本發(fā)明屬于生物分子檢測領域，涉及一種特異性標記家蠶微孢子蟲的核酸探針及其原位熒光雜交檢測方法。
背景技術：
：家蠶微孢子蟲(nosemabombycis，n.b)是家蠶微粒子病的病原，不僅能夠水平傳播，而且能夠經(jīng)卵垂直傳播感染后代家蠶，對生產(chǎn)危害巨大，是蠶種生產(chǎn)中的法定檢疫對象。由于n.b營專性細胞內(nèi)寄生，無法離體培養(yǎng)，且其孢子結構特殊，多數(shù)常規(guī)研究方法不能使用或尚未建立，因此其研究受到諸多技術限制，以致目前對其生活周期、侵染過程、致病機理等重要特征都尚不明確。目前生產(chǎn)上的蠶種檢測主要是顯微鏡檢母蛾和成品卵中具有折光性的n.b的孢子，而對非孢子時期的n.b則無法進行鏡檢檢查。家蠶微孢子蟲的生活周期大概分為三個階段，即感染期、裂殖增殖期、孢子增殖期。目前常用的家蠶微孢子蟲觀察方法主要有三種：一是利用dapi、dy96等染料對家蠶微孢子蟲的細胞核進行染色觀察，但此法只能顯示細胞核和幾丁質(zhì)成分，而不能顯示家蠶微孢子蟲的完整輪廓特征，并且其宿主的細胞核也會被同時標記，對觀察病原有一定的干擾；二是通過制備家蠶微孢子蟲的特異性抗體進行標記觀察，但此法耗時長、成本高、穩(wěn)定性差；三是利用掃描電鏡和透射電鏡技術對不同時期的家蠶微孢子蟲進行直接觀察，但該方法操作繁瑣、制樣難度大、難以長期頻繁使用。因此，研究和生產(chǎn)上需要建立一種更直觀、簡便、特異的方法來檢測家蠶微孢子蟲。熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,fish)是研究中常用的標記觀察技術。利用熒光標記的特異性rna或dna探針對細胞內(nèi)的核酸進行標記，能夠快速簡便的對不同物種不同時期的細胞進行特異性的觀察。此技術的關鍵是設計特異高效的標記探針，并有針對性地建立標記流程。然而，由于家蠶微孢子蟲前期研究基礎薄弱，缺乏充分的分子數(shù)據(jù)，及其結構特殊、無法離體培養(yǎng)的特征，以致尚未發(fā)明出家蠶微孢子蟲的fish標記方法。技術實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種能特異性標記家蠶微孢子蟲的核酸探針；本發(fā)明的目的之二提供在感染家蠶微孢子蟲的細胞中特異性地標記出家蠶微孢子蟲熒光核酸探針；本發(fā)明的目的之三是提供在感染家蠶微孢子蟲的細胞中特異性地標記出家蠶微孢子蟲的熒光原位雜交方法。為達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：1.一種特異性標記家蠶微孢子蟲的核酸探針，核酸探針序列如seqidno：1或seqidno：2所示。2.含有序列seqidno：1或seqidno：2的熒光探針，熒光探針由seqidno：1或seqidno：2和熒光染料組成，所述熒光染料結合在核酸探針的5’端或3’端。進一步，所述熒光染料為cy3、cy5、fitc、fam、alexafluor488或biotin。進一步，所述熒光染料為cy3。3.利用熒光探針特異性標記家蠶微孢子蟲的熒光原位雜交方法，熒光原位雜交方法為以下步驟：(1)用多聚甲醛對感染家蠶微孢子蟲的細胞進行固定，所述熒光探針用雜交液進行稀釋至終濃度為3～5ng/μl，于46℃進行雜交，雜交10～12小時，再用雜交清洗液清洗非特異性結合的探針，于48℃清洗1～4小時；(2)用100ng/μldapi對細胞的細胞核以及家蠶微孢子蟲的細胞核進行標記，室溫染色30min，pbs清洗，封片，再用熒光顯微鏡，選取相應的激發(fā)波長觀測熒光探針標記結果。進一步，所述細胞為家蠶胚胎細胞、家蠶卵巢細胞或草地貪夜蛾細胞。進一步，所述細胞為家蠶胚胎細胞。進一步，所述多聚甲醛的質(zhì)量濃度為4％；雜交液為含有900mmnacl,20mmtris,0.01％sds,ph值為7.5的水溶液；所述雜交清洗液為含有900mmnacl,20mmtris，0.01％sds,5mmedtaph值為7.5的水溶液。進一步，所述pbs清洗是用pbs清洗1～5次，每次5～10分鐘。