本發(fā)明屬于熒光定量pcr領(lǐng)域，具體涉及一種多重?zé)晒鈖cr法聯(lián)合檢測(cè)呼吸道病原體的試劑盒。

背景技術(shù)：

急性呼吸道感染有較高的發(fā)病率和死亡率，特別是下呼吸道感染造成極大的疾病負(fù)擔(dān)，全球有20%的學(xué)齡前兒童死于下呼吸道感染（sari），90%的死亡病例歸因于肺炎。肺炎或急性肺炎是發(fā)熱呼吸道癥侯群的主要感染形式，也是造成兒童發(fā)病和死亡的主要原因。

1歲以內(nèi)兒童肺炎發(fā)病率為0.01~0.68次/人年，5歲以內(nèi)兒童肺炎發(fā)病率為0.14~0.66次/人年；肺炎死亡率在1歲以下兒童為485/10萬~890/10萬，5歲以下兒童為184/10萬~1223/10萬。（數(shù)據(jù)來源參考“中國(guó)大陸肺炎發(fā)病率與死亡率”）。

現(xiàn)階段臨床上對(duì)呼吸道病原體主要通過臨床癥狀、分離培養(yǎng)及免疫檢測(cè)等常規(guī)手段進(jìn)行診斷及病原體排查。分離培養(yǎng)耗時(shí)耗力，需要嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、通常需要3天才能確診；而免疫檢測(cè)靈敏度低，且存在“窗口期”，感染后3~7天才能檢測(cè)出相應(yīng)的抗原或抗體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種多重?zé)晒鈖cr法聯(lián)合檢測(cè)呼吸道病原體的試劑盒，主要采取多重實(shí)時(shí)熒光pcr法對(duì)呼吸道病原體進(jìn)行檢測(cè)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明在一個(gè)試劑盒內(nèi)包含常見的11種呼吸道病原體檢測(cè)（甲型流感病毒通用型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒的1/2/3型、腺病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體、嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、a族鏈球菌），通過3個(gè)反應(yīng)緩沖液進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)緩沖液包含四個(gè)熒光通道，能夠排查臨床上90%的病原體感染。

所述試劑盒包括如下；反應(yīng)液a包含甲型流感特異性引物及探針、乙型流感特異性引物及探針、腺病毒特異性引物及探針、呼吸道合胞病毒特異性引物及探針；

反應(yīng)液b包含肺炎支原體特異性引物及探針、肺炎衣原體特異性引物及探針、副流感病毒特異性引物及探針、內(nèi)控特異性引物及探針；

反應(yīng)液c包含嗜肺軍團(tuán)菌特異性引物及探針、肺炎鏈球菌特異性引物及探針、流感嗜血桿菌特異性引物及探針、a族鏈球菌特異性引物及探針；

酶混合液包含熱啟動(dòng)taq酶及m-mlv酶；

陽性對(duì)照包含特異性質(zhì)粒及te水；

陰性對(duì)照包含te水。

引物探針序列：

試劑組分配方：

反應(yīng)液a配方：tris（ph8.8）20mmol/l，kcl60mmol/l，mgcl22.5mmol/l，edta·2na0.1mmol/l，1%dmso，datp200μmol/l，dgtp200μmol/l，dctp200μmol/l，dttp200μmol/l，甲型流感病毒上游引物417nmol/l，甲型流感病毒下游引物417nmol/l，甲型流感病毒探針125nmol/l，乙型流感病毒上游引物417nmol/l，乙型流感病毒下游引物417nmol/l，乙型流感病毒探針125nmol/l，腺病毒上游引物417nmol/l，腺病毒下游引物417nmol/l，腺病毒探針125nmol/l，呼吸道合胞病毒上游引物417nmol/l，呼吸道合胞病毒下游引物417nmol/l，呼吸道合胞病毒探針125nmol/l。

反應(yīng)液b配方：tris（ph8.8）20mmol/l，kcl60mmol/l，mgcl22.5mmol/l，edta·2na0.1mmol/l，1%dmso，datp200μmol/l，dgtp200μmol/l，dctp200μmol/l，dttp200μmol/l，肺炎支原體上游引物417nmol/l，肺炎支原體下游引物417nmol/l，肺炎支原體探針125nmol/l，肺炎衣原體上游引物417nmol/l，肺炎衣原體下游引物417nmol/l，肺炎衣原體探針125nmol/l，副流感病毒上游引物417nmol/l，副流感病毒下游引物417nmol/l，副流感病毒探針125nmol/l，內(nèi)控上游引物417nmol/l，內(nèi)控下游引物417nmol/l，內(nèi)控探針125nmol/l。

