本發(fā)明涉及廢水生物處理與回用中的菌群培養(yǎng)領域，具體涉及一種厭氧條件下富集培養(yǎng)丙酸氧化菌及其互營共生菌群的方法。

技術背景

有機物厭氧生物代謝產甲烷過程，主要是通過不同類型微生物菌群協(xié)同作用將大分子有機物質降解為揮發(fā)性脂肪酸等中間產物，并最終轉化為ch4、co2和h2o等物質。其中丙酸是此過程中重要的中間代謝產物，有研究表明，體系中甲烷產量中大約有35％以上是由丙酸轉化而來的。然而丙酸不能被產甲烷菌群直接代謝，需要先轉化為乙酸而后被利用，此過程受熱動力學限制(δg⁰>0)，反應不能自發(fā)進行，需其他耗氫菌群配合形成互營共生體。然而受限于“代謝鏈”前段的發(fā)酵產酸細菌和后段共生氫營養(yǎng)型產甲烷菌群代謝的影響，丙酸易在厭氧系統(tǒng)中發(fā)生累積，被認為是厭氧生物代謝過程限速步驟。丙酸的過度積累不僅影響體系環(huán)境生態(tài)因子，對包括產甲烷菌群在內的其他微生物菌群產生抑制作用，而且會通過反饋抑制剩余有機物的水解酸化，進而導致厭氧生物代謝全鏈條受阻，處理效能和運行穩(wěn)定性下降。因此，提高厭氧生物代謝系統(tǒng)中丙酸的降解效率，緩解或解除其在系統(tǒng)內的過度累積效應，是保證系統(tǒng)穩(wěn)定運行，提高原料轉化效率的關鍵措施。

目前，構建高效丙酸氧化菌及其互營共生菌群，實現(xiàn)丙酸在體系內的快速代謝降解，是提升有機物厭氧生物處理效能和運行穩(wěn)定性的主要思路。然而，常規(guī)方式主要是通過調控包括ph、orp(氧化還原電位)、堿度、有機負荷和水力停留時間等體系環(huán)境生態(tài)因子，最終找出共培養(yǎng)體最適合的生態(tài)因子范圍并獲得共培養(yǎng)菌群，如專利cn104591402a(一種互營脂肪酸氧化菌與產電菌優(yōu)勢菌群的構建方法)；或者將多種類型專性降解菌疊加形成復合菌群的方式，如專利cn106085926a(快速解除丙酸積累的復合菌及其制備方法和應用)、專利cn104862259a(高有機負荷中溫沼氣發(fā)酵復合菌劑、其制備方法和用途)。但均存在一定的缺陷，如通過調控體系環(huán)境生態(tài)因子進而獲得共培養(yǎng)菌群方式中，報道獲得的共生耗氫菌群主要有同型產乙酸菌、產甲烷菌和硫酸鹽還原菌三大類；其中，同型產乙酸菌比生長速率大，生長周期長；產甲烷菌對環(huán)境條件較為嚴格，代謝緩慢；硫酸鹽還原菌生長過程中存在碳源競爭，且產生h2s抑制厭氧過程，產生臭味；同時，均存在富集效率低，后續(xù)應用效果差，實施效果不高。在將多種類型專性降解菌疊加形成復合菌群的方式中，目前已鑒定得到的中溫丙酸氧化菌主要來源于δ-變形菌門綱(delta-proteobacteria)和梭狀桿菌綱(clostridia)，包含4個屬6個種，分布稀少，培養(yǎng)周期長，不易富集，菌株獲取困難，商業(yè)價格高昂，且代謝類型和生境條件各異，簡單地將全部菌群疊加在一起，未考慮代謝類型和生境條件差異，菌體在實施過程中易流失，效果大打折扣。

