本發(fā)明涉及一種提高酵母菌高溫乙醇發(fā)酵的方法，特別是一種提高庫德畢赤酵母高溫乙醇發(fā)酵的方法，屬于生物化工領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

酵母菌不僅是酒類等發(fā)酵食品釀造過程中不可或缺的微生物，而且在食品、醫(yī)藥、化工、能源等工業(yè)用乙醇的生產(chǎn)上也有廣泛的應(yīng)用。目前，利用酵母菌將糖蜜、木薯、纖維類廢棄物等原料轉(zhuǎn)化為乙醇，已成為乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的一條理想途徑，特別是利用纖維類廢棄物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇，有望替代傳統(tǒng)化石能源，緩解當(dāng)前人類社會(huì)面臨的能源危機(jī)。

酵母菌的最適發(fā)酵溫度為28-33℃，過高的溫度會(huì)明顯降低酵母菌的乙醇發(fā)酵性能。由于酵母發(fā)酵屬于放熱過程，為控制發(fā)酵溫度，需要引入冷卻設(shè)備，極大地增加發(fā)酵成本。如能提高酵母菌在高溫條件下的乙醇發(fā)酵性能，不僅可以省去傳統(tǒng)常溫發(fā)酵所需要的高昂冷卻設(shè)備費(fèi)用，降低發(fā)酵成本，而且可以更好的適應(yīng)纖維素酶解溫度(45-50℃)，有利于同步糖化發(fā)酵的進(jìn)行。因此，如何提高酵母菌高溫條件下的乙醇發(fā)酵性能成為當(dāng)前國內(nèi)外乙醇生產(chǎn)行業(yè)研究的熱點(diǎn)。

庫德畢赤酵母是一種多耐性酵母菌，能夠耐受高溫、高鹽、高濃度乙醇、高滲透壓、強(qiáng)酸等多種脅迫條件，可以適應(yīng)復(fù)雜的乙醇發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)境。該酵母菌在高溫條件下(34-42℃)具有良好的乙醇生產(chǎn)能力，然而當(dāng)發(fā)酵溫度超過44℃時(shí)，庫德畢赤酵母產(chǎn)乙醇的能力受到極大抑制。如能提高庫德畢赤酵母的高溫乙醇發(fā)酵性能，對(duì)于庫德畢赤酵母的乙醇發(fā)酵生產(chǎn)和工業(yè)化應(yīng)用將起到重要的推動(dòng)作用。然而，目前還沒有有效提高酵母菌特別是庫德畢赤酵母在高溫條件下發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種提高庫德畢赤酵母在高溫條件下發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，有利于降低發(fā)酵成本。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種提高庫德畢赤酵母高溫乙醇發(fā)酵的方法，包括以下步驟：

步驟一：配置液體培養(yǎng)基，加入終濃度為0.5～15％的鹽類物質(zhì)，慢慢升溫至其完全溶解，再用0.1mol/L的鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH至4.0～7.0，115℃滅菌20min；

步驟二：將活化的庫德畢赤酵母接種到步驟一所得的培養(yǎng)基中；控制搖瓶培養(yǎng)條件為：恒溫26～33℃，搖床轉(zhuǎn)速100～300rpm，接種量1～10％，培養(yǎng)時(shí)間12～50h；

步驟三：將步驟二獲得的庫德畢赤酵母培養(yǎng)液離心收集菌體，得到的庫德畢赤酵母在37～46℃下的乙醇產(chǎn)量明顯高于未經(jīng)處理的庫德畢赤酵母。

本發(fā)明步驟一所述的液體培養(yǎng)基可以是YEPD培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基或其他適合酵母菌生長的培養(yǎng)基。

本發(fā)明步驟一所述鹽類包括但不限于氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀、氯化鎂、硝酸鈉、硝酸鉀、醋酸鉀、氯化鈣中的一種或兩種以上的混合物。

步驟二中所述活化操作如下：將斜面保藏的庫德畢赤酵母接種到新鮮的斜面培養(yǎng)基上，26～33℃恒溫培養(yǎng)12～30h。所述斜面培養(yǎng)基為YEPD斜面培養(yǎng)基、麥芽汁斜面培養(yǎng)基或其他適合酵母菌生長的斜面培養(yǎng)基。

