本發(fā)明屬于秸稈生物處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種秸稈降解酸化菌劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，社會(huì)對(duì)能源的需求越來(lái)越大，煤、石油等化石能源的過(guò)度開(kāi)發(fā)利用不僅帶來(lái)能源問(wèn)題，更是帶來(lái)大氣污染等諸多環(huán)境問(wèn)題，已嚴(yán)重影響人類(lèi)社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展。當(dāng)前，清潔能源、綠色能源已成為全人類(lèi)共同關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題和發(fā)展方向，沼氣作為一種清潔的可再生能源因其原料來(lái)源廣泛，易于產(chǎn)業(yè)化推廣等優(yōu)勢(shì)更是備受關(guān)注。
伴隨著農(nóng)業(yè)廢棄物的資源能源化，秸稈作為一種非常豐富的資源，我國(guó)每年秸稈產(chǎn)量達(dá)7億噸，相當(dāng)于3.5億噸標(biāo)準(zhǔn)煤。但目前我國(guó)農(nóng)作物秸稈的利用率低，如何充分利用這些資源而又使環(huán)境不受污染是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)面臨的難題。利用秸稈生產(chǎn)沼氣或生物天然氣，實(shí)現(xiàn)其資源化，將成為緩解當(dāng)今我國(guó)面臨的“糧食、能源、環(huán)境”三大危機(jī)的重要途徑之一。
秸稈的主要成分木質(zhì)纖維素是由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素之間通過(guò)復(fù)雜的化學(xué)鍵緊密結(jié)合而成，不易被沼氣發(fā)酵的微生物降解，致使發(fā)酵效率低下，在沼氣發(fā)酵之前將秸稈有效降解酸化成小分子糖類(lèi)和酸類(lèi)物質(zhì)，成為秸稈沼氣發(fā)酵的關(guān)鍵所在。
目前在文獻(xiàn)和專(zhuān)利中已有報(bào)道的復(fù)合菌劑在秸稈預(yù)處理生產(chǎn)沼氣中的應(yīng)用：中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利CN101948752A公開(kāi)了一種用于沼氣發(fā)酵的復(fù)合菌劑。它包含了纖維素?cái)M桿菌發(fā)酵液、巴氏芽孢梭菌發(fā)酵液、黑海甲烷袋狀菌發(fā)酵液及馬氏甲烷八疊球菌發(fā)酵液；該技術(shù)針對(duì)的是以牛糞為主要原料的沼氣發(fā)酵，與秸稈沼氣發(fā)酵存在不同。中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利CN106148224A 公開(kāi)了一種秸稈降解酸化菌劑及其制造方法，包含活性成分為產(chǎn)黃纖維單胞菌、產(chǎn)纖維二糖梭菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌的復(fù)合菌劑。其纖維素酶系組分不全、活性低，同時(shí)缺乏半纖維素降解酶嚴(yán)重影響秸稈原料的降解速率。中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利CN104531767A公開(kāi)了一種好氧酸化厭氧發(fā)酵秸稈產(chǎn)沼氣的生產(chǎn)工藝，利用兩相法生產(chǎn)秸稈沼氣，但對(duì)于水解相菌株構(gòu)成并未明確。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)秸稈沼氣兩相發(fā)酵的水解工藝，提供一種秸稈降解酸化菌劑，以提高秸稈酸化效率。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
一種秸稈降解酸化菌劑，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液，所述里氏木霉菌發(fā)酵液、綠色木霉菌發(fā)酵液、醋酸桿菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液的體積比為3:3:2:2。
優(yōu)選地，所述酸化菌劑中，所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)、所述綠色木霉菌(Trichodermaviride)、所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)和所述酵母菌的配比為：1~3U:100~300U:2×104～4×104CFU:1×104～2×104CFU。
優(yōu)選地，所述里氏木霉菌(Trichodermareesei) 發(fā)酵液的酶活力為100~300U/ml，所述綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液的酶活力為10000~30000U/ml，所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)的濃度為2×106～4×106CFU/ml，所述酵母菌的濃度為1×106～2×106CFU/ml。
一種秸稈降解酸化菌劑的制備方法，包括以下步驟：
步驟S1：分別制備里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液；
