本發(fā)明涉及一種咪唑二羧酸鎳配合物、制備方法及其應(yīng)用，屬于配位化學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

自1967年美國(guó)密執(zhí)安州立大學(xué)B.Rosenbergr教授等發(fā)現(xiàn)順鉑具有抗腫瘤活性以來(lái)，金屬配合物在生物醫(yī)藥方面的研究引起了人們的極大關(guān)注。很多含有咪唑環(huán)的天然產(chǎn)物具有廣泛的應(yīng)用，尤其是在生物、醫(yī)藥等方面顯示出非常獨(dú)特的性能，如在抗真菌、抗癌，以及治療低血糖和生理紊亂等方面具有很好的應(yīng)用價(jià)值。咪唑二羧酸類化合物含有多個(gè)配位原子，具有多種配位方式，可與多種金屬形成性能優(yōu)良的配合物。鎳是動(dòng)物必需的微量元素，與動(dòng)物心血管、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)存在密切的關(guān)系，并參與核酸和蛋白質(zhì)的代謝，具有緩解腎上腺素升高血壓和增強(qiáng)胰島素降低血糖的作用。咪唑二羧酸鎳配合物的合成與生物活性研究具有重要的意義。

血清白蛋白是血漿中最豐富的蛋白，藥物進(jìn)入機(jī)體的血循環(huán)后，與血清白蛋白不同程度的可逆性非共價(jià)結(jié)合直接影響藥物在體內(nèi)的分布、貯存、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝及藥理活性的發(fā)揮。白蛋白分子內(nèi)因含有色氨酸、酪氨酸等氨基酸殘基而發(fā)射較強(qiáng)的內(nèi)源性熒光，藥物與白蛋白的相互作用引起的白蛋白分子內(nèi)源性熒光變化可為蛋白質(zhì)分子中熒光生色基團(tuán)的結(jié)構(gòu)及其所處微環(huán)境變化提供有用的信息。利用熒光光譜法研究咪唑二羧酸鎳配合物與血清白蛋白的相互作用，反映藥物在生物體內(nèi)的性質(zhì)，使我們更清楚地認(rèn)識(shí)藥物在生物體內(nèi)的具體作用，為藥物的設(shè)計(jì)、篩選及新藥的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種咪唑二羧酸鎳配合物、制備方法及其應(yīng)用。所述的咪唑二羧酸鎳配合物制備方法簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，純度高。利用熒光光譜法研究配合物與血清白蛋白的相互作用發(fā)現(xiàn)，咪唑二羧酸鎳配合物可與血清白蛋白自發(fā)發(fā)生作用，與血清白蛋白之間形成熒光較弱或者無(wú)熒光的復(fù)合物而引起B(yǎng)SA、HSA內(nèi)源性熒光猝滅，其與BSA、HSA的結(jié)合改變了蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象，結(jié)合位點(diǎn)更接近于色氨酸殘基。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種2-羥甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸制備的咪唑二羧酸鎳配合物，所述的咪唑二羧酸鎳配合物的分子式為C₆H₆N₂Ni_0.5O₆。

一種咪唑二羧酸鎳配合物的制備方法，包括以下步驟：

(1)將2-羥甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸分散于溶劑中，配制成2-羥甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸濃度為0.05mol/L的配體溶液；

將Ni(NO₃)₂·6H₂O溶解于溶劑中，配制成Ni(NO₃)₂·6H₂O濃度為0.05mol/L的鎳鹽溶液；

(2)將鎳鹽溶液和配體溶液按照2-羥甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸和Ni(NO₃)₂·6H₂O物質(zhì)的量比1:1的比例混合；

(3)將步驟(2)的混合液置于反應(yīng)容器中，在110-140℃條件下反應(yīng)72h，再以5℃/h的速率降溫至室溫，自然干燥，即得。

所述的溶劑為去離子水。

所述的反應(yīng)容器為聚四氟乙烯內(nèi)襯不銹鋼反應(yīng)釜。

優(yōu)選的，所述的反應(yīng)溫度為120℃。

一種所述的咪唑二羧酸鎳配合物與牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)的相互作用。

一種所述的咪唑二羧酸鎳配合物在作為研究生物活性試劑方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明以2-羥甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸為配體，與鎳離子配位，得到一種新的咪唑二羧酸鎳配合物，該配合物為單斜晶系，P2(1)/c空間群；晶胞參數(shù)α＝90°，β＝104.72(3)°，γ＝90°；V＝817.7A³；Z＝4；Dc＝1.880Mg/m³；R₁＝0.0486，ωR2＝0.1029。