促進不同類型和營養(yǎng)型菌群融合，優(yōu)化共生菌群結構及其代謝通路，強化生物鏈式協(xié)同代謝實現(xiàn)丙酸的優(yōu)先降解與快速轉化，解決中間產物代謝和轉化的不平衡的問題，為產甲烷過程提供優(yōu)質底物，實現(xiàn)產甲烷過程高效穩(wěn)定持續(xù)運行是當前解決這一問題的最新途徑，但目前尚未見之于報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種厭氧條件下富集培養(yǎng)丙酸氧化菌及其互營共生菌群的方法。在抑制產甲烷代謝下，通過酸化、投加硝酸鹽并控制基質中cod/no3^--n值連續(xù)培養(yǎng)，丙酸氧化菌及其互營共生菌群數(shù)量增殖2個數(shù)量級以上，富集以互營桿菌屬(syntrophobacter)和史密斯氏菌屬(smithella)為主要丙酸氧化菌，以氫營養(yǎng)型產甲烷菌群和反硝化菌群為主要互營共生菌群，伴隨以丙酸和氫為物質基礎的代謝菌群結構的優(yōu)勢菌群。以實現(xiàn)優(yōu)化共生菌群結構及其代謝通路，強化生物鏈式協(xié)同代謝實現(xiàn)丙酸的優(yōu)先降解與快速轉化，解決中間產物丙酸代謝和轉化的不平衡的問題。

本發(fā)明的目的通過如下技術方案實現(xiàn)。

一種厭氧條件下富集培養(yǎng)丙酸氧化菌及其互營共生菌群的方法，包括如下步驟：

(1)在密閉的連續(xù)攪拌槽式反應器(cstr)中接種厭氧的絮狀或顆粒狀污泥，加入甲烷代謝抑制劑培養(yǎng)后，進行酸化，得到酸化的基質；

(2)在酸化的基質中，以丙酸鹽為碳源、硝酸鹽為氮源，控制基質體系的cod/no3^--n值進行連續(xù)培養(yǎng)，得到富集的丙酸氧化菌及其互營共生菌群。

進一步地，步驟(1)中，所述密閉的連續(xù)攪拌槽式反應器使用前用氬氣驅趕掉溶解氧，并投加鐵粉、l-半胱氨酸和刃天青指示劑用于降低和指示體系內氧化還原電位值，控制體系中氧化還原電位在-350～-200mv。

進一步地，步驟(1)中，所述厭氧的絮狀或顆粒狀污泥為沉淀池、消化池或廢水厭氧反應器中的絮狀或顆粒狀污泥，且接種前用篩網篩去包括紙屑、塑料片以及小石塊在內的雜質。

進一步地，步驟(1)中，所述厭氧的絮狀或顆粒狀污泥接種的投加濃度控制在1～5gvss/l。

進一步地，步驟(1)中，所述產甲烷代謝抑制劑為2-溴乙烷磺酸(bes)。

進一步地，步驟(1)中，所述產甲烷代謝抑制劑為一次性加入，相對污泥的最終使用濃度為5～10mmol/l。

進一步地，步驟(1)中，加入產甲烷代謝抑制劑培養(yǎng)的時間由體系產甲烷速率大小決定，優(yōu)選為4～12小時。

進一步地，步驟(1)中，所述酸化采用加入丙酸鹽和稀硝酸的混合液進行酸化。

更進一步地，所述丙酸鹽和稀硝酸的混合液中，丙酸鹽和稀硝酸的質量比為10～15:1。

進一步地，步驟(1)中，所述酸化過程中，控制體系的ph值在6.0～6.5之間，酸化的時間為12-24小時。

進一步地，步驟(2)中，所述硝酸鹽包括硝酸鈉、硝酸鉀和硝酸銨中的一種以上。

進一步地，步驟(2)中，所述硝酸鹽由少至多分2～3次連續(xù)投加，直至達到基質體系的預定cod/no3^--n值。

進一步地，步驟(2)中，控制基質體系中的cod值在2500～4000mg/l。

進一步地，步驟(2)中，控制基質體系中的cod/no3^--n值在5～200之間。

進一步地，步驟(2)中，所述連續(xù)培養(yǎng)的溫度控制在35～40℃中溫范圍內。

進一步地，步驟(2)中，所述連續(xù)培養(yǎng)的ph值控制在6.5～7.2范圍內。

進一步地，步驟(2)中，所述連續(xù)培養(yǎng)過程中的攪拌速率在10～30r/min之間。

進一步地，步驟(2)中，所述連續(xù)培養(yǎng)的時間為7～30天。

進一步地，培養(yǎng)得到富集的丙酸氧化菌及其互營共生菌群，是以互營桿菌屬和史密斯氏菌屬為主要丙酸氧化菌，以氫營養(yǎng)型產甲烷菌群和反硝化菌群為主要的互營共生菌群，同時伴隨以丙酸和氫為物質基礎的代謝菌群結構的優(yōu)勢菌群。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點和有益效果：