步驟S2：將所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液及酵母菌發(fā)酵液按體積比3:3:2:2混合，即得酸化菌劑。
優(yōu)選地，所述酸化菌劑中，所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)、所述綠色木霉菌(Trichodermaviride)、所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)和所述酵母菌的配比為：1~3U:100~300U:2×104～4×104CFU:1×104～2×104CFU。
優(yōu)選地，所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液的酶活力為100~300U/ml，所述綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液的酶活力為10000~30000U/ml，所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)的濃度為2×106～4×106CFU/ml，所述酵母菌的濃度為1×106～2×106CFU/ml。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：
1）本發(fā)明提供的秸稈降解酸化菌劑，是一種由里氏木霉菌、綠色木霉菌、醋酸桿菌和酵母菌復(fù)合而成的兼性厭氧分解菌劑。酸化過(guò)程中，由里氏木霉菌和綠色木霉菌產(chǎn)生的水解酶類(lèi)主要針對(duì)纖維素和半纖維素的分解，兩者協(xié)同在較短的時(shí)間(≤2天)內(nèi)，即可有效破壞木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)，并可以將纖維素和半纖維素分解成可利用的糖類(lèi)，提高木質(zhì)纖維素、纖維素和半纖維素的降解率；同時(shí)醋酸桿菌與酵母菌協(xié)同作用迅速將前述分解而成的可利用糖轉(zhuǎn)化為產(chǎn)甲烷菌可利用的乙酸、丁酸等小分子有機(jī)酸，大幅度加快整體秸稈沼氣發(fā)酵的產(chǎn)氣速率，顯著降低原料的水力停留時(shí)間。
2）本發(fā)明構(gòu)建的秸稈降解酸化菌劑具有以下優(yōu)勢(shì)：由里氏木霉及綠色木霉提供的纖維素、半纖維素水解酶酶系齊全，酶活力高，pH適用范圍廣，兩者協(xié)同能夠快速降解木質(zhì)纖維素類(lèi)原料。在微量曝氣條件下，小分子糖類(lèi)可迅速被醋酸桿菌及酵母菌協(xié)同利用并轉(zhuǎn)化為乙酸等小分子有機(jī)酸，且轉(zhuǎn)化得到的乙酸含量高，乙酸為產(chǎn)甲烷菌能夠有限利用的小分子有機(jī)酸，這樣有利于提高秸稈發(fā)酵產(chǎn)甲烷的產(chǎn)量。
3）本發(fā)明酸化菌劑應(yīng)用于秸稈降解，尤其是沼氣發(fā)酵工藝中秸稈的酸化降解，促進(jìn)秸稈快速酸化，提高酸化效率。實(shí)踐表明，本發(fā)明酸化菌劑可應(yīng)用于玉米、小麥、水稻等秸稈產(chǎn)沼氣發(fā)酵工藝中的酸化降解，能夠顯著提高纖維素、半纖維素的降解率和揮發(fā)性有機(jī)酸的含量，使纖維素的降解率達(dá)到25%以上，半纖維素的降解率達(dá)到25%以上，揮發(fā)性有機(jī)酸含量提高1倍以上。
具體實(shí)施方式
為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步清楚闡述本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。在下文的描述中，給出了大量具體的細(xì)節(jié)以便提供對(duì)本發(fā)明更為徹底的理解。然而，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的是，本發(fā)明可以無(wú)需一個(gè)或多個(gè)這些細(xì)節(jié)而得以實(shí)施。
本發(fā)明一種秸稈降解酸化菌劑，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液，所述里氏木霉菌發(fā)酵液、綠色木霉菌發(fā)酵液、醋酸桿菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液的體積比為3:3:2:2。
其中，里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液是由里氏木霉菌(Trichodermareesei)CGMCC No.9537經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液。其中，里氏木霉菌(Trichodermareesei)CGMCC No.9537已于2014年8月25日保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.9537。該菌種已在專(zhuān)利CN104328057A中公布。里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液的制備方法，參見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利CN104328057A中公開(kāi)的里氏木霉菌(Trichodermareesei)CGMCC No.9537的發(fā)酵培養(yǎng)方法，具體包括以下步驟：