反應(yīng)液c配方：tris（ph8.8）20mmol/l，kcl60mmol/l，mgcl22.5mmol/l，edta·2na0.1mmol/l，1%dmso，datp200μmol/l，dgtp200μmol/l，dctp200μmol/l，dttp200μmol/l，肺炎鏈球菌上游引物417nmol/l，肺炎鏈球菌下游引物417nmol/l，肺炎鏈球菌探針125nmol/l，嗜肺軍團(tuán)菌上游引物417nmol/l，嗜肺軍團(tuán)菌下游引物417nmol/l，嗜肺軍團(tuán)菌探針125nmol/l，a族鏈球菌上游引物417nmol/l，a族鏈球菌下游引物417nmol/l，a族鏈球菌探針125nmol/l，流感嗜血桿菌上游引物417nmol/l，流感嗜血桿菌下游引物417nmol/l，流感嗜血桿菌探針125nmol/l。

酶混合液配方：taq酶4u/μl，m-mlv酶10u/μl。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)為1、靈敏度達(dá)到500copies/ml；2、擴(kuò)增完后直接得到結(jié)果，無需后續(xù)操作，獲得樣本后3小時(shí)就能得到結(jié)果；3、無窗口期，一經(jīng)感染就能檢測(cè)出來。

發(fā)明的有益效果：1、提高檢測(cè)靈敏度，增加檢出率，縮短患者的病程；2、明確病因，提高用藥準(zhǔn)確率，避免濫用藥物；3、減少手工操作，縮短檢測(cè)流程，降低檢測(cè)成本。

附圖說明

圖1反應(yīng)液a特異性結(jié)果圖。

圖2反應(yīng)液b特異性結(jié)果圖。

圖3反應(yīng)液c特異性結(jié)果圖。

圖4反應(yīng)液a線性靈敏度結(jié)果圖。

圖5反應(yīng)液b線性靈敏度結(jié)果圖。

圖6反應(yīng)液c線性靈敏度結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1、反應(yīng)液的配制

（1）反應(yīng)液a的配制

取10ml容量瓶，分別加入0.5mol/ltrizma^?hcl64μl，0.5mol/ltrizma^?base336μl，1mol/lmgcl225μl，1mol/lkcl600μl，0.5mol/ledta·2na2μl，dmso100μl，dntps90μl，50μmol/l的甲型流感病毒上下游引物各83.4μl，50μmol/l甲型流感病毒探針25μl，50μmol/l的乙型流感病毒上下游引物各83.4μl，50μmol/l乙型流感病毒探針25μl，50μmol/l的腺病毒上下游引物各83.4μl，50μmol/l腺病毒探針25μl，50μmol/l的呼吸道合胞病毒上下游引物各83.4μl，50μmol/l呼吸道合胞病毒探針25μl。用雙重蒸餾水補(bǔ)足體積到10ml，翻轉(zhuǎn)使之充分混勻，將液體轉(zhuǎn)移到10ml燒杯中，按1ml/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）反應(yīng)液b的配制

取10ml容量瓶，分別加入0.5mol/ltrizma^?hcl64μl，0.5mol/ltrizma^?base336μl，1mol/lmgcl225μl，1mol/lkcl600μl，0.5mol/ledta·2na2μl，dmso100μl，dntps90μl，50μmol/l的肺炎支原體上下游引物各83.4μl，50μmol/l肺炎支原體探針25μl，50μmol/l的肺炎衣原體上下游引物各83.4μl，50μmol/l肺炎衣原體探針25μl，50μmol/l的副流感病毒上下游引物各83.4μl，50μmol/l副流感病毒探針25μl，50μmol/l的內(nèi)控上下游引物各83.4μl，50μmol/l內(nèi)控探針25μl。用雙重蒸餾水補(bǔ)足體積到10ml，翻轉(zhuǎn)使之充分混勻，將液體轉(zhuǎn)移到10ml燒杯中，按1ml/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）反應(yīng)液c的配制

