，說明保存4年的菜心炭疽病菌仍具有強(qiáng)致病力(圖5)。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。