①種子液制備：將里氏木霉菌(Trichodermareesei) CGMCC No.9537接入PDA斜面培養(yǎng)基，29℃，培養(yǎng)144h，待孢子鋪滿(mǎn)斜面，用無(wú)菌生理鹽水洗下孢子，配制成107個(gè)/mL的孢子懸浮液，以10%(v/v)的接種量接入液體種子培養(yǎng)基中，于29℃、180r/min條件下，培養(yǎng)24h，制備種子液；
②發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟①制備的種子液以8%(v/v)的接種量接入50L發(fā)酵罐(3000mL/5000mL的裝液量)中，接種后0~10h，通氣比1：0.6，攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)溫度30℃；10h之后，通氣比1：1.5，攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)溫度28℃；還原糖含量為0.3%以下時(shí)開(kāi)始進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料培養(yǎng)基的質(zhì)量配比組成為乳糖15%，玉米漿2%，硫酸銨0.6%，磷酸二氫鉀0.4%，硫酸鎂0.1%，氯化鈣0.05%，吐溫80 0.03%，微量元素0.2%，pH值為4.0，余量為水，其加入速率為240mL/h，溶氧量為40%(v/v)，發(fā)酵周期為6d，得到里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液；
其中，所述PDA斜面培養(yǎng)基的配方為：馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂15~20克、自來(lái)水1000毫升、自然PH。上述液體種子培養(yǎng)基和發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比組成均為微晶纖維素1%，乳糖2%，葡萄糖0.1%，玉米漿1%，酵母粉0.5%，硫酸銨0.2%，磷酸二氫鉀0.6%，氯化鈣0.05%，微量元素0.05%，pH值為4.5，余量為水。
綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液是由綠色木霉菌(Trichodermaviride)CGMCC No.5832經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液。綠色木霉菌(Trichodermaviride)CGMCC No.5832已于2012年3月2日保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.5832。該菌種已在專(zhuān)利CN105154414A中公布。綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液的制備方法，參閱中國(guó)專(zhuān)利CN105154414A中公開(kāi)的綠色木霉菌(Trichodermaviride)的發(fā)酵培養(yǎng)方法，具體包括以下步驟：
①菌種的制備及擴(kuò)大培養(yǎng)：將綠色木霉菌株(Trichoderma viride) CGMCC No.5832轉(zhuǎn)接至PDA斜面培養(yǎng)基上，30℃，培養(yǎng)7天，得到斜面孢子；然后用無(wú)菌水洗滌所述斜面孢子，得到孢子洗滌液；在無(wú)菌條件下將所述孢子洗滌液接入已滅菌的三角瓶種子培養(yǎng)基(121~124℃，滅菌30min)中，于220r/min，30℃條件下，培養(yǎng)18h，得活化菌種；將所述活化菌種以0.3體積%的接種量接入一級(jí)種子罐中，于30℃，通氣比1：0.6(v/v)的條件下，培養(yǎng)20h，得到一級(jí)種子液；將所述一級(jí)種子液以10體積%的接種量接入二級(jí)種子罐，于30℃，通氣比1： 0.6(v/v)的條件下，培養(yǎng)10h，得到二級(jí)種子液；
②補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)：在發(fā)酵罐F1中加入24000L發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(以質(zhì)量百分比計(jì)，葡萄糖3.0%，乳糖0.5%，玉米漿3.0%，硫酸銨0.6%，磷酸二氫鉀0.5%，硫酸鎂0.1%，氯化鈣0.05%，微量元素0.01%，余量為水)。調(diào)節(jié)pH值為4.5，于121~124℃，滅菌30min；待培養(yǎng)基溫度降至30℃，在無(wú)菌條件下，以發(fā)酵培養(yǎng)基體積的8%的接種量接入所述二級(jí)種子液，接種后0~8h，通氣比為1： 1.0，攪拌轉(zhuǎn)速為110r/min，培養(yǎng)溫度為30℃；接種8h以后，通氣比1：2.0，攪拌轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)溫度28℃；當(dāng)還原糖濃度在0.3重量%以下時(shí)，開(kāi)始連續(xù)流加補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料速率為每小時(shí)補(bǔ)料量為發(fā)酵液體積的的1.0%，當(dāng)發(fā)酵液體積達(dá)到發(fā)酵罐容積的70%時(shí)，將發(fā)酵罐F1中1/2體積的發(fā)酵液導(dǎo)入二級(jí)發(fā)酵罐F2，以與發(fā)酵罐F1相同的補(bǔ)料速率連續