本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)提取技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種重組人源iii型膠原蛋白的純化方法和制備方法。

背景技術(shù)：

目前，膠原蛋白的來源主要分為：

動物源膠原蛋白傳統(tǒng)提取法：通過用酸、堿水解法從動物結(jié)締組織(豬皮、牛皮、驢、皮、魚等)中提取但所得到的產(chǎn)品成分復雜。

類膠原蛋白的化學合成法：化學合成法提供了一條快速、高效的蛋白質(zhì)制備途徑，同時它能方便地引入非天然氨基酸，改變碳鏈骨架以及進行其它化學修飾來提高蛋白質(zhì)活性，構(gòu)建新蛋白。此項技術(shù)應(yīng)用于類膠原蛋白的合成中，并利用其技術(shù)特點賦予類膠原蛋白新的生理功能。

膠原蛋白的重組表達：充分利用膠原蛋白的優(yōu)良特性，避免動物來源產(chǎn)品的高風險，利用基因工程技術(shù)，選用各種宿主細胞，如轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基因植物、昆蟲細胞、細菌、酵母等生產(chǎn)重組人膠原蛋白和明膠，產(chǎn)品具有安全性好、重現(xiàn)性好、質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點，解決了傳統(tǒng)提取方法存在的諸如瘋牛病病毒隱患等缺點，同時也改善了膠原蛋白的親水性、免疫排異性等性能。

國內(nèi)膠原蛋白廠商大多采用大腸桿菌發(fā)酵表達膠原蛋白，但是細菌表達系統(tǒng)普遍存在以下缺點：產(chǎn)生的致熱源(例如內(nèi)毒素)致使表達產(chǎn)物難以應(yīng)用于臨床；目的蛋白常以包涵體形式表達，致使產(chǎn)物純化困難；原核表達系統(tǒng)的翻譯后加工修飾體系不完善，表達產(chǎn)物的生物活性較低等。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種重組人源iii型膠原蛋白的純化方法，該純化方法可防止蛋白降解、降低內(nèi)毒素的產(chǎn)生，提高重組人源iii型膠原蛋白的含量。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種重組人源iii型膠原蛋白的制備方法，該純化方法可防止蛋白降解、降低內(nèi)毒素的產(chǎn)生，提高重組人源iii型膠原蛋白的含量。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：

一種重組人源iii型膠原蛋白的純化方法，其包括：將由具有表達出重組人源iii型膠原蛋白能力的重組酵母菌發(fā)酵得到的發(fā)酵液進行第一次熱處理，得到變性液，上述第一次熱處理的溫度為65-75℃。

一種重組人源iii型膠原蛋白的制備方法，其包括：培養(yǎng)具有表達出重組人源iii型膠原蛋白能力的重組酵母菌，獲取發(fā)酵液；上述發(fā)酵液按上述重組人源iii型膠原蛋白的純化方法進行純化，得到重組人源iii型膠原蛋白。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明提供的重組人源iii型膠原蛋白的純化方法，通過在溫度為65-75℃條件下熱處理由具有表達出重組人源iii型膠原蛋白能力的重組酵母菌發(fā)酵得到的發(fā)酵液，有效地防止了發(fā)酵液中的重組人源iii型膠原蛋白降解成小分子肽，并降低發(fā)酵液中內(nèi)毒素的產(chǎn)生，大大地提高了重組人源iii型膠原蛋白純度，達到符合化妝品原料、醫(yī)療器械以及醫(yī)用級的高純度膠原蛋白。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應(yīng)當理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實施例，因此不應(yīng)被看作是對范圍的限定，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1為本發(fā)明實施例1提供的重組人源iii型膠原蛋白工程菌的生物保藏信息；

圖2為本發(fā)明實施例1提供的重組人源iii型膠原蛋白原液的sds-page電泳檢測結(jié)果。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對本發(fā)明實施例的一種重組人源iii型膠原蛋白的純化方法和制備方法進行具體說明。