本發(fā)明步驟三所述的離心速度為3000～12000rpm。

本發(fā)明提供了一種簡單、安全、高效的提高庫德畢赤酵母高溫乙醇發(fā)酵的方法，本發(fā)明基于多脅迫交互保護(hù)作用原理，庫德畢赤酵母經(jīng)高濃度鹽脅迫后，細(xì)胞內(nèi)編碼抗氧化物酶、熱休克蛋白等應(yīng)對(duì)鹽脅迫的基因會(huì)大量表達(dá)，這些基因的表達(dá)對(duì)酵母高溫脅迫會(huì)產(chǎn)生一定保護(hù)作用，促使庫德畢赤酵母在高溫條件下活性提高，從而使庫德畢赤酵母獲得更強(qiáng)的高溫乙醇發(fā)酵能力。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

步驟一：配置麥芽汁液體培養(yǎng)基，加入醋酸鉀，控制終濃度為1％，慢慢升溫至其完全溶解，再用0.1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH至6.5，115℃滅菌20min。

步驟二：將斜面保藏的庫德畢赤酵母接種到新鮮的麥芽汁斜面培養(yǎng)基上，33℃恒溫培養(yǎng)24h。將活化的庫德畢赤酵母接種到步驟一所得的培養(yǎng)基中。控制搖瓶培養(yǎng)條件為：恒溫33℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，接種量2％，培養(yǎng)時(shí)間48h。

步驟三：將步驟二培養(yǎng)后的庫德畢赤酵母培養(yǎng)液離心收集菌體，控制離心速度為6000rpm。

將本實(shí)施例獲得的庫德畢赤酵母以終濃度為0.4g/L(干重)接種到含有100g/L葡萄糖的YEPD液體培養(yǎng)基中，恒溫40℃，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)24h，利用超高效液相色譜結(jié)合有機(jī)酸分析柱檢測發(fā)酵液乙醇含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其乙醇含量為39.2g/L。

對(duì)比試驗(yàn)：配置麥芽汁液體培養(yǎng)基，用0.1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH至6.5，115℃滅菌20min。將斜面保藏的庫德畢赤酵母接種到新鮮的麥芽汁斜面培養(yǎng)基上，33℃恒溫培養(yǎng)24h。將活化的庫德畢赤酵母接種到麥芽汁液體培養(yǎng)基中，控制搖瓶培養(yǎng)條件為：恒溫33℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，接種量2％，培養(yǎng)時(shí)間48h。將培養(yǎng)后的庫德畢赤酵母培養(yǎng)液離心收集菌體，控制離心速度為6000rpm。獲得的庫德畢赤酵母以終濃度為0.4g/L(干重)接種到含有100g/L葡萄糖的YEPD液體培養(yǎng)基中，恒溫40℃，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)24h，利用超高效液相色譜結(jié)合有機(jī)酸分析柱檢測發(fā)酵液乙醇含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其乙醇含量為32.7g/L。

結(jié)果表明，本實(shí)施例獲得的庫德畢赤酵母是未經(jīng)處理庫德畢赤酵母在相同條件下乙醇產(chǎn)量的1.2倍。

實(shí)施例2

步驟一：配置YEPD液體培養(yǎng)基，加入氯化鈉和氯化鉀，控制終濃度分別為2％和8％，慢慢升溫至其完全溶解，再用0.1mol/L的鹽酸溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH至5.0，115℃滅菌20min。

步驟二：將斜面保藏的庫德畢赤酵母接種到新鮮的YEPD斜面培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)18h。將活化的庫德畢赤酵母接種到步驟一所得的培養(yǎng)基中?？刂茡u瓶培養(yǎng)條件為：恒溫30℃，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，接種量8％，培養(yǎng)時(shí)間36h。