2、本發(fā)明采用水熱法，將Ni(NO₃)₂·6H₂O與2-羥甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸進(jìn)行反應(yīng)，使配體與相應(yīng)的金屬發(fā)生配合，從而得到新的咪唑二羧酸鎳配合物。該合成方法簡(jiǎn)單、方便、安全，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物為晶體，純度高，便于后續(xù)活性研究。

3、本發(fā)明采用熒光光譜法研究配合物與牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)的相互作用。結(jié)果表明，該配合物與BSA、HSA均能發(fā)生較強(qiáng)的相互作用，配合物作為藥物可被血漿載運(yùn)和儲(chǔ)存。

附圖說(shuō)明

圖1為咪唑二羧酸鎳配合物的配位環(huán)境圖。

圖2為咪唑二羧酸鎳配合物的一維超分子鏈狀結(jié)構(gòu)圖。

圖3為咪唑二羧酸鎳配合物的三維超分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)圖。

圖4為咪唑二羧酸鎳配合物的模擬與實(shí)測(cè)的PXRD圖譜對(duì)比圖。

圖5為不同溫度下，BSA/HSA溶液隨著咪唑二羧酸鎳配合物濃度的增加熒光光譜的變化(箭頭所指方向?yàn)檫溥蚨人徭嚺浜衔餄舛仍黾拥姆较?。a為298K時(shí)BSA的熒光光譜變化圖，b為308K時(shí)BSA的熒光光譜變化圖，c為298K時(shí)HSA的熒光光譜變化圖，d為308K時(shí)HSA的熒光光譜變化圖；插圖為340nm處熒光強(qiáng)度隨咪唑二羧酸鎳配合物濃度的增加的變化圖。

圖6為不同溫度下，咪唑二羧酸鎳配合物對(duì)BSA、HSA的Stern-volmer曲線圖。a為配合物對(duì)BSA的Stern-volmer曲線圖，b為配合物對(duì)HSA的Stern-volmer曲線圖。

圖7為不同溫度下，咪唑二羧酸鎳配合物對(duì)BSA、HSA的雙對(duì)數(shù)圖。a為配合物對(duì)BSA的雙對(duì)數(shù)圖，b為配合物對(duì)HSA的雙對(duì)數(shù)圖。

圖8為不同溫度下，咪唑二羧酸鎳配合物對(duì)BSA、HSA的同步熒光光譜圖(箭頭所指方向?yàn)檫溥蚨人徭嚺浜衔餄舛仍黾拥姆较?。a、b、c、d為不同溫度時(shí)，BSA的同步熒光光譜圖；e、f、g、h為不同溫度時(shí)，HSA的同步熒光光譜圖。

圖9為不同溫度下，咪唑二羧酸鎳配合物對(duì)BSA、HSA的3D熒光光譜圖。a、c、e、g分別為不同溫度時(shí)，BSA、HSA的3D熒光光譜圖；b、d、f、h為不同溫度時(shí)，配合物與白蛋白的物質(zhì)的量比為20：1時(shí)的3D熒光光譜圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

本發(fā)明的配體2-羥甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸的合成方法參照論文Sheng-Run Zheng,Song-Liang Cai,Mei Pan,Jun Fan,Tian-Tian Xiao,Wei-Guang Zhang,The construction of coordination networks based on imidazole-based dicarboxylate ligand containing hydroxymethyl group,CrystEngComm,2011,13,883–888。

實(shí)施例1 咪唑二羧酸鎳配合物的合成

(1)將2-羥甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸分散于去離子水中，配制成2-羥甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸濃度為0.05mol/L的配體溶液；

將Ni(NO₃)₂·6H₂O溶解于去離子水中，配制成Ni(NO₃)₂·6H₂O濃度為0.05mol/L的鎳鹽溶液；

(2)將鎳鹽溶液和配體溶液按照2-羥甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸和Ni(NO₃)₂·6H₂O物質(zhì)的量比1:1的比例混合；