一方面，本發(fā)明提供的重組人源iii型膠原蛋白的純化方法，包括如下步驟：

s1過濾

取由具有表達出重組人源iii型膠原蛋白能力的重組酵母菌發(fā)酵得到的發(fā)酵液，離心，上清液過濾，取過濾液。

所用重組酵母菌例如是保藏編號為cgmccno.12491的重組酵母菌株。該重組人源iii型膠原蛋白工程菌生物保藏信息：分類命名為巴斯德畢氏酵母(pichiapastoris)，于2016年5月23日在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為cgmccno.12491。本實施例所用重組人源iii型膠原蛋白工程菌的生物保藏信息以及存活證明可參見圖1。

s2熱處理

將過濾液進行第一次熱處理(即將過濾液加熱至預(yù)設(shè)溫度，保溫預(yù)設(shè)的時間)，得到變性液。

優(yōu)選地，上述第一次熱處理的溫度為65-75℃。更優(yōu)選地，第一次熱處理的溫度為68-72℃；再優(yōu)選地，第一次熱處理的溫度為70℃。

優(yōu)選地，上述第一次熱處理的時間為8-12min。更優(yōu)選地，上述第一次熱處理的時間為10min。

本發(fā)明的發(fā)明人在長期的研究過程中，驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過上述熱處理步驟的作用，既能防止重組人源iii型膠原蛋白被蛋白酶降解，又能在沒有酸、堿、水解酶的作用下保持膠原蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不被水解。

s3鹽析

往上述變性液中加入硫酸銨至飽和度為28-30％，室溫靜置，離心，收集沉淀。

優(yōu)選地，加入飽和硫酸銨溶液至飽和度為30％。

通過鹽析步驟，可使膠原蛋白(130kd)沉淀并去除絕大部分小分子雜質(zhì)，提高蛋白純度。

向某些蛋白質(zhì)溶液中加入某些無機鹽溶液后，可以降低蛋白質(zhì)的溶解度，使蛋白質(zhì)凝聚而從溶液中析出,這種作用叫作鹽析，這個過程是物理變化，可復原并能保證蛋白質(zhì)的活性，該方法在實驗室研究和工業(yè)化生產(chǎn)都有應(yīng)用。陽離子交換層析是利用不同分子在所設(shè)計的條件(如ph、離子強度等)下，攜帶電荷情況不同，與陽離子交換劑結(jié)合的強度不同，可以用不同的條件洗脫出不同的組分的一種層析法；該方法的特點是處理量大，條件可控，易獲得高純度的蛋白，可放大生產(chǎn)。

在本發(fā)明中，利用鹽析的方法對發(fā)酵液進行初提，結(jié)合后后續(xù)的陽離子交換柱可進一步純化得到高純度的膠原蛋白。

s4溶解

溶解上述沉淀，用0.65μm濾膜過濾后，用含18-22mm檸檬酸鹽、48-52mm氯化鈉、ph為5.8-6.2的第一緩沖液(即檸檬酸緩沖液)換液，得到粗蛋白液。

優(yōu)選地，第一緩沖液含20mm檸檬酸鹽和50mm氯化鈉，ph6.0。

s5低鹽洗脫

將上述粗蛋白液加入至層析柱，并用含18-22mm檸檬酸鹽、145-155mm氯化鈉、ph為5.8-6.2的第二緩沖液換液進行低鹽洗脫。

優(yōu)選地，第二緩沖液換液含20mm檸檬酸鹽和150mm氯化鈉，ph6.0。有利于去除雜質(zhì)，提高后續(xù)膠原蛋白的純度。

s6高鹽洗脫

用含18mm檸檬酸鹽、245-255mm氯化鈉、ph為5.8-6.2的第三緩沖液換液進行高鹽洗脫，收集洗脫液。

優(yōu)選地，第三緩沖液換液含20mm檸檬酸鹽和250mm氯化鈉，ph6.0。

s7超濾脫鹽

用30kd超濾膜包18-22mmol/lph為5.8-6.2的檸檬酸鹽緩沖液對上述洗脫液進行脫鹽換液，得到重組人源iii型膠原蛋白的膠原蛋白溶液。

優(yōu)選地，用20mmol/lph為6.0的檸檬酸鹽緩沖液對上述洗脫液進行脫鹽換液。

s8熱處理

對上述膠原蛋白溶液進行第二熱處理，上述第二次熱處理的溫度為65-75℃，時間為8-12min。得到重組人源iii型膠原蛋白原液。

優(yōu)選地，上述第二次熱處理的溫度為70℃，時間為10min。

通過第二次熱處理的作用，可再次制約蛋白酶對膠原蛋白的降解，提高膠原蛋白純度。

綜上，本發(fā)明提供的重組人源iii型膠原蛋白的純化方法，采用采用熱變性方法防止膠原蛋白降解成小分子肽，并利用硫酸銨沉淀去除膠原蛋白(130kd)以下分子量的雜質(zhì)，再結(jié)合陽離子交換層析技術(shù)純化，使得所純化得到重組人源iii型膠原蛋白達到符合化妝品原料、醫(yī)療器械以及醫(yī)用級的高純度膠原蛋白；