取10ml容量瓶，分別加入0.5mol/ltrizma^?hcl64μl，0.5mol/ltrizma^?base336μl，1mol/lmgcl225μl，1mol/lkcl600μl，0.5mol/ledta·2na2μl，dmso100μl，dntps90μl，50μmol/l的肺炎鏈球菌上下游引物各83.4μl，50μmol/l肺炎鏈球菌探針25μl，50μmol/l的嗜肺軍團(tuán)菌上下游引物各83.4μl，50μmol/l嗜肺軍團(tuán)菌探針25μl，50μmol/l的a族鏈球菌上下游引物各83.4μl，50μmol/la族鏈球菌探針25μl，50μmol/l的流感嗜血桿菌上下游引物各83.4μl，50μmol/l流感嗜血桿菌探針25μl。用雙重蒸餾水補(bǔ)足體積到10ml，翻轉(zhuǎn)使之充分混勻，將液體轉(zhuǎn)移到10ml燒杯中，按1ml/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（4）酶混合液的配制

取10ml容量瓶，分別加入10000u/ml的taq酶4ml，25000u/ml的m-mlv酶4ml。用雙重蒸餾水補(bǔ)足體積到10ml，翻轉(zhuǎn)使之充分混勻，將液體轉(zhuǎn)移到10ml燒杯中，按100μl/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（5）陰性對(duì)照的配制

取100ml容量瓶，加入生理鹽水定容至100ml，將液體轉(zhuǎn)移到10ml燒杯中，按500μl/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（6）陽性對(duì)照的配制（濃度為5.0×10³copies/ml）

取100ml容量瓶，分別加入5.0×10⁷copies/ml甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體、副流感病毒、肺炎鏈球菌、嗜肺軍團(tuán)菌、a族鏈球菌和流感嗜血桿菌質(zhì)粒（各質(zhì)粒委托通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成）各10μl。用生理鹽水定容至100ml，將液體轉(zhuǎn)移到100ml燒杯中，按500μl/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、核酸提取

采用已備案的核酸提取試劑盒進(jìn)行核酸提取，提取后用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)核酸純度，其od260/od280應(yīng)在1.6~2.0之間。

3、加樣上機(jī)

（1）反應(yīng)混合物配制

取出反應(yīng)液a、反應(yīng)液b、反應(yīng)液c、酶混合液室溫放置，使其充分溶解，配制反應(yīng)混合物（每測(cè)試配置體系：29.5μl反應(yīng)液+0.5μl酶混合液），按照需要計(jì)算好試劑用量，充分混合均勻后，3000-5000g離心5秒。

（2）加樣

取0.2ml擴(kuò)增管或者八聯(lián)管，加入30μl配制好的反應(yīng)混合物，然后將提取好的樣本取2μl加入擴(kuò)增管或八聯(lián)管，蓋好蓋子，稍微離心后置入熒光pcr擴(kuò)增儀內(nèi)。

（3）上機(jī)檢測(cè)

1）循環(huán)條件設(shè)置

38℃5分鐘，95℃10分鐘；進(jìn)入以下循環(huán)：95℃15秒，58℃40秒（檢測(cè)信號(hào)），40循環(huán)；25℃30秒。

2）儀器檢測(cè)通道選擇

熒光素設(shè)定為fam、rox、hex和cy5。

4、結(jié)果判斷

（1）陰性對(duì)照應(yīng)無ct值或者為0；陽性對(duì)照ct值應(yīng)≤36；反應(yīng)液b中cy5通道ct值應(yīng)≤36；

（2）樣本測(cè)試結(jié)果應(yīng)以下表判斷

實(shí)施例2

1、試劑特異性驗(yàn)證

（1）實(shí)驗(yàn)樣本

采取10份特異性樣本對(duì)試劑的特異性進(jìn)行驗(yàn)證，其中4份為生理鹽水、1份為人偏肺病毒樣本、1份為風(fēng)疹病毒樣本、1份為麻疹病毒樣本、1份為肺炎克雷伯氏菌樣本、1份為大腸桿菌樣本、1份為金黃色葡萄球菌樣本。

（2）實(shí)驗(yàn)過程

用反應(yīng)液a、反應(yīng)液b、反應(yīng)液c、分別檢測(cè)以上10份特異性樣本，分析檢測(cè)結(jié)果，驗(yàn)證試劑的特異性。