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)，剩余的1/2體積的發(fā)酵液繼續(xù)連續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)；待F1、F2的發(fā)酵液體積分別達(dá)到發(fā)酵罐容積的80%，以0.01/h稀釋率D向F1、F2流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，同時(shí)以與補(bǔ)料相同的速率，由F1、F2共同向下一級(jí)發(fā)酵罐F3連續(xù)輸出發(fā)酵醪液，待F3發(fā)酵液體積與F1、F2分別相等時(shí)，終止發(fā)酵，發(fā)酵周期為10天，得到綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液；
其中：所述PDA斜面培養(yǎng)基的配方為：馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂15~20克、自來(lái)水1000毫升、自然PH。所述三角瓶種子培養(yǎng)基、一級(jí)種子罐及二級(jí)種子罐的組成均為，以質(zhì)量百分比計(jì)，葡萄糖1.5%，硫酸銨0.4%，磷酸二氫鉀0.6%，玉米漿2%，余量為水。所述補(bǔ)料培養(yǎng)基組成為，玉米漿1.5%，硫酸銨0.7%，磷酸二氫鉀0.4%，硫酸鎂0.2%，氯化鈣0.2%，微量元素0.1%，其余為淀粉酸解液（葡萄糖含量16重量%），調(diào)節(jié)pH值為4.4，于121~124℃下滅菌30min；所述微量元素的組成為，以質(zhì)量百分比計(jì)，鉬酸銨0.04%，硫酸鋅0.2%，硫酸亞鐵0.3%，硫酸錳0.1%，氯化鈷0.15%，硫酸銅0.1%，余量為水；所述淀粉酸解液是通過(guò)如下制備方法獲得的：用0.4重量%的鹽酸溶液將淀粉配制成15重量%的淀粉漿，于115℃下酸解30min，酸解結(jié)束后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至4.5。
醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液是由醋酸桿菌(Acetobacter aceti) ATCC No.15973經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液。其中，醋酸桿菌(Acetobacter aceti) ATCC No.15973可通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)，例如：通過(guò)ATCC獲得該菌株。醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液通過(guò)下述制備方法獲得：將醋酸桿菌(Acetobacter aceti)ATCC No.15973接種于酵母粉-葡萄糖-乙醇培養(yǎng)基，所述酵母粉-葡萄糖-乙醇培養(yǎng)基的組成為：酵母粉1%，葡萄糖0.3%，無(wú)水乙醇8%，余量為水，在30℃條件下通風(fēng)培養(yǎng)1d，收集所有的發(fā)酵液。
酵母菌發(fā)酵液是由酒精酵母經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液。其中，所說(shuō)的酒精酵母可以是南陽(yáng)五號(hào)酵母菌1300，該南陽(yáng)五號(hào)酵母菌為我國(guó)酒精生產(chǎn)的常用酵母菌種，為公眾知曉并可通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)獲得。酵母菌發(fā)酵液通過(guò)如下制備方法獲得：將南陽(yáng)五號(hào)酵母菌接種于麥芽汁培養(yǎng)基中，在32℃條件下通風(fēng)培養(yǎng)1d，收集所有的發(fā)酵液。
將制備的上述里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌發(fā)酵液、酵母菌發(fā)酵液經(jīng)濃縮或稀釋后，按體積比為3:3:2:2，配置混合菌液，混合，即得酸化菌劑；并確保該酸化菌劑中各菌的配比如下：所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)、所述綠色木霉菌(Trichodermaviride)、所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)和所述酵母菌的配比為：1~3U:100~300U:2～4×104CFU:1～2×104CFU。更加優(yōu)選的是，上述酸化菌劑中，所述里氏木霉菌(Trichodermareesei) 發(fā)酵液的酶活力為100~300U/ml，所述綠色木霉菌(Trichodermaviride) 發(fā)酵液的酶活力為10000~30000U/ml，所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)的濃度為2×106～4×106CFU/ml，所述酵母菌的濃度為1×106～2×106CFU/ml。
上述秸稈降解酸化菌劑的使用方法，包括如下步驟：將秸稈粉碎為1~5cm的片段，在水解罐內(nèi)配制一定固形物含量的物料濃度，添加所述酸化菌劑，間歇曝氣同時(shí)低速攪拌，實(shí)現(xiàn)秸稈的快速降解。
實(shí)施例1