(3)將步驟(2)的混合液置于聚四氟乙烯內(nèi)襯不銹鋼反應(yīng)釜中，在120℃條件下反應(yīng)72h，再以5℃/h的速率降溫至室溫，自然干燥，得到藍(lán)色棱柱狀晶體，即為咪唑二羧酸鎳配合物。

實(shí)施例2 咪唑二羧酸鎳配合物的結(jié)構(gòu)表征

1、晶體結(jié)構(gòu)分析

采用Bruker APEX-II CCD型單晶衍射儀對(duì)實(shí)施例1得到的咪唑二羧酸鎳配合物進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)測(cè)試，測(cè)試結(jié)果為：

該配合物為單斜晶系，P2(1)/c空間群；晶胞參數(shù)α＝90°，β＝104.72(3)°，γ＝90°；V＝817.7A³；Z＝4；Dc＝1.880Mg/m³；R₁＝0.0486，ωR2＝0.1029。

采用石墨單色化的Mo Kα射線以ω掃描方式收集數(shù)據(jù)。晶體結(jié)構(gòu)采用直接法解出，并且用傅立葉技術(shù)擴(kuò)展，按各向異性進(jìn)行修正，所有數(shù)據(jù)經(jīng)Lp因子校正。SHELXL-97程序?qū)λ蟹菤湓幼鴺?biāo)和溫度因子進(jìn)行了全矩陣最小二乘法精修。得到如圖1所示咪唑二羧酸鎳配合物的配位環(huán)境圖，如圖2所示的咪唑二羧酸鎳配合物的一維超分子鏈狀結(jié)構(gòu)圖，如圖3所示的咪唑二羧酸鎳配合物的三維超分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)圖。

由圖1可知，所述咪唑二羧酸鎳配合物的組成為[Ni_0.5(H₂hmIDC)(H₂O)]_n(n為大于等于1的整數(shù)，中括號(hào)內(nèi)為最小不對(duì)稱單元的組成)，分子式為C₆H₆N₂Ni_0.5O₆。配合物的單元結(jié)構(gòu)包含半個(gè)Ni(II)離子、一個(gè)脫質(zhì)子的H₂hmIDC^2-陰離子和一個(gè)配位水分子。在配合物中Ni(II)為六配位，分別與來(lái)自兩個(gè)H₂hmIDC^2-配體上的兩個(gè)氧原子(O1,O1#1)、兩個(gè)氮原子(N1,N1#1)和兩個(gè)配位水分子上的兩個(gè)氧原子(O6,O6#1)螯合。Ni(II)處于稍扭曲的八面體NiN₂O₄配位構(gòu)型中，O6、O6#1占據(jù)八面體的頂點(diǎn)位置，鍵角O(6)#1-Ni(1)-O(6)為180.00(8)°。Ni(II)周圍的Ni-O配位鍵長(zhǎng)為Ni(1)-O(1)：Ni(1)-O(1)#1：Ni(1)-O(6)：Ni(1)-O(6)#1：Ni-N配位鍵長(zhǎng)為Ni(1)-N(1)：Ni(1)-N(1)#1：

如圖2所示，相鄰分子通過(guò)羧基間的O-H…O連接成超分子鏈狀結(jié)構(gòu)。超分子鏈沿b方向通過(guò)配位水分子與羧基上的O-H…O氫鍵相連，擴(kuò)展成二維結(jié)構(gòu)。如圖3所示，超分子鏈通過(guò)咪唑環(huán)與羥基之間的N-H…O氫鍵堆積形成超分子立體結(jié)構(gòu)。

2、紅外光譜分析

采用美國(guó)賽默飛公司(Thermo SCIENTIFIC)公司的NICOLET iS50傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)實(shí)施例1得到的咪唑二羧酸鎳配合物進(jìn)行紅外光譜測(cè)試(采用KBr壓片法，室溫下掃描，測(cè)試范圍為400-4000cm^-1)。紅外光譜中的特征吸收峰(cm^-1)：3309，2907，2791，1709，1542，1456，1386，1269，1223，1096，1039，984，906，860，774，728，671，538，456。