(1)本發(fā)明的富集培養(yǎng)方法操作簡便、富集效率高，對外界環(huán)境條件無特殊要求，參數(shù)控制少，條件易控，經濟可行，實施過程方便，后續(xù)可用于厭氧生物降解過程過度酸化等異常狀況的緩解和修復，具有顯著實用價值；

(2)本發(fā)明的富集培養(yǎng)方法將反硝化代謝過程部分引入傳統(tǒng)厭氧生物處理過程中，形成大量以丙酸和氫為物質來源的優(yōu)勢菌群，培養(yǎng)得到的共生菌群對丙酸降解速率快，降解速率高，在短時期內可實現(xiàn)丙酸的高效降解，培養(yǎng)過程可重復性強；

(3)本發(fā)明的富集培養(yǎng)方法操作簡便，為混菌條件下培養(yǎng)具有共同特質的微生物優(yōu)勢菌群提供了參考和指導。

附圖說明

圖1為本發(fā)明具體實施方式中富集培養(yǎng)丙酸氧化菌及其互營共生菌群的具體流程示意圖；

圖2為實施例1中富集培養(yǎng)后菌群用于丙酸降解效果的研究結果示意圖；

圖3為實施例2中富集培養(yǎng)后菌群用于丙酸降解效果的研究結果示意圖。

具體實施方式

為了便于理解本發(fā)明內容，下面將參照相關附圖對本發(fā)明作進一步說明，闡明本發(fā)明的突出特點和顯著進步，僅在于說明本發(fā)明而絕不局限于以下所描述的實施例。

本發(fā)明具體實施方式中富集培養(yǎng)丙酸氧化菌及其互營共生菌群的具體流程示意圖如圖1所示，包括步驟：在密閉的連續(xù)攪拌槽式反應器中接種污泥，加入產甲烷抑制劑進行甲烷代謝的抑制，酸化以及加入碳、氮源控制基質碳氮比進行連續(xù)富集培養(yǎng)，得到丙酸氧化菌及其互營共生菌群。

本發(fā)明具體實施方式中的高通量測序條件如下：

高通量測序在miseq測序平臺(illumina,usa)上完成，實驗過程中選用引物對515f(5’-gtgccagcmgccgcggtaa-3’)和806r(5’-ggactachvgggtwtctaat-3’)對16srdna基因v4可變區(qū)進行擴增，不同樣品連接特異性接頭用于區(qū)分。

聚合酶鏈式反應(pcr)在geneamp9700儀器(appliedbiosystems,usa)上進行，擴增體系為50μl，其中包含0.4μm正反引物、1μl模板dna、250nm核苷酸和1×fastpfubuffer的混合物。擴增條件如下：95℃預變性3min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；25個周期循環(huán)后，在72℃延伸5min。擴增后產物用axyprep^tmdnagelextractionkit(axygen,usa)試劑盒純化并定量。

測序數(shù)據(jù)下機后，去除數(shù)據(jù)中末端的接頭序列和引物序列，然后根據(jù)標簽序列將數(shù)據(jù)拆分為不同樣本數(shù)據(jù)，然后將拆分后所獲得的數(shù)據(jù)利用flash(version1.2.7)軟件(http://ccb.jhu.edu/software/flash/)對每個污泥樣數(shù)據(jù)進行重組裝拼接，拼接后所得到序列即為原始數(shù)據(jù)，將拼接后數(shù)據(jù)(tags)從連續(xù)低質量值(默認設定<＝10)堿基數(shù)達到設定長度(默認是5)的第1個低質量堿基位點截斷，過濾去除截取后得到的tags集合中長度小于平均長度的70％的數(shù)據(jù)，將以上過濾得到的序列與數(shù)據(jù)庫進行比對，去除其中的嵌合體序列，得到最終有效序列(effectivetags)用于后續(xù)分析。提取序列間相似率大于97％的非重復序列，借助mothur軟件(http://www.mothur.org/wiki/main_page)分析并生成分類操作單元(otu)；基于otus類型和數(shù)量等信息，采用rdp分類法將otu序列與silva數(shù)據(jù)庫(http://www.arb-silva.de)進行比對，找出最相近且可信度達80％以上的種屬信息。為了獲得每個otu系統(tǒng)發(fā)育分類學信息，將相似水平97％上每個otu中的所有序列進行一致性歸類分析，將同一個otu中的不同序列的最近祖先的種屬信息作為此otu的系統(tǒng)發(fā)育種屬信息。