一種秸稈降解酸化菌劑，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和南陽(yáng)五號(hào)酵母菌發(fā)酵液，所述里氏木霉菌發(fā)酵液、綠色木霉菌發(fā)酵液、醋酸桿菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液的體積比為3:3:2:2。
所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液的酶活力為100U/ml，所述綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液的酶活力為30000U/ml，所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti) 的濃度為2×106CFU/ml，所述酵母菌的濃度為1×106CFU/ml。
所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)為里氏木霉菌(Trichodermareesei) CGMCC No.9537，所述綠色木霉菌(Trichodermaviride)為綠色木霉菌(Trichodermaviride) CGMCC No.5832，所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)為醋酸桿菌(Acetobacter aceti) ATCC No.15973，所述酵母菌為南陽(yáng)五號(hào)酵母菌。
上述秸稈降解酸化菌劑的制備方法，包括以下步驟：
步驟S1：分別參照上述方法制備里氏木霉菌(Trichodermareesei) CGMCC No.9537發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride) CGMCC No.5832發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti) ATCC No.15973發(fā)酵液和南陽(yáng)五號(hào)酵母菌發(fā)酵液；
步驟S2：將所述里氏木霉菌(Trichodermareesei) CGMCC No.9537發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride) CGMCC No.5832發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti) ATCC No.15973發(fā)酵液和南陽(yáng)五號(hào)酵母菌發(fā)酵液按體積比3:3:2:2混合，即得酸化菌劑。
實(shí)施例2
一種秸稈降解酸化菌劑，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和南陽(yáng)五號(hào)酵母菌發(fā)酵液，所述里氏木霉菌發(fā)酵液、綠色木霉菌發(fā)酵液、醋酸桿菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液的體積比為3:3:2:2。
所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液的酶活力為300U/ml，所述綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液的酶活力為10000U/ml，所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)的濃度為4×106CFU/ml，所述酵母菌的濃度為2×106CFU/ml。
本實(shí)施例秸稈降解酸化菌劑中各菌種類(lèi)及其制備方法參閱實(shí)施例1。
實(shí)施例3
一種秸稈降解酸化菌劑，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和南陽(yáng)五號(hào)酵母菌發(fā)酵液，所述里氏木霉菌發(fā)酵液、綠色木霉菌發(fā)酵液、醋酸桿菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液的體積比為3:3:2:2。
所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液的酶活力為150U/ml，所述綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液的酶活力為20000U/ml，所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)的濃度為3×106CFU/ml，所述酵母菌的濃度為1.5×106CFU/ml。
本實(shí)施例秸稈降解酸化菌劑中各菌種類(lèi)及其制備方法參閱實(shí)施例1。
實(shí)施例4
一種秸稈降解酸化菌劑，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和南陽(yáng)五號(hào)酵母菌發(fā)酵液，所述里氏木霉菌發(fā)酵液、綠色木霉菌發(fā)酵液、醋酸桿菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液的體積比為3:3:2:2。
所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液的酶活力為250U/ml，所述綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液的酶活力為26000U/ml，所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)的濃度為2.5×106CFU/ml，所述酵母菌的濃度為1×106CFU/ml。
