本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一株厚垣鐮刀菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物病原真菌引起的各種植物病害嚴(yán)重威脅我國(guó)的農(nóng)作物生產(chǎn)，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失難以估量。例如：棉花枯萎病菌在我國(guó)主要產(chǎn)棉區(qū)均有不同程度的發(fā)生，幼苗期即可發(fā)病，甚至能夠?qū)е抡麄€(gè)棉株枯萎病死，嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量與品質(zhì)。

植物病原線蟲也是普遍發(fā)生的植物病害之一，在我國(guó)主要危害煙草、三七、棉花、花生、西洋參等經(jīng)濟(jì)作物，已成為危害經(jīng)濟(jì)作物產(chǎn)量的重要因素之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年因植物病原線蟲所造成的作物損失高達(dá)數(shù)百億美元。

目前對(duì)植物病害的防治主要包括化學(xué)農(nóng)藥防治、輪作法和抗性品種利用等，均存在一定的局限性。尤其是化學(xué)農(nóng)藥防治，容易使植物病原真菌與線蟲產(chǎn)生抗藥性，而且殘留期長(zhǎng)，所以在應(yīng)用上受到限制。而微生物農(nóng)藥能夠有效克服化學(xué)合成農(nóng)藥的弊端，具有不易產(chǎn)生抗藥性、環(huán)境兼容性好、易于規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。其作為一種“環(huán)境友好”的無(wú)公害綠色農(nóng)藥，可持續(xù)性強(qiáng)，在植物病害防治中的作用日益明顯。因此，從微生物中尋找并開發(fā)生物農(nóng)藥，已經(jīng)成為發(fā)展植物病害綠色防治的重要方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的為提供一株厚垣鐮刀菌QJP1及其應(yīng)用。該菌株易于規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)，其發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)提取分離后對(duì)西洋參根結(jié)線蟲具有較好殺線蟲活性，對(duì)棉花枯萎病菌與柑橘炭疽病菌等植物病原真菌具有較好的抑制活性，因此具有良好的發(fā)展前景。

本發(fā)明所提供的菌株為厚垣鐮刀菌(Fusarium chlamydosporum)QJP1，分離于青島市膠州灣堿蓬濕地采集的鹽堿地土壤。該菌株目前已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期：2016年12月09日，保藏編號(hào)為CGMCC No.13198。

厚垣鐮刀菌菌株QJP1的保存方法：采用PDA培養(yǎng)基保存。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂12g，蒸餾水1000mL，pH調(diào)至7.0。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種厚垣鐮刀菌菌株QJP1的發(fā)酵方法，其特征是，

1)將保存的厚垣鐮刀菌菌株QJP1接種于PDA平板表面，26-30℃培養(yǎng)5-10天，作為規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)的菌種，待用；

2)然后取上述菌種加入發(fā)酵培養(yǎng)基中26-30℃下?lián)u床或靜置發(fā)酵培養(yǎng)10-40天，得到發(fā)酵液待用。所述發(fā)酵培養(yǎng)基(同PDB培養(yǎng)基)為：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL，pH調(diào)至7.0。

上述發(fā)酵產(chǎn)物可以進(jìn)一步提取，具體包括以下步驟：

1)采用有機(jī)溶劑提取，提取液減壓蒸餾得浸膏；所述有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇、乙醇或者正丁醇中的一種或幾種，優(yōu)選乙酸乙酯；

2)然后浸膏進(jìn)行柱層析分離，所述柱層析可采用硅膠柱層析、凝膠柱層析、反相柱層析及大孔吸附樹脂柱層析中的一種或幾種，優(yōu)選硅膠柱層析；

3)以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，收集石油醚-乙酸乙酯體積比10:1梯度的洗脫組分I用于制備微生物殺線蟲劑；所述石油醚-乙酸乙酯洗脫梯度為100:1至1:1；

4)然后以氯仿-甲醇梯度洗脫，收集氯仿-甲醇體積比20:1梯度的洗脫組分Ⅱ用于制備微生物殺菌劑；所述氯仿-甲醇洗脫梯度為60:1至1:1。

本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的發(fā)酵產(chǎn)物可由厚垣鐮刀菌菌株QJP1經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)、提取分離而獲得，具有生產(chǎn)工藝相對(duì)簡(jiǎn)單、易于規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)、在環(huán)境中易于降解及對(duì)人畜毒性較低等優(yōu)點(diǎn)。其對(duì)棉花枯萎病菌與柑橘炭疽病菌等植物病原真菌具有較好的抑制活性，最小抑制濃度(MIC)分別為4與8μg/mL；此外，所述發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)西洋參根結(jié)線蟲具有較好殺線蟲活性，其50倍與100倍稀釋液對(duì)西洋參根結(jié)線蟲的致死率分別為100％與83％，因此在植物病害防治中具有良好的應(yīng)用前景。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是示例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施例1：厚垣鐮刀菌QJP1菌株分離與鑒定