實施例1

利用丙酸鈉在絮狀污泥中選擇性培養(yǎng)丙酸氧化菌及其互營共生菌群，步驟如下：

(1)在密閉的cstr反應器(有效容積為5l)中接種消化池底絮狀污泥，濃度為4gvss/l，加入bes溶液(bes相對污泥的使用濃度為5mmol/l)并攪拌混合均勻，培育4小時，加入50ml丙酸鈉和稀硝酸混合液(質量比為10:1，稀硝酸濃度為10wt％)，控制體系ph值為6.5，酸化培育12小時；而后以丙酸鈉為碳源，cod為2500mg/l，以硝酸鉀為氮源，由零開始，逐步提升基質中碳硝比(cod/no3^--n)并最終控制在121.47，在ph為6.8、溫度35℃、20r/min攪拌條件下連續(xù)培養(yǎng)富集14天。

(2)富集培養(yǎng)過程結束后，收集接種污泥和富集培養(yǎng)后污泥(5.0g濕重)，抽提基因組總dna并借助高通量測序技術對其16srdna片段測序，拼裝后以有效序列數(shù)據(jù)(effectivetags)表示其對應菌群中(otus)菌體個數(shù)。

表1為連續(xù)培養(yǎng)過程中，丙酸氧化菌群類型及其序列數(shù)量和比例。

表1丙酸氧化菌群類型及其序列數(shù)量和比例

由表1可知，通過本發(fā)明方法的富集培養(yǎng)，絮狀污泥中的丙酸氧化菌及其互營共生菌群以syntrophobacter和smithella為主，其數(shù)量(以序列數(shù)量計)在富集培養(yǎng)7天時，數(shù)量增加1.75倍，占全部菌群比例由接種時0.44％上升至1.21％，并隨培養(yǎng)時間繼續(xù)，其數(shù)量和菌群比例不斷上升，在富集培養(yǎng)14天時，菌群比例上升至2.4％，比初始接種污泥中增加4.5倍，實現(xiàn)了菌群培養(yǎng)富集。

富集培養(yǎng)后菌群用于丙酸降解效果的研究：

借助序批實驗開展富集培養(yǎng)前后絮狀污泥丙酸降解效果研究，其中，體系中有20g濕重絮狀污泥，150ml100mg/l丙酸溶液和1.0ml微量元素使用液，投加碳酸氫鈉控制體系ph為7.0，在35℃恒溫水浴槽中連續(xù)培養(yǎng)12小時，間隔不等時間取樣測定體系中丙酸含量；研究結果如圖2所示，由圖2可知，富集培養(yǎng)后絮狀污泥體系中丙酸降解速率明顯高于富集培養(yǎng)前，其體系總丙酸降解速率最大時為45.8mg/l·h，富集培養(yǎng)后體系中在8小時處，體系中殘留有約3.6mg/l丙酸，在12小時處，體系中丙酸被完全降解，而富集培養(yǎng)前體系中在12小時處，仍殘留有10.3mg/l丙酸。

實施例2

利用丙酸鈉在顆粒污泥中選擇性培養(yǎng)丙酸氧化菌及其互營共生菌群，步驟如下：

(1)在密閉的cstr反應器(有效容積為5l)中接種成熟厭氧顆粒污泥，濃度為5gvss/l，加入bes溶液(相對污泥的使用濃度為10mmol/l)并攪拌混合均勻，培育8小時后，加入100ml丙酸鈉和稀硝酸混合液(質量比為15:1，稀硝酸濃度為10wt％)，控制體系ph值為6.0，酸化培育18小時；而后以丙酸鈉為碳源，cod為4000mg/l，以硝酸鈉為氮源，由零開始，逐步提升基質碳硝比(cod/no3^--n)值并最終控制在15.18，在ph為6.8、溫度37℃、25r/min條件下連續(xù)培養(yǎng)富集15天。