本實(shí)施例秸稈降解酸化菌劑中各菌種類(lèi)及其制備方法參閱實(shí)施例1。
實(shí)施例5
一種秸稈降解酸化菌劑，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和南陽(yáng)五號(hào)酵母菌發(fā)酵液，所述里氏木霉菌發(fā)酵液、綠色木霉菌發(fā)酵液、醋酸桿菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液的體積比為3:3:2:2。
所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液的酶活力為200U/ml，所述綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液的酶活力為14000U/ml，所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)的濃度為3.5×106CFU/ml，所述酵母菌的濃度為1.5×106CFU/ml。
本實(shí)施例秸稈降解酸化菌劑中各菌種類(lèi)及其制備方法參閱實(shí)施例1。
對(duì)比例1
一種秸稈降解酸化菌劑，包括綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液，所述綠色木霉菌發(fā)酵液、醋酸桿菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液的體積比為3:2:2；各菌種類(lèi)、濃度及其制備方法同實(shí)施例3。
對(duì)比例2
一種秸稈降解酸化菌劑，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液，所述里氏木霉菌發(fā)酵液、醋酸桿菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液的體積比為3:2:2；各菌種類(lèi)、濃度及其制備方法同實(shí)施例3。
對(duì)比例3
一種秸稈降解酸化菌劑，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液，所述里氏木霉菌發(fā)酵液、綠色木霉菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液的體積比為3:3:2；各菌種類(lèi)、濃度及其制備方法同實(shí)施例3。
對(duì)比例4
一種秸稈降解酸化菌劑，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液和醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液，所述里氏木霉菌發(fā)酵液、綠色木霉菌發(fā)酵液和醋酸桿菌發(fā)酵液的體積比為3:3:2，各菌種類(lèi)、濃度及其制備方法同實(shí)施例3。
對(duì)比例5
一種秸稈降解酸化菌劑，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和南陽(yáng)五號(hào)酵母菌發(fā)酵液，所述里氏木霉菌發(fā)酵液、綠色木霉菌發(fā)酵液、醋酸桿菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液的體積比為1：1：1：1。各菌種類(lèi)、濃度及其制備方法同實(shí)施例3。
對(duì)比例6
一種秸稈降解酸化菌劑，包括產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)發(fā)酵液、產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和南陽(yáng)五號(hào)酵母菌發(fā)酵液；
其中，產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)保藏于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏號(hào)為ACCC No .00522。產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)發(fā)酵液的制備方法參閱公開(kāi)號(hào)為CN106148224 A的專(zhuān)利，具體為：將產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum) ACCC No .00522接種于蛋白胨纖維素培養(yǎng)液(PCS)改良培養(yǎng)基中，在室溫(30℃)條件下靜止培養(yǎng)1d，收集所有的發(fā)酵液；將經(jīng)活化的菌種發(fā)酵液接種于蛋白胨纖維素培養(yǎng)液(PCS)改良培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為30℃的發(fā)酵罐中靜止逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)大過(guò)程按5%的比例轉(zhuǎn)接，當(dāng)發(fā)酵液中的有效活菌數(shù)達(dá)到109個(gè)/mL時(shí)終止培養(yǎng)，得到產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum) ACCC No .00522發(fā)酵液；