(1)菌株分離

本發(fā)明所述菌株QJP1是從土壤中采用平板稀釋涂布與劃線等方法分離獲得。(1)土壤樣品采集：采集地點(diǎn)為青島市膠州灣堿蓬濕地，采用5點(diǎn)取樣法。(2)分離步驟：稱取1g鹽堿地土樣于100mL無(wú)菌水中，置于搖床中30℃、150r/min震蕩10min，依次稀釋至10^-2、10^-3、10^-4濃度；分別吸取100μL上述稀釋液，均勻涂布于含3.5％海鹽的LB雙抗培養(yǎng)基平板上，每個(gè)梯度涂布三個(gè)平行；30℃培養(yǎng)2d后，挑取培養(yǎng)基表面不同形態(tài)的微生物菌落，并在含3.5％海鹽的LB雙抗培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線，定時(shí)觀察菌落生長(zhǎng)情況；最后，采用平板劃線法，分離純化真菌菌株，編號(hào)保存。

(2)菌株鑒定

將QJP1菌株接種到PDA平板表面，28℃培養(yǎng)5-7天后觀察。菌落中央形成凸起，菌落表面呈白色，密生氣生菌絲棉絮狀，菌落背面淡黃色；顯微鏡檢可觀察到鐮刀形大型、有隔分生孢子，菌絲頂端或菌絲中間生長(zhǎng)出球形厚垣孢子。

所述菌株的rDNA基因序列測(cè)定結(jié)果(ITS-5.8S-ITS2區(qū))如下：

TCCGTAGGTGAACCTTGCGGTTAAACTCCCAAACCCCTGTGACATACCTATACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAACGGGACGGCCCGCCCGAGGACCCCTAAACTCTGTTTTTAGTGGAACTTCTGAGTAAAACAAACAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGGTAACCCGCGTTCCCCAAATCGATTGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAATCATACACCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCCGTAAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGACCGCAAGGTTCACCTACGGA

綜上所述，菌株鑒定為厚垣鐮刀菌(Fusarium chlamydosporum)，該菌株目前已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏日期：2016年12月09日，所述菌株的保藏編號(hào)為CGMCC No.13198。

實(shí)施例2：厚垣鐮刀菌菌株QJP1發(fā)酵培養(yǎng)

(1)發(fā)酵培養(yǎng)

按照微生物的常規(guī)培養(yǎng)方法，挑取少量保存于PDA培養(yǎng)基斜面的厚垣鐮刀菌菌株QJP1，接種于PDA平板表面，28℃培養(yǎng)5天，作為規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)的菌種，待用。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂12g，蒸餾水1000mL，pH調(diào)至7.0。

(2)切取上述PDA平板表面的菌種(用量為平板的1/4)，接種至已滅菌的、盛有PDB培養(yǎng)基的錐形瓶中，28℃、120rpm搖床培養(yǎng)10天，備用。

PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL，pH調(diào)至7.0。

(3)發(fā)酵產(chǎn)物的制備

將上述培養(yǎng)產(chǎn)物用乙酸乙酯提取3次，合并乙酸乙酯提取液，減壓蒸餾得浸膏。將其進(jìn)行硅膠VLC(vacuum liquid chromatography)快速柱層析，按照洗脫液極性遞增順序，分別以石油醚-乙酸乙酯(體積比100:1至1:1)和氯仿-甲醇(體積比60:1至1:1)為梯度洗脫劑進(jìn)行硅膠柱層析分離。收集石油醚-乙酸乙酯體積比10:1梯度的洗脫組分I，用于制備微生物殺線蟲劑；收集氯仿-甲醇體積比20:1梯度的洗脫組分Ⅱ，用于制備微生物殺菌劑。

實(shí)施例3：抑菌活性

采用微量稀釋法，測(cè)定厚垣鐮刀菌菌株QJP1發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)棉花枯萎病菌與柑橘炭疽病菌的抑菌活性。

1)菌懸液的制備

將供試真菌接種于PDA培養(yǎng)基表面于28℃培養(yǎng)72h后，吸取2mL無(wú)菌0.85％NaCl溶液(含0.25％吐溫-20)洗滌培養(yǎng)物，并用玻璃刮刀將菌落輕輕刮下。吸取適量菌懸液于無(wú)菌試管中，調(diào)至0.5麥?zhǔn)媳葷?相當(dāng)于1.5×108CFU/mL)備用；

2)樣品的配制

取一定量待測(cè)樣品(實(shí)施例2中發(fā)酵產(chǎn)物的洗脫組分Ⅱ)，溶解于100μL 50％DMSO中，充分混勻后，吸取50μL樣品溶液到另一只離心管中，接著加入50μL 50％DMSO，得到濃度減半的樣品溶液。按照此方法，得到12組濃度依次減半的樣品溶液。

3)MIC測(cè)定方法

(1)采用無(wú)菌操作，將倍比稀釋后不同濃度的樣品溶液分別加到無(wú)菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第12孔各加5μL的樣品溶液，并以不加樣品孔作為空白對(duì)照，加5μL DMSO溶液孔為溶劑對(duì)照。