3、X射線粉末衍射分析

采用PANalytical公司生產(chǎn)的X’Pert PRO型粉末衍射儀，通過(guò)使用Cu-Kα1射線采集實(shí)施例1得到的咪唑二羧酸鎳配合物的衍射數(shù)據(jù)(見(jiàn)圖4)。

從圖4分析可知，測(cè)得的咪唑二羧酸鎳配合物的PXRD的圖譜與模擬圖譜基本吻合，這說(shuō)明所述咪唑二羧酸類配合物的純度很高，可用于性能研究。

實(shí)施例3 咪唑二羧酸鎳配合物與血清白蛋白的相互作用

實(shí)驗(yàn)儀器：熒光分光光度計(jì)型號(hào)為F7000，日本日立公司生產(chǎn)。

試劑的配制及測(cè)試條件設(shè)置：

1、樣品液的配制

2-羥甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸鎳配合物溶液：稱取0.0046g 2-羥甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸鎳配合物配制成濃度為2×10^-3mol/L的DMSO溶液。

Tris-HCl緩沖溶液：取Tris(三羥甲基氨基甲烷)3.0285g、氯化鈉7.3124g，轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中，蒸餾水定容后，搖勻。然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.40。

牛血清白蛋白(BSA)溶液：稱取牛血清白蛋白0.0333g，置于10mL容量瓶中，加入5mL Tris-HCl緩沖溶液溶解，用Tris-HCl溶液定容，配制成濃度為5×10^-5mol/L的牛血清白蛋白溶液。

人血清白蛋白(HSA)溶液：稱取人血清白蛋白0.0331g，置于10mL容量瓶中，加入5mL Tris-HCl緩沖溶液溶解，用Tris-HCl溶液定容，配制成濃度為5×10^-5mol/L的人血清白蛋白溶液。

2、熒光光譜測(cè)試條件的設(shè)置

分別在298K、308K條件下，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為280nm，激發(fā)和發(fā)射狹峰均為5nm，在285～450nm范圍掃描其熒光光譜；在發(fā)射波長(zhǎng)250～550nm，激發(fā)波長(zhǎng)200～400nm范圍內(nèi)掃描其3D熒光光譜。并分別在波長(zhǎng)差Δλ＝15nm和Δλ＝60nm時(shí)，掃描其同步熒光光譜。

3、熒光光譜的測(cè)定

取0.3mL牛血清白蛋白溶液(0.6mL人血清白蛋白溶液)，Tris-HCl緩沖溶液14.7mL(14.4mL)于圓底燒瓶中，配成濃度為1×10^-6mol/L的牛血清白蛋白溶液(濃度為2×10^-6mol/L的人血清白蛋白溶液)。加入不同體積的配合物溶液，并在不同溫度時(shí)測(cè)定其熒光光譜的變化(與BSA相互作用時(shí)，配合物濃度范圍：0～8.47×10^-4mol/L；與HSA相互作用時(shí)，配合物濃度范圍：0～7.10×10^-4mol/L)。

熒光光譜法測(cè)定配合物與血清白蛋白的相互作用：

1、熒光猝滅

蛋白質(zhì)的熒光主要來(lái)自于由色氨酸殘基，且蛋白質(zhì)的內(nèi)源性熒光及其變化能直接反映蛋白質(zhì)內(nèi)色氨酸殘基自身及其所處環(huán)境的變化。采用熒光光譜法用實(shí)施例1所合成的配合物對(duì)牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)的相互作用進(jìn)行研究，結(jié)果如圖5，BSA的濃度為1×10^-6mol/L，隨著配合物濃度的增加，BSA的內(nèi)源性熒光逐漸減弱，當(dāng)配合物濃度為8.47×10^-4mol/L時(shí)，配合物對(duì)BSA內(nèi)源性熒光的猝滅基本達(dá)到平衡；HSA的濃度為2×10^-6mol/L，隨著配合物濃度的增加，HSA的內(nèi)源性熒光逐漸減弱，當(dāng)配合物濃度為7.10×10^-4mol/L時(shí)，配合物對(duì)HSA內(nèi)源性熒光的猝滅基本達(dá)到平衡。說(shuō)明在這298K、308K兩個(gè)溫度下，BSA、HSA的內(nèi)源性熒光能有效的被配合物猝滅，而發(fā)射峰的形狀和位置并沒(méi)有發(fā)生變化，表明配合物與BSA、HSA之間形成了熒光較弱或者無(wú)熒光的復(fù)合物而造成BSA、HSA內(nèi)源性熒光被猝滅。