產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)保藏于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏號(hào)為DSM No .11055；產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)發(fā)酵液的制備方法參閱公開(kāi)號(hào)為CN106148224 A的專(zhuān)利，具體為：將產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena) ACCC No. 11055接種于蛋白胨纖維素培養(yǎng)液(PCS)改良培養(yǎng)基中，在室溫(30℃)條件下靜止培養(yǎng)1d，收集所有的發(fā)酵液；將經(jīng)活化的菌種發(fā)酵液接種于蛋白胨纖維素培養(yǎng)液(PCS)改良培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為30℃的發(fā)酵罐中靜止逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)大過(guò)程按5%的比例轉(zhuǎn)接，當(dāng)發(fā)酵液中的有效活菌數(shù)達(dá)到109個(gè)/mL時(shí)終止培養(yǎng)，得到產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena) ACCC No .11055發(fā)酵液；
醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和南陽(yáng)五號(hào)酵母菌發(fā)酵液的制備方法參閱本發(fā)明上述記載的對(duì)應(yīng)方法，所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)的濃度為3×106CFU/ml，所述酵母菌的濃度為1.5×106CFU/ml。
該對(duì)比例秸稈降解酸化菌劑的制備方法，包括以下步驟：
步驟S1：分別參照上述方法制備產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)發(fā)酵液、產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和南陽(yáng)五號(hào)酵母菌發(fā)酵液；
步驟S2：將所述產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)發(fā)酵液、產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和南陽(yáng)五號(hào)酵母菌發(fā)酵液按體積比3:3:2:2混合，即得酸化菌劑。
實(shí)施例6 秸稈降解酸化菌劑應(yīng)用于玉米秸稈酸化處理
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在100L酸解罐中進(jìn)行，設(shè)計(jì)試驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組：
試驗(yàn)組：設(shè)置3組，使用實(shí)施例1~3制備的秸稈降解酸化菌劑；
對(duì)照組：設(shè)置6組，分別使用對(duì)比例1~6制備的秸稈降解酸化菌劑；
空白組：不添加任何菌劑。
實(shí)施方法：將玉米秸稈粉碎為2~3cm的片段，每立方米酸解體系接種秸稈降解酸化菌劑10公斤(酸化菌劑添加量為酸解罐裝料量的1%)，其余體積由自來(lái)水補(bǔ)充，水力停留時(shí)間為2天，連續(xù)運(yùn)行20天。每天進(jìn)料玉米秸稈3Kg(以干重計(jì))。檢測(cè)每天的纖維素、半纖維素和揮發(fā)性有機(jī)酸的含量，并計(jì)算降解率。其中，纖維素、半纖維素測(cè)定依據(jù)美國(guó)國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室(NREL)方法，揮發(fā)性有機(jī)酸的檢測(cè)方法參照Q/YZJ10-03-02-2000。
纖維素降解率＝已分解纖維素量×100%/總纖維素量，半纖維素降解率＝已分解半纖維素量×100%/總半纖維素量。
連續(xù)運(yùn)行10天后，使用菌劑的處理，經(jīng)過(guò)2天的預(yù)處理，玉米秸稈的纖維素降解率、半纖維素降解率和揮發(fā)性有機(jī)酸含量如表1所示。
表1 玉米秸稈的纖維素降解率、半纖維素降解率和揮發(fā)性有機(jī)酸含量
由表1可以看到，采用本發(fā)明實(shí)施例1~3秸稈降解酸化菌劑較空白組效果明顯，纖維素降解率提高2.4~2.9倍，半纖維素降解率提高2.6~3.2倍，揮發(fā)性有機(jī)酸含量提高1.0~1.3倍。對(duì)照組較空白組雖然在纖維素、半纖維素降解率及其揮發(fā)性有機(jī)酸含量方面均有所提高，但是較試驗(yàn)組仍然差異明顯。對(duì)照組中，對(duì)比例1~4制備的酸化菌劑用于降解玉米秸稈，所檢測(cè)玉米秸稈的纖維素降解率、半纖維素降解率及揮發(fā)性有機(jī)酸含量較試驗(yàn)組而言均有不同程度地明顯降低，可以看到本發(fā)明所使用酸化菌劑在玉米秸稈的降解過(guò)程中發(fā)揮了很好地協(xié)同作用，相互配合獲得顯著的降解效果。對(duì)比例5改變各菌種的有效含量，結(jié)果其對(duì)纖維素以及半纖維素的降解性能下降。對(duì)比例6采用已知的應(yīng)用于秸稈酸化菌劑制備的兩種菌替代本發(fā)明的兩種菌，發(fā)現(xiàn)其對(duì)纖維素、半纖維素的降解率雖然較空白組有所提高，但是與試驗(yàn)組結(jié)果相比，差異顯著。