(2)富集培養(yǎng)過程結束后，收集接種污泥和富集培養(yǎng)后污泥(5.0g濕重)，抽提基因組總dna并借助高通量測序技術對其16srdna片段測序，拼裝后以有效序列數(shù)據(jù)(effectivetags)表示其對應菌群中(otus)菌體個數(shù)。

表2為連續(xù)培養(yǎng)過程中，丙酸氧化菌群類型及其序列數(shù)量和比例。

表2丙酸氧化菌群類型及其序列數(shù)量和比例

由表2可知，通過本發(fā)明方法的富集培養(yǎng)，顆粒污泥中的丙酸氧化菌及其互營共生菌群以syntrophobacter和smithella為主，其數(shù)量(以序列數(shù)量計)在富集培養(yǎng)7天時，數(shù)量增加了0.31倍，占全部菌群比例由接種時1.02％上升至1.34％，并隨培養(yǎng)時間繼續(xù)，其數(shù)量和菌群比例不斷上升，在富集培養(yǎng)14天時，菌群比例上升至2.51％，比初始接種污泥中增加1.29倍，實現(xiàn)了菌群培養(yǎng)富集。

富集培養(yǎng)后菌群用于丙酸降解效果的研究：

借助序批實驗開展富集培養(yǎng)前后顆粒污泥丙酸降解效果的研究，其中體系中有20g濕重顆粒污泥，150ml300mg/l丙酸溶液和1.0ml微量元素使用液，投加碳酸氫鈉控制體系ph為7.0，在35℃恒溫水浴槽中連續(xù)培養(yǎng)12小時，間隔不等時間取樣測定體系中丙酸含量；由圖3可知，富集培養(yǎng)后顆粒污泥體系中丙酸降解速率明顯高于富集培養(yǎng)前，其體系總丙酸降解速率最大時為145.4mg/l·h，富集培養(yǎng)后體系中在8小時處，體系中殘留有約4.3mg/l丙酸，在12小時處，體系中丙酸為1.1mg/l，而富集培養(yǎng)前體系中在12小時處，仍殘留有15.2mg/l丙酸。

實施例3

不同基質cod/no3^--n值對培養(yǎng)富集丙酸氧化菌及其互營共生菌群的影響

與實施例2中相同，不同在于：以丙酸鈉為碳源，cod為4000mg/l，硝酸鈉投加濃度分別為32.94mg/l、100.01mg/l、263.53mg/l、500.05mg/l和800.01mg/l(cod/no3^--n值為121.47、40.00、15.18、8.00和5.00)條件下連續(xù)培養(yǎng)15天。高通量測試分析對應條件下丙酸氧化菌數(shù)量和比例，不同基質cod/no3^--n值條件下丙酸氧化菌群類型及其序列數(shù)量和比例如表3所示。

表3丙酸氧化菌群類型及其序列數(shù)量和比例

由表3可知，通過本發(fā)明方法的富集培養(yǎng)，不同基質碳氮比(cod/no3^--n)條件下顆粒污泥中的丙酸氧化菌及其互營共生菌群均以syntrophobacter和smithella為主，菌群序列數(shù)量和比例與基質碳氮比(cod/no3^--n)密切相關，不同基質碳氮比(cod/no3^--n)條件下連續(xù)富集培養(yǎng)后，其中丙酸氧化菌及其互營共生菌群序列數(shù)量和比例均有所上升，在碳氮比為121.47時，連續(xù)培養(yǎng)后體系中菌群比例由初始時1.02％上升至1.82％；隨著基質中碳氮比的提升，菌群比例也逐漸上升，在碳氮比為8.00基質中，連續(xù)培養(yǎng)富集后菌群比例為6.21％；在碳氮比條件5.00基質中，其菌群比例為5.96％，較碳氮比為8.00時略有下降，其富集效果依舊明顯。