步驟三：將步驟二培養(yǎng)后的庫德畢赤酵母培養(yǎng)液離心收集菌體，控制離心速度為3000rpm。

將本實(shí)施例獲得的庫德畢赤酵母以終濃度為0.4g/L(干重)接種到含有100g/L葡萄糖的YEPD液體培養(yǎng)基中，恒溫45℃，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)24h，利用超高效液相色譜結(jié)合有機(jī)酸分析柱檢測發(fā)酵液乙醇含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其乙醇含量為21.8g/L。

對(duì)比試驗(yàn)：配置YEPD液體培養(yǎng)基，用0.1mol/L的鹽酸溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH至5.0，115℃滅菌20min。將斜面保藏的庫德畢赤酵母接種到新鮮的YEPD斜面培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)18h。將活化的庫德畢赤酵母接種到Y(jié)EPD液體培養(yǎng)基中，控制搖瓶培養(yǎng)條件為：恒溫30℃，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，接種量8％，培養(yǎng)時(shí)間36h。將培養(yǎng)后的庫德畢赤酵母培養(yǎng)液離心收集菌體，控制離心速度為3000rpm。獲得的庫德畢赤酵母以終濃度為0.4g/L(干重)接種到含有100g/L葡萄糖的YEPD液體培養(yǎng)基中，恒溫45℃，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)24h，利用超高效液相色譜結(jié)合有機(jī)酸分析柱檢測發(fā)酵液乙醇含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其乙醇含量為10.4g/L。

結(jié)果表明，本實(shí)施例獲得的庫德畢赤酵母是未經(jīng)處理庫德畢赤酵母在相同條件下乙醇產(chǎn)量的2.1倍。

實(shí)施例3

步驟一：配置麥芽汁液體培養(yǎng)基，加入氯化鎂，控制終濃度為8％，慢慢升溫至其完全溶解，再用0.1mol/L的鹽酸溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH至4.5，115℃滅菌20min。

步驟二：將斜面保藏的庫德畢赤酵母接種到新鮮的麥芽汁斜面培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)24h。將活化的庫德畢赤酵母接種到步驟一所得的培養(yǎng)基中?？刂茡u瓶培養(yǎng)條件為：恒溫28℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，接種量8％，培養(yǎng)時(shí)間24h。

步驟三：將步驟二培養(yǎng)后的庫德畢赤酵母培養(yǎng)液離心收集菌體，控制離心速度為10000rpm。

將本實(shí)施例獲得的庫德畢赤酵母以終濃度為0.4g/L(干重)接種到含有100g/L葡萄糖的YEPD液體培養(yǎng)基中，恒溫46℃，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)48h，利用超高效液相色譜結(jié)合有機(jī)酸分析柱檢測發(fā)酵液乙醇含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其乙醇含量為22.1g/L。

對(duì)比試驗(yàn)：配置麥芽汁液體培養(yǎng)基，用0.1mol/L的鹽酸溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH至4.5，115℃滅菌20min。將斜面保藏的庫德畢赤酵母接種到新鮮的麥芽汁斜面培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)24h。將活化的庫德畢赤酵母接種到麥芽汁液體培養(yǎng)基中，控制搖瓶培養(yǎng)條件為：恒溫28℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，接種量8％，培養(yǎng)時(shí)間24h。將培養(yǎng)后的庫德畢赤酵母培養(yǎng)液離心收集菌體，控制離心速度為10000rpm。獲得的庫德畢赤酵母以終濃度為0.4g/L(干重)接種到含有100g/L葡萄糖的YEPD液體培養(yǎng)基中，恒溫46℃，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)48h，利用超高效液相色譜結(jié)合有機(jī)酸分析柱檢測發(fā)酵液乙醇含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其乙醇含量為9.2g/L。

結(jié)果表明，本實(shí)施例獲得的庫德畢赤酵母是未經(jīng)處理庫德畢赤酵母在相同條件下乙醇產(chǎn)量的2.4倍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的部分實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。如步驟一中的鹽類物質(zhì)還可以選用硫酸鈉、硫酸鉀、硝酸鈉、硝酸鉀、氯化鈣等一種或兩種以上的混合物，其他的取值在技術(shù)方案列出的范圍內(nèi)均可；對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。