2、猝滅機(jī)制

引起B(yǎng)SA、HSA熒光猝滅的原因有靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅。動(dòng)態(tài)猝滅是一種能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移的過(guò)程，不影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生理活性。靜態(tài)猝滅是由于發(fā)生了配合反應(yīng)，通常是產(chǎn)生了不發(fā)熒光的配合物，對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)可產(chǎn)生影響，并可能影響其生理活性。動(dòng)態(tài)猝滅遵循Stern-volmer方程：

F₀/F＝1+K_sv[Q]＝1+K_qτ₀[Q] 公式(1)

F₀和F分別為未加入和加入猝滅劑時(shí)BSA、HSA的熒光強(qiáng)度；K_q為雙分子猝滅過(guò)程速率常數(shù)；K_sv為Stern-volmer方程的猝滅常數(shù)；τ₀為沒(méi)有猝滅劑存在下生物大分子平均壽命，約為10^-8s；[Q]為配合物的濃度。

由以上公式可求得BSA、HSA猝滅過(guò)程的速率常數(shù)K_q(見(jiàn)表1)。

表1鎳配合物與BSA、HSA相互作用的速率常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

圖6為不同溫度下，咪唑二羧酸鎳配合物對(duì)BSA、HSA的Stern-volmer圖。由圖6可知，在不同溫度下，配合物-蛋白的Stern-volmer曲線呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；隨著溫度的升高Stern-volmer常數(shù)逐漸降低，表明配合物對(duì)蛋白的猝滅方式為靜態(tài)猝滅。而兩個(gè)溫度下，配合物對(duì)蛋白質(zhì)的猝滅過(guò)程的速率常數(shù)均大于各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)2.0×10¹⁰L·mol^-1·s^-1，進(jìn)一步說(shuō)明配合物與蛋白相互作用形成了不發(fā)熒光的復(fù)合物。

3、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

配合物與BSA、HSA相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)可通過(guò)雙對(duì)數(shù)方程獲得：

log[(F₀-F)/F]＝logK_b+nlog[Q] 公式(2)

圖7為不同溫度下，咪唑二羧酸鎳配合物對(duì)BSA、HSA的雙對(duì)數(shù)圖。K_b為結(jié)合常數(shù)，n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，計(jì)算結(jié)果(見(jiàn)表1)表明，配合物與BSA、HSA可形成1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，說(shuō)明配合物與BSA、HSA均具有較強(qiáng)的結(jié)合能力。以血清白蛋白為載體，作為藥物2-羥甲基-4，5-咪唑二羧酸鎳配合物可通過(guò)血液運(yùn)載和存儲(chǔ)。

4、作用力類型

藥物和白蛋白等生物大分子之間的作用力主要有分子間氫鍵、范德華力和靜電引力等，分子間作用力的發(fā)生會(huì)引起體系熱力學(xué)參數(shù)的變化，通過(guò)測(cè)定體系熱力學(xué)參數(shù)的變化可以判斷藥物與白蛋白之間的主要作用力類型。不同藥物與白蛋白的結(jié)合力類型也不相同，藥物與蛋白之間的作用力類型的確定可根據(jù)兩者作用前后焓變?chǔ)和熵變?chǔ)來(lái)判斷，當(dāng)溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)的焓變?chǔ)可認(rèn)為是常數(shù)。配合物與BSA、HSA的作用力類型由Van’t Hoff方程判斷：

ln(K₂/K₁)＝[1/T₁-1/T₂]ΔH/R 公式(3)

ΔG＝ΔH-TΔS＝-RTlnK 公式(4)

R為氣體常數(shù)(8.314472J K^-1mol^-1)，K₁、K₂為溫度為T₁、T₂時(shí)的結(jié)合常數(shù)，鎳配合物與BSA、HSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)列于表2。