實(shí)施例7 秸稈降解酸化菌劑應(yīng)用于小麥秸稈酸化處理
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)于100L酸解罐進(jìn)行，設(shè)計(jì)試驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組：
試驗(yàn)組：設(shè)置3組，使用實(shí)施例1~3制備的秸稈降解酸化菌劑；
對(duì)照組：設(shè)置6組，分別使用對(duì)比例1~6制備的秸稈降解酸化菌劑；
空白組：不添加任何菌劑。
實(shí)施方法：將小麥秸稈粉碎為1~2cm的片段，按每立方米酸解體系接種秸稈降解酸化菌劑10公斤(菌劑添加量為酸解罐裝料量的1%)，其余體積由自來(lái)水補(bǔ)充，水力停留時(shí)間為2天，連續(xù)運(yùn)行30天。每天進(jìn)料小麥秸稈3.5Kg(以干重計(jì))。檢測(cè)每天的纖維素、半纖維素和揮發(fā)性有機(jī)酸的含量，并計(jì)算降解率。
連續(xù)運(yùn)行15天后，使用菌劑的處理，經(jīng)過(guò)3天的預(yù)處理，小麥秸稈的纖維素降解率、半纖維素降解率和揮發(fā)性有機(jī)酸含量如表2所示。
表2 小麥秸稈的纖維素降解率、半纖維素降解率和揮發(fā)性有機(jī)酸含量
由表2可以看到，采用本發(fā)明實(shí)施例1~3秸稈降解酸化菌劑較空白組效果明顯，纖維素降解率提高2.1~2.5倍，半纖維素降解率提高1.6~2.1倍，揮發(fā)性有機(jī)酸含量提高1.3~1.7倍。對(duì)照組較空白組雖然在纖維素、半纖維素降解率及其揮發(fā)性有機(jī)酸含量方面均有所提高，但是較試驗(yàn)組仍然差異明顯。對(duì)照組中，對(duì)比例1~4制備的酸化菌劑用于降解小麥秸稈，所檢測(cè)小麥秸稈的纖維素降解率、半纖維素降解率及揮發(fā)性有機(jī)酸含量較試驗(yàn)組而言均有不同程度的降低，可以看到本發(fā)明所使用酸化菌劑在小麥秸稈的降解過(guò)程中發(fā)揮了很好地協(xié)同作用，相互配合獲得顯著的降解效果。對(duì)比例5改變各菌種的有效含量，結(jié)果其對(duì)小麥纖維素以及半纖維素的降解性能下降。對(duì)比例6采用已知的應(yīng)用于秸稈酸化菌劑制備的兩種菌替代本發(fā)明的兩種菌，發(fā)現(xiàn)其對(duì)小麥纖維素、半纖維素的降解率雖然較空白組有所提高，但是與試驗(yàn)組結(jié)果相比，差異顯著。
實(shí)施例8 秸稈降解酸化菌劑應(yīng)用于水稻秸稈酸化處理
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)于100m3酸解罐進(jìn)行，設(shè)計(jì)試驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組：
試驗(yàn)組：設(shè)置3組，使用實(shí)施例1~3制備的秸稈降解酸化菌劑；
對(duì)照組：設(shè)置6組，分別使用對(duì)比例1~6制備的秸稈降解酸化菌劑；
空白組：不添加任何菌劑。
實(shí)施方法：將水稻秸稈粉碎為4~5cm的片段，按每立方米酸解體系接種秸稈降解酸化菌劑10公斤(菌劑添加量為酸解罐裝料量的1%)，其余體積由自來(lái)水補(bǔ)充，水力停留時(shí)間為3天，連續(xù)運(yùn)行30天。每天進(jìn)料水稻秸稈300Kg(以干重計(jì))。檢測(cè)每天的纖維素、半纖維素和揮發(fā)性有機(jī)酸的含量，并計(jì)算降解率。
連續(xù)運(yùn)行15天后，使用菌劑的處理，經(jīng)過(guò)3天的預(yù)處理，水稻秸稈的纖維素降解率、半纖維素降解率和揮發(fā)性有機(jī)酸含量如表3所示。
表3 水稻秸稈的纖維素降解率、半纖維素降解率和揮發(fā)性有機(jī)酸含量
由表3可以看到，采用本發(fā)明實(shí)施例1~3秸稈降解酸化菌劑較空白組效果明顯，纖維素降解率提高2.0~2.5倍，半纖維素降解率提高1.7~1.9倍，揮發(fā)性有機(jī)酸含量提高1.2~1.4倍。對(duì)照組較空白組雖然在纖維素、半纖維素降解率及其揮發(fā)性有機(jī)酸含量方面均有所提高，但是較試驗(yàn)組仍然差異明顯。對(duì)照組中，對(duì)比例1~4制備的酸化菌劑用于降解水稻秸稈，所檢測(cè)水稻秸稈的纖維素降解率、半纖維素降解率及揮發(fā)性有機(jī)酸含量較試驗(yàn)組而言均有不同程度的降低，可以看到本發(fā)明所使用酸化菌劑在水稻秸稈的降解過(guò)程中發(fā)揮了很好地協(xié)同作用，相互配合獲得顯著的降解效果。對(duì)比例5改變各菌種的有效含量，結(jié)果其對(duì)水稻纖維素以及半纖維素的降解性能下降。對(duì)比例6采用已知的應(yīng)用于秸稈酸化菌劑制備的兩種菌替代本發(fā)明的兩種菌，發(fā)現(xiàn)其對(duì)水稻纖維素、半纖維素的降解率雖然較空白組有所提高，但是與試驗(yàn)組結(jié)果相比，差異顯著。
綜上可知，本發(fā)明秸稈酸化菌劑并非隨意搭配獲得，而且各菌種種類(lèi)及活性對(duì)所得酸化菌劑降解秸稈的效率均存在顯著的影響，相互協(xié)同增強(qiáng)秸稈水解酸化過(guò)程中纖維素和半纖維素的降解率以及揮發(fā)性有機(jī)酸含量，進(jìn)而提高甲烷的產(chǎn)量。
最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案所做的其他修改或者等同替換，只要不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。