該純化方法是一種全新的純化方法，是首次以加熱防止降解和利用陽離子離子交換結(jié)合的方式來進行純化的膠原蛋白，有效地防止了發(fā)酵液中的重組人源iii型膠原蛋白降解成小分子肽，并降低發(fā)酵液中內(nèi)毒素的產(chǎn)生，大大地提高了重組人源iii型膠原蛋白純度。并相對于現(xiàn)有的采用鎳親和柱進行純化存在重金屬鎳的脫落成為隱患的純化方式，本發(fā)明的純化方法更環(huán)保、安全。

另一方面，本發(fā)明提供了一種重組人源iii型膠原蛋白的制備方法，其包括：

培養(yǎng)具有表達出重組人源iii型膠原蛋白能力的重組酵母菌，獲取發(fā)酵液；

上述發(fā)酵液按上述重組人源iii型膠原蛋白的純化方法進行純化，得到重組人源iii型膠原蛋白。

上述制備方法所制得的重組人源iii型膠原蛋白純度高、活性高，達到符合化妝品原料、醫(yī)療器械以及醫(yī)用級的高純度膠原蛋白的級別。

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進一步的詳細描述。

實施例1

本實施例提供的重組人源iii型膠原蛋白的純化方法，包括如下步驟。

1.1過濾步驟：

取由具有表達出重組人源iii型膠原蛋白能力的重組酵母菌(保藏編號為cgmccno.12491)發(fā)酵得到的發(fā)酵液，5000rpm，離心10min；取上清液用濾紙(一般的實驗室定性濾紙)過濾，收集過濾液。

cgmccno.12491的重組酵母菌的培養(yǎng)方法參考申請?zhí)枮?016111191228，名稱為“一種重組人源iii型膠原蛋白工程菌的發(fā)酵方法與發(fā)酵培養(yǎng)基”的中國專利申請中的培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)，得到發(fā)酵液。

該重組人源iii型膠原蛋白工程菌生物保藏信息：分類命名為巴斯德畢氏酵母(pichiapastoris)，于2016年5月23日在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為cgmccno.12491。

本發(fā)明本實施例所用重組人源iii型膠原蛋白工程菌的生物保藏信息以及存活證明可參見圖1。

1.2第一次熱處理步驟：

將過濾液加熱至70℃，保溫10min，進行第一次熱處理，得到變性液。

防止重組人源iii型膠原蛋白被蛋白酶降解，以維持其在沒有酸、堿、水解酶的作用下保持膠原蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，并降低內(nèi)毒素的產(chǎn)生，有利于提高后續(xù)膠原蛋白的純度。

需要說明的是，在其他的實施例中，第一次熱處理的溫度可以是65、66、67、68、69、71、72、73、74、75℃中的任意一種，只要在65-75℃的范圍內(nèi)即可。第一次熱處理的時間可以是8、9、11、12min中的任意一種，只要在8-12min的范圍內(nèi)即可。

1.3鹽析步驟：

往上述變性液中加入飽和硫酸銨溶液至飽和度為30％，室溫靜置10min，5000rpm，離心10min，收集沉淀，直接用于后續(xù)純化或凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

需要說明的是，在其他的實施例中，硫酸銨在變性液中的飽和度可以是28％、29％、31％、32％中的任意一種，只要是在28-32％的范圍內(nèi)即可。

1.4溶解步驟：

1.4.1用超純水溶解上述沉淀，再用0.65μm濾膜過濾，收集濾液；

1.4.2上述濾液用含20mm檸檬酸鹽、50mm氯化鈉、ph6.0的檸檬酸緩沖液(第一緩沖液)換液，得到粗蛋白液。

需要說明的是，在其他的實施例中，第一緩沖液可以是含18mm檸檬酸鹽、48mm氯化鈉、ph5.8的檸檬酸緩沖液，或者是含22mm檸檬酸鹽、52mm氯化鈉、ph6.2的檸檬酸緩沖液，均可。

1.5低鹽洗脫步驟：

1.5.1用sphp填料(ge公司)填充層析柱進行純化，用3-5倍柱床體積20mm檸檬酸鹽、50mm氯化鈉、ph6.0的檸檬酸緩沖液平衡層析柱，控制流速為1ml/3min，直至uv280基線平緩。

1.5.2將上述粗蛋白液加入至層析柱，用含20mm檸檬酸鹽和50mm氯化鈉，ph6.0的檸檬酸緩沖液過柱，洗出未被吸附物質(zhì)。收集流穿液。

1.5.3用2-3倍柱床體積含20mm檸檬酸鹽和150mm氯化鈉，ph6.0的檸檬酸緩沖液(第二緩沖液)進行低鹽洗脫，以去除雜質(zhì)，提高后續(xù)膠原蛋白的純度。收集洗滌液。