表2不同溫度下鎳配合物與BSA、HSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

一定條件下，藥物與白蛋白的結(jié)合反應(yīng)是否能自發(fā)進(jìn)行與體系的吉布斯自由能變有關(guān)，吉布斯自由能小于零時(shí)，反應(yīng)能夠自發(fā)進(jìn)行。這種自發(fā)過(guò)程可以分為熵驅(qū)動(dòng)和焓驅(qū)動(dòng)。熵、焓的大小與作用力類型之間的關(guān)系如表3：

表3熵焓的大小與作用力類型之間的關(guān)系

由表2、表3，配合物與BSA、HSA相互作用的熱力學(xué)常數(shù)ΔH＜0，ΔS＜0，說(shuō)明配合物與BSA、HSA之間存在氫鍵或范德華力。ΔG＜0，則表明配合物與BSA、HSA的相互作用過(guò)程是自發(fā)進(jìn)行的。

5、同步熒光光譜

血清白蛋白分子中因含有色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸等殘基而發(fā)射較強(qiáng)的內(nèi)源性熒光，其中色氨酸和酪氨酸的熒光強(qiáng)度比較大，并且兩者的激發(fā)光譜相似，發(fā)射光譜會(huì)嚴(yán)重重疊，利用同步熒光光譜選擇合適的Δλ可以達(dá)到簡(jiǎn)化光譜、減少光譜重疊和窄化譜帶的目的，而通常情況下，Δλ＝60nm的同步熒光光譜只顯示色氨酸的特征光譜，Δλ＝15nm的同步光譜只顯示酪氨酸的特征光譜。根據(jù)同步熒光光譜發(fā)射波長(zhǎng)的變化可以推測(cè)配合物對(duì)BSA、HSA色氨酸和酪氨酸微環(huán)境產(chǎn)生的影響，進(jìn)而可以判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。

圖8為不同溫度下，咪唑二羧酸鎳配合物對(duì)BSA、HSA的同步熒光光譜圖，最大發(fā)射波長(zhǎng)的位移結(jié)果列于表4。從圖8可以看出隨著配合物濃度的增加，Δλ＝60nm時(shí)BSA、HSA的最大熒光強(qiáng)度比Δλ＝15nm時(shí)降低更多，表4表明，Δλ＝60nm時(shí)最大發(fā)射波長(zhǎng)的紅移更明顯，證明隨著配合物的加入BSA、HSA的構(gòu)象發(fā)生變化，色氨酸所處環(huán)境的疏水性降低，即BSA、HSA內(nèi)部的疏水腔結(jié)構(gòu)有所瓦解，肽鏈的伸展程度有所增加。

表4最大發(fā)射波長(zhǎng)的位移

6、3D熒光光譜

在三維熒光光譜中，熒光分子的熒光強(qiáng)度既隨激發(fā)波長(zhǎng)變化又隨發(fā)射波長(zhǎng)變化，熒光分子狀態(tài)的變化可以通過(guò)三維熒光的指紋信息和熒光峰位置較好的反映出來(lái)。三維熒光光譜能夠提供蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的詳細(xì)信息，氨基酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)與蛋白質(zhì)微環(huán)境的極性有密切關(guān)系。咪唑二羧酸鎳配合物對(duì)BSA、HSA的三維光譜如圖9，峰a(peak a)為瑞利散射峰，其特征是λex＝λem(Δλ＝0)；峰1(peak 1)、峰2(peak 2)是兩種典型的光譜峰，從峰的位置看：加入配合物后，BSA、HSA的瑞利散射峰起始位置及熒光峰位置均無(wú)顯著變化；從Stokes位移看：加入配合物后，BSA熒光峰的Stokes位移均不變，HSA熒光峰峰2的Stokes位移有所減??；從峰的強(qiáng)度看：加入配合物后，峰a的強(qiáng)度增強(qiáng)，而熒光峰的相對(duì)強(qiáng)度均有不同程度的降低；從熒光峰強(qiáng)度變化程度看：峰1和峰2強(qiáng)度降低的程度是不一樣的，很顯然配合物對(duì)峰2的猝滅作用更為明顯。隨著配合物的增加峰1、峰2熒光強(qiáng)度降低是由于配合物與白蛋白的結(jié)合位于由疏水性氨基酸構(gòu)成的疏水腔中，正是配合物的引入導(dǎo)致了這種疏水微環(huán)境極性的改變，進(jìn)而引起B(yǎng)SA、HSA構(gòu)象的變化。

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