(2)將相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷岫鹊闹甘揪鷳乙海?jīng)沙氏培養(yǎng)基稀釋1000倍后，取95μL依次加入到96孔板中，使得第1至第12孔的樣品濃度依次為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5和0.25μg/mL。以上所有樣品均重復(fù)三次。輕輕震蕩混勻后，將96孔板密封置于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。

(3)在600nm波長(zhǎng)下使用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的吸光值，以在小孔內(nèi)完全抑制指示菌生長(zhǎng)的最低樣品濃度為該化合物的MIC。(注意：當(dāng)陰性對(duì)照孔內(nèi)指示菌明顯生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)才有意義；當(dāng)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)單一的跳孔時(shí)，應(yīng)記錄抑制菌株生長(zhǎng)的最高藥物濃度；如出現(xiàn)多處跳孔，則不應(yīng)報(bào)告結(jié)果，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)。)

試驗(yàn)結(jié)果為厚垣鐮刀菌菌株QJP1發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)棉花枯萎病菌與柑橘炭疽病菌的MIC值分別為4與8μg/mL，具有較好抑菌活性。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明本發(fā)明所述厚垣鐮刀菌菌株QJP1發(fā)酵產(chǎn)物具有較好抑菌活性，可用于制備微生物殺菌劑。

實(shí)施例4：殺線蟲活性

(1)實(shí)驗(yàn)方法

供試線蟲及其培養(yǎng)方法

西洋參根結(jié)線蟲由山東省林業(yè)科學(xué)研究院提供。稱取20g燕麥片加60mL水，滅菌后加入1mL線蟲懸液，25℃培養(yǎng)7d。在無(wú)菌條件下，挑取適量已培養(yǎng)好的含線蟲的燕麥放于濾紙上，用簡(jiǎn)易貝曼漏斗法洗出線蟲，將線蟲懸于無(wú)菌水中備用，濃度約為2000條/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

殺線蟲活性測(cè)定

取一定量待測(cè)樣品(實(shí)施例2中發(fā)酵產(chǎn)物的洗脫組分Ⅰ)，以50％DMSO分別稀釋50與100倍，吸取1mL至滅菌離心管中，再加入線蟲懸液100μL，以50％DMSO處理為對(duì)照，25℃靜置12h?；靹蚝?，吸取混合液點(diǎn)到載玻片上，置于光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)死亡線蟲數(shù)及線蟲總數(shù)(線蟲僵直不動(dòng)視為死亡)，計(jì)算死亡率。每次觀察的線蟲數(shù)不少于30條。

判斷活性級(jí)別的標(biāo)準(zhǔn)為：死亡率＞90％為“+++”級(jí)；70％＜死亡率＜90％，為“++”級(jí)；50％＜線蟲死亡率＜70％，為“+”級(jí)；死亡率＜50％，為“－”級(jí)。

(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

厚垣鐮刀菌菌株發(fā)酵產(chǎn)物的50倍稀釋液對(duì)西洋參根結(jié)線蟲的致死率為100％，活性級(jí)別為“+++”級(jí)；12h后在顯微鏡下觀察各處理蟲體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)死亡線蟲失去活動(dòng)性，蟲體僵直，而對(duì)照活線蟲運(yùn)動(dòng)活潑，蟲體彎曲呈“S”型。

而厚垣鐮刀菌菌株發(fā)酵產(chǎn)物的100倍稀釋液對(duì)西洋參根結(jié)線蟲的致死率為83％，活性級(jí)別為“++”級(jí)?？梢?，盡管發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)一步稀釋后，線蟲的致死率有所下降，但相比空白對(duì)照(5％)仍表現(xiàn)出明顯的殺線蟲活性。因此，所述菌株制備的發(fā)酵產(chǎn)物，能夠有效防治植物病原線蟲，尤其是西洋參根結(jié)線蟲，可用于制備微生物殺線蟲劑。

SEQUENCE LISTING

<110> 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一株厚垣鐮刀菌及其應(yīng)用

<130> 1

<140> 0

<141> 2017-02-16

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 548

<212> DNA

<213> 厚垣鐮刀菌（Fusarium chlamydosporum）菌株QJP1的rRNA基因序列（ITS1-5.8S-ITS4區(qū)）

<400> 1

tccgtaggtg aaccttgcgg ttaaactccc aaacccctgt gacataccta tacgttgcct 60

cggcggatca gcccgcgccc cgtaaaacgg gacggcccgc ccgaggaccc ctaaactctg 120

tttttagtgg aacttctgag taaaacaaac aaataaatca aaactttcaa caacggatct 180

cttggttctg gcatcgatga agaacgcagc aaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa 240

ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac attgcgcccg ccagtattct ggcgggcatg 300

cctgttcgag cgtcatttca accctcaagc tcagcttggt gttgggactc gcggtaaccc 360

gcgttcccca aatcgattgg cggtcacgtc gagcttccat agcgtagtaa tcatacacct 420

cgttactggt aatcgtcgcg gccacgccgt aaaaccccaa cttctgaatg ttgacctcgg 480

atcaggtagg aatacccgct gaacttaagc atatcaataa gcggaggacc gcaaggttca 540

cctacgga 548