（3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

三種反應(yīng)液檢測(cè)10份特異性樣本皆為陰性，表明試劑特異性好，無交叉反應(yīng)情況。具體結(jié)果見下表：

反應(yīng)液a特異性檢測(cè)結(jié)果

反應(yīng)液b特異性檢測(cè)結(jié)果

反應(yīng)液c特異性檢測(cè)結(jié)果

2、試劑精密性驗(yàn)證

（1）實(shí)驗(yàn)樣本

采取1份精密性樣本（濃度為5.0×10³copies/ml）對(duì)試劑的精密性進(jìn)行驗(yàn)證，樣本配制方法為取100ml容量瓶，分別加入5.0×10⁷copies/ml甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體、副流感病毒、內(nèi)控、肺炎鏈球菌、嗜肺軍團(tuán)菌、a族鏈球菌和流感嗜血桿菌質(zhì)粒各10μl，用生理鹽水定容至100ml。

（2）實(shí)驗(yàn)過程

用反應(yīng)液a、反應(yīng)液b、反應(yīng)液c、分別重復(fù)檢測(cè)以上精密性樣本10次，分析檢測(cè)結(jié)果，驗(yàn)證試劑的精密性。

（3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

三種反應(yīng)液檢測(cè)精密性樣本批內(nèi)變異系數(shù)（cv值）均＜5%，表明試劑重復(fù)性好。具體結(jié)果見下表：

反應(yīng)液a精密性檢測(cè)結(jié)果

反應(yīng)液b精密性檢測(cè)結(jié)果

反應(yīng)液c精密性檢測(cè)結(jié)果

3、試劑最低檢測(cè)限驗(yàn)證

（1）實(shí)驗(yàn)樣本

采取1份最低檢測(cè)限樣本（濃度為5.0×10²copies/ml）對(duì)試劑的最低檢測(cè)限進(jìn)行驗(yàn)證，樣本配制方法為取100ml容量瓶，分別加入5.0×10³copies/ml的精密性樣本10ml，用生理鹽水定容至100ml。

（2）實(shí)驗(yàn)過程

用反應(yīng)液a、反應(yīng)液b、反應(yīng)液c、分別重復(fù)檢測(cè)以上最低檢測(cè)限樣本10次，分析檢測(cè)結(jié)果，驗(yàn)證試劑的最低檢測(cè)限。

（3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

三種反應(yīng)液檢測(cè)最低檢測(cè)限樣本均為陽性，試劑的最低檢測(cè)限為5.0×10²copies/ml。具體結(jié)果見下表：

4、試劑線性靈敏度驗(yàn)證

（1）實(shí)驗(yàn)樣本

采取8份線型靈敏度樣本（濃度分別為5.0×10⁸copies/ml、5.0×10⁷copies/ml、5.0×10⁶copies/ml、5.0×10⁵copies/ml、5.0×10⁴copies/ml、5.0×10³copies/ml、5.0×10²copies/ml、5.0×10¹copies/ml、）對(duì)試劑的線性進(jìn)行驗(yàn)證。

（2）實(shí)驗(yàn)過程

用反應(yīng)液a、反應(yīng)液b、反應(yīng)液c、分別檢測(cè)以上線性樣本，分析檢測(cè)結(jié)果，驗(yàn)證試劑的線性靈敏度。

（3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

三種反應(yīng)液檢測(cè)線型靈敏度樣本均為陽性，試劑的線性良好。具體結(jié)果見下圖4-6.

實(shí)施例3：檢測(cè)120臨床樣本的結(jié)果

1、按照實(shí)施例1所示的配制方法，配制試劑盒相關(guān)組分，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、武漢市婦幼保健院收集了120例具有臨床呼吸道感染癥狀的患者咽拭子樣本及痰液樣本，采用德必碁生物科技（廈門）有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑（病毒型）進(jìn)行核酸提取，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)dna樣本的純度，120例樣本od260/od280皆在1.6~2.0之間。

3、按照實(shí)施例1所示的步驟，進(jìn)行dna加樣并上熒光定量pcr儀進(jìn)行檢測(cè)，本次使用的儀器為abi7500.

4、按照實(shí)施例1所示判斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀并統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如下表：

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

sequencelisting

<110>德必碁生物科技(廈門)有限公司

<120>一種多重?zé)晒鈖cr法聯(lián)合檢測(cè)呼吸道病原體的試劑盒

<130>36

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<170>patentinversion3.3

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<400>31

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