需要說明的是，在其他的實施例中，第二緩沖液可以是含18mm檸檬酸鹽、145mm氯化鈉、ph5.8的檸檬酸緩沖液，或者是含22mm檸檬酸鹽、155mm氯化鈉、ph6.2的檸檬酸緩沖液，均可。

1.6高鹽洗脫步驟：

用含20mm檸檬酸鹽和250mm氯化鈉，ph6.0的檸檬酸緩沖液(第三緩沖液)進行高鹽洗脫，收集洗脫液。

需要說明的是，在其他的實施例中，第三緩沖液可以是含18mm檸檬酸鹽、245mm氯化鈉、ph5.8的檸檬酸緩沖液，或者是含22mm檸檬酸鹽、255mm氯化鈉、ph6.2的檸檬酸緩沖液，均可。

1.7超濾脫鹽步驟：

用30kd超濾膜包20mmol/lph為6.0的檸檬酸鹽緩沖液對上述洗脫液進行脫鹽換液，得到重組人源iii型膠原蛋白溶液。

需要說明的是，在其他的實施例中，該步驟可以用18mmol/lph為5.8的檸檬酸鹽緩沖液，或者是22mmol/lph為6.2的檸檬酸鹽緩沖液進行脫鹽換液。

1.8第二次熱處理步驟：

將上述膠原蛋白溶液加熱至70℃，保溫10min，并以0.2μm的濾膜除菌過濾，得到重組人源iii型膠原蛋白原液。通過第二次熱處理的作用，可再次制約蛋白酶對膠原蛋白的降解，提高膠原蛋白純度，降低內(nèi)毒素的產(chǎn)生。

經(jīng)sds-page電泳檢測，結(jié)果如圖2所示(圖中：m為蛋白maker，1為粗蛋白液，2為流穿液，3為洗滌液，4為重組人源iii型膠原蛋白原液)，相較于粗蛋白液和流穿液，純化后的膠原蛋白溶液的在130kd的位置有條帶(符合預(yù)期)，且條帶單一，說明純度高，已達到電泳純。

需要說明的是，在其他的實施例中，第二次熱處理的溫度可以是65、66、67、68、69、71、72、73、74、75℃中的任意一種，只要在65-75℃的范圍內(nèi)即可。第二次熱處理的時間可以是8、9、11、12min中的任意一種，只要在8-12min的范圍內(nèi)即可。

實施例2

本實施例提供了重組人源iii型膠原蛋白的制備方法，其包括：

培養(yǎng)具有表達出重組人源iii型膠原蛋白能力的重組酵母菌(cgmccno.12491)，獲取發(fā)酵液；培養(yǎng)方法參考申請?zhí)枮?016111191228，名稱為“一種重組人源iii型膠原蛋白工程菌的發(fā)酵方法與發(fā)酵培養(yǎng)基”的中國專利申請中的培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)，得到發(fā)酵液。

按實施例1提供的重組人源iii型膠原蛋白的純化方法進行純化，得到膠原蛋白原液。

綜上，本發(fā)明提供的重組人源iii型膠原蛋白的純化方法，采用采用熱變性方法防止膠原蛋白降解成小分子肽，并利用硫酸銨沉淀去除膠原蛋白(130kd)以下分子量的雜質(zhì)，再結(jié)合陽離子交換層析技術(shù)純化，使得所純化得到重組人源iii型膠原蛋白達到符合化妝品原料、醫(yī)療器械以及醫(yī)用級的高純度膠原蛋白；

該純化方法是一種全新的純化方法，是首次以加熱防止降解和利用陽離子離子交換結(jié)合的方式來進行純化的膠原蛋白，有效地防止了發(fā)酵液中的重組人源iii型膠原蛋白降解成小分子肽，并降低發(fā)酵液中內(nèi)毒素的產(chǎn)生，大大地提高了重組人源iii型膠原蛋白純度。并相對于現(xiàn)有的采用鎳親和柱進行純化存在重金屬鎳的脫落成為隱患的純化方式，本發(fā)明的純化方法更環(huán)保、安全。

本發(fā)明提供的重組人源iii型膠原蛋白的制備方法所制得的重組人源iii型膠原蛋白純度高、活性高，達到符合化妝品原料、醫(yī)療器械以及醫(yī)用級的高純度膠原蛋白的級別。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。