本發(fā)明的有益效果在于：1、特異性高：本發(fā)明提出的家蠶微孢子蟲的特異性rdna探針與家蠶微孢子蟲結合靈敏度高，進一步結合熒光素做成的熒光探針比較使用抗體的熒光標記方法具有更高的特異性。2、操作簡便：比較使用抗體的熒光標記，本發(fā)明提出在感染家蠶微孢子蟲的細胞中特異性地標記出家蠶微孢子蟲的熒光原位雜交方法操作更加簡單方便，結果更直觀可靠。3、靈敏有效：生產(chǎn)上蠶種檢疫使用的母蛾鏡檢方法只能觀察到成熟孢子，無法發(fā)現(xiàn)處于裂殖體等階段的病原體，本發(fā)明提出利用含有seqidno：1或seqidno：2的熒光探針標記出家蠶微孢子蟲的熒光原位雜交方法能夠標記除成熟孢子以外的各發(fā)育階段的病原，因此具有更高的靈敏性。附圖說明為了使本發(fā)明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進行說明：圖1為n.b感染bme細胞后42h，熒光探針nblsu-1標記未成熟家蠶微孢子蟲；圖2為n.b感染bme細胞后45h，熒光探針nblsu-1標記未成熟家蠶微孢子蟲；圖3為n.b感染bme細胞后42h，熒光探針nblsu-v1標記未成熟家蠶微孢子蟲；圖4為n.b感染bme細胞后60h，熒光探針nblsu-v1標記未成熟家蠶微孢子蟲；其中各附圖，圖a中大箭頭代表dapi染的bme細胞的細胞核，小箭頭表示未成熟家蠶微孢子蟲的細胞核，五角星標注的為成熟家蠶微孢子蟲的細胞核，以上細胞核均為淺藍色顯示；圖b中箭頭所示為探針標記的家蠶n.b核糖體rna，為紅色熒光顯示；圖c是白光下的圖，箭頭所示為未成熟家蠶微孢子蟲；圖d是將圖abc疊加的圖，箭頭所示為熒光疊加的區(qū)域。具體實施方式下面將結合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件。實施例1探針設計根據(jù)n.b核糖體rna大亞基(lsurrna)的dna序列及其二級結構模型，結合fish探針要求進行fish探針的設計篩選。本技術方案所設計的核酸探針能特異性地結合細胞核外的核糖體rna，一般的探針只能結合細胞核內(nèi)的dna而無法達到區(qū)分不同時期家蠶微孢子蟲的目的。fish探針要求為：長度為18nt左右，tm值為48-60℃，如果tm值大于60℃或者小于48℃，可以適當調(diào)整探針的長度。根據(jù)上述原則，設計了兩條核酸探針，其序列如下所示：表一特異性標記家蠶微孢子蟲的核酸探針序列號名稱序列seqidno：1nblsu-v1gcaatcgtactctacattgseqidno：2nblsu-1gaacattaggtttctatcct以上家蠶微孢子蟲核酸探針可根據(jù)需要偶聯(lián)不同的熒光標記物，如：cy3、cy5、fitc、fam、alexafluor488或biotin，熒光標記物可結合在3’端或5’端。本實施例是將設計好的探針序列送至公司合成偶聯(lián)cy3紅色熒光標記的探針，結合在序列5’端，其序列如下：表二特異性標記家蠶微孢子蟲的熒光探針名稱序列nblsu-v1-cy3cy3-gcaatcgtactctacattgnblsu-1-cy3cy3-gaacattaggtttctatcct實施例2nblsu-1-cy3原位雜交實驗的方法和結果1)感染n.b的家蠶bme細胞的制備將正常的家蠶胚胎細胞(bme)計數(shù)，按1x106次方爬片(直徑20mm)，同時，在無菌條件下，取感染家蠶微孢子蟲(nosemabombycis，n.b)的蠶蛹血液，對其中的n.b孢子進行計數(shù)，計數(shù)后以n.b:細胞＝10：1的比例感染bme細胞，感染6小時后換液。2)家蠶bme細胞內(nèi)雜交n.b的fish探針標記在n.b感染bme細胞后45小時，用4％多聚甲醛對bme細胞進行固定，用雜交液(900mmnacl，20mmtris[ph7.5]，0.01％sds)對nblsu-1-cy3探針進行稀釋，至終濃度為5ng/μl，于46℃進行雜交，雜交12h。雜交結束后，利用雜交清洗液(900mmnacl,20mmtris[ph7.5],0.01％sds,5mmedta)清洗非特異性結合的探針，于48℃清洗1h。3)細胞核的dapi標記雜交結束后，為了排除熒光信號的假陽性，利用100ng/μl4',6-二脒基-2-苯基吲哚，簡稱dapi對bme細胞的細胞核以及家蠶微孢子蟲的細胞核進行標記，18～25℃染色30min，pbs清洗3次，每次5分鐘，封片。4)fish結果的觀察利用激光共聚焦熒光顯微鏡，選取合適的激發(fā)波長觀察探針標記結果。圖1為n.b感染bme細胞后42h，熒光探針nblsu-1，也記為nblsu-1-cy3探針，標記未成熟家蠶微孢子蟲；如圖1所示，圖a為dapi染色的細胞核，其中大箭頭代表dapi染色的bme細胞的細胞核，小箭頭表示未成熟家蠶微孢子蟲的細胞核，五角星標注的為成熟家蠶微孢子蟲的細胞核，以上細胞核均為淺藍色顯示；圖b為熒光探針nblsu-1標記的家蠶n.b核糖體rna，為紅色熒光顯示，圖中細胞形態(tài)、細胞外的孢子形態(tài)清晰可見，幾乎所有的孢子都能被dapi給染色標記上，然而只有無特定形態(tài)、核不規(guī)則的裂殖體時期的病原體可以被核酸熒光探針標記上，表明熒光探針nblsu-1可以特異的標記未成熟病原體；圖c是白光下的圖，箭頭所示為未成熟家蠶微孢子蟲；圖d是將圖abc疊加的圖，箭頭所示為熒光疊加的區(qū)域。圖2為n.b感染bme細胞后45h，探針nblsu-1-cy3標記未成熟家蠶微孢子蟲；如圖2所示，nblsu-1-cy3探針標記的紅色熒光較分散，形態(tài)逐漸接近成熟的家蠶微孢子蟲，比成熟孢子大，由于原生質(zhì)膜的逐漸增厚，使得能夠在肉眼下觀察到輕微的輪廓，但仍然不是太清晰，表明探針nblsu-1-cy3可以特異的標記細胞中的正在成熟家蠶微孢子蟲。實施例3nblsu-v1-cy3原位雜交實驗的方法和結果1)感染n.b的家蠶bme細胞的制備將正常的家蠶胚胎細胞(bme)計數(shù)，按1x106次方爬片(直徑20mm)，同時，在無菌條件下，取感染家蠶微孢子蟲(nosemabombycis，n.b)的蠶蛹血液，對其中的n.b孢子進行計數(shù)，計數(shù)后以n.b:細胞＝10：1的比例感染bme細胞，感染6小時后換液。2)家蠶bme細胞內(nèi)雜交n.b的fish探針標記在n.b感染bme細胞后45小時，用4％多聚甲醛對bme細胞進行固定，用雜交液(900mmnacl，20mmtris[ph7.5]，0.01％sds)對nblsu-v1-cy3探針進行稀釋，至終濃度為5ng/μl，于46℃進行雜交，雜交12h。雜交結束后，利用雜交清洗液(900mmnacl,20mmtris[ph7.5],0.01％sds,5mmedta)清洗非特異性結合的探針，于48℃清洗2h。3)細胞核的dapi標記雜交結束后，為了排除熒光信號的假陽性，利用100ng/μl4',6-二脒基-2-苯基吲哚，簡稱dapi對bme細胞的細胞核以及家蠶微孢子蟲的細胞核進行標記，室溫染色30min，pbs清洗3次，每次5分鐘，封片。4)fish結果的觀察利用激光共聚焦熒光顯微鏡，選取合適的激發(fā)波長觀察探針標記結果。圖3為n.b感染bme細胞后42h，熒光探針nblsu-v1，也記為nblsu-v1-cy3探針，標記未成熟家蠶微孢子蟲；如圖3所示，被fish探針標記上的家蠶微孢子蟲大小和成熟的微孢子基本一致，外圍的孢壁輪廓清晰可見，整個細胞充滿了家蠶微孢子蟲。表明熒光探針nblsu-v1可以特異的標記細胞中的正在成熟家蠶微孢子蟲。圖4為n.b感染bme細胞后60h，熒光探針nblsu-v1標記未成熟家蠶微孢子蟲；如圖4所示，fish探針標記的病原體逐漸變小，同時宿主細胞內(nèi)成熟孢子增多，熒光探針nblsu-v1可以特異的標記細胞中的正在成熟家蠶微孢子蟲。最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權利要求書所限定的范圍。sequencelisting<110>西南大學<120>一種特異性標記家蠶微孢子蟲的核酸探針及其原位熒光雜交檢測方法<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<400>1gcaatcgtactctacattg19<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2gaacattaggtttctatcct20當前第1頁12