本申請(qǐng)為分案申請(qǐng),其原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為2011年4月26日,申請(qǐng)?zhí)枮?01180031963.2,名稱為“稠合的環(huán)辛炔化合物及其在無(wú)金屬點(diǎn)擊反應(yīng)中的應(yīng)用”。
本發(fā)明涉及稠合的環(huán)辛炔化合物及其制備的方法。本發(fā)明所述稠合的環(huán)辛炔化合物可用于無(wú)金屬的點(diǎn)擊反應(yīng)(clickreaction)。因此,本發(fā)明還涉及通過(guò)稠合的環(huán)辛炔綴合物與包含1,3-偶極子或1,3-(雜)二烯的靶分子的反應(yīng)修飾靶分子的方法。本發(fā)明還涉及環(huán)辛炔綴合物用于靶分子的生物正交(bioorthogonal)標(biāo)記、成像或修飾中的用途。
背景技術(shù):
快速發(fā)展的“化學(xué)生物學(xué)”領(lǐng)域中的一個(gè)革命性發(fā)展涉及生命系統(tǒng)中的化學(xué)。生命系統(tǒng)中的化學(xué)涉及這樣的化學(xué)反應(yīng):其在自然條件下是溫和的,并且如此的快速和高產(chǎn)率以至于其可在大約生理ph、在水中和生物分子官能團(tuán)(biomolecularfunctionality)附近發(fā)揮作用。這種反應(yīng)可分類于術(shù)語(yǔ)“生物正交化學(xué)”內(nèi)。在生物正交化學(xué)領(lǐng)域,主要有兩個(gè)挑戰(zhàn):一、開(kāi)發(fā)適合的化學(xué)(chemistry);以及二、將其應(yīng)用于活生物體中(體內(nèi))。
在化學(xué)領(lǐng)域,存在大量的化學(xué)反應(yīng)的工具盒,可用于構(gòu)建復(fù)雜的有機(jī)分子。但是,絕大多數(shù)這種反應(yīng)只能在嚴(yán)格的無(wú)水條件下(換言之,在完全無(wú)水的情況下)實(shí)施。雖然還有極少數(shù)化學(xué)反應(yīng)可在水中或有水條件下進(jìn)行,但是大多數(shù)這種反應(yīng)只能在體外應(yīng)用,因?yàn)闊o(wú)法排除存在于活生物體中的其他化合物對(duì)所涉及的化學(xué)試劑的干擾。目前,只有少數(shù)化學(xué)反應(yīng)能夠與存在于活生物體中的其他官能團(tuán)完全相容。
這種反應(yīng)的一個(gè)實(shí)例是環(huán)炔和疊氮化物的環(huán)加成反應(yīng),其中一個(gè)反應(yīng)稱為“點(diǎn)擊反應(yīng)”。該反應(yīng)已成為生物分子(例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、聚糖等)的生物正交標(biāo)記和成像、蛋白質(zhì)組學(xué)和材料科學(xué)中的通用手段。本質(zhì)上,一個(gè)帶有疊氮化物、另一個(gè)帶有張力(strained)環(huán)炔的兩個(gè)獨(dú)立的分子實(shí)體會(huì)通過(guò)稱為張力促進(jìn)的疊氮化物-炔環(huán)加成反應(yīng)(spaac)的反應(yīng)自發(fā)地結(jié)合成一個(gè)分子。用于生物正交標(biāo)記的spaac的動(dòng)力在于分離的環(huán)炔或疊氮化物對(duì)生物官能團(tuán)例如胺、巰基、酸或羰基是完全惰性的,但是其結(jié)合會(huì)發(fā)生快速和不可逆的環(huán)加成反應(yīng)形成穩(wěn)定的三唑綴合物。例如,通過(guò)簡(jiǎn)單地?cái)嚢杷霪B氮基蛋白質(zhì)與環(huán)辛炔綴合物,可將(通過(guò)在營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌中表達(dá)、遺傳工程或化學(xué)轉(zhuǎn)化得到的)疊氮基修飾的蛋白質(zhì)用生物素、熒光團(tuán)、peg-鏈或其他官能團(tuán)容易地標(biāo)記。另外,已經(jīng)通過(guò)化學(xué)指示劑策略證明小尺寸的疊氮化物對(duì)于spaac在特定生物分子成像中的應(yīng)用非常有用。
除疊氮化物外,環(huán)辛炔也顯示出與其他偶極子(例如硝酮和氧化腈)的高反應(yīng)性。例如,張力促進(jìn)的炔-硝酮環(huán)加成反應(yīng)(spanc)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的n-末端修飾。
spaac和spanc環(huán)加成反應(yīng)(方案1)自發(fā)進(jìn)行,因此不存在(金屬)催化劑,并且它們和選定數(shù)量的額外環(huán)加成反應(yīng)也稱為“無(wú)金屬點(diǎn)擊反應(yīng)”。
現(xiàn)有技術(shù)中描述了幾種環(huán)炔及其在生物正交標(biāo)記中的應(yīng)用。us2009/0068738(以引用方式納入本文)涉及經(jīng)修飾的環(huán)炔化合物以及它們用于通過(guò)可在生理?xiàng)l件下實(shí)施的環(huán)加成反應(yīng)修飾生物分子的應(yīng)用。所述環(huán)加成包括使經(jīng)修飾的環(huán)炔(例如二氟化環(huán)辛炔化合物difo、difo2和difo3)與靶生物分子上的疊氮化物部分發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生經(jīng)共價(jià)修飾的生物分子。已發(fā)現(xiàn)氟化物取代對(duì)于與疊氮化物的環(huán)加成具有加速效應(yīng)。例如difo3顯示出顯著提高的可高達(dá)k=76×10-3m-1s-1的反應(yīng)速率常數(shù),而與之相比,未氟化體系的最大值為2.4×10-3m-1s-1。
wo2009/067663(其通過(guò)引用方式納入本文)中公開(kāi)了其中環(huán)辛炔稠合到芳基上的環(huán)辛炔化合物(苯并(benzannulated)體系),并且這些二苯并環(huán)辛炔化合物dibo在與疊氮化物的環(huán)加成中的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)得到進(jìn)一步改進(jìn)(k=0.12m-1s-1)。
vandelft等(chem.commun.2010,46,97–99)(其通過(guò)引用方式納入本文)開(kāi)發(fā)了氮雜二苯并環(huán)辛炔dibac,并且dibac在與疊氮化物的環(huán)加成中顯示出進(jìn)一步改進(jìn)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)(k=0.31m-1s-1)。
最近,bertozzi等(j.am.chem.soc.2010,132,3688–3690)(其通過(guò)引用方式納入本文)報(bào)道了另一種苯并體系:二芳基氮雜環(huán)辛酮barac。通過(guò)將酰胺官能團(tuán)置于環(huán)中,顯著改進(jìn)了barac與疊氮化物的環(huán)加成的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)(k=0.96m-1s-1)。
如pezacki(chem.commun.2010,46,931–933)和vandelft(angew.chem.int.ed.2010,49,3065–3068)所述,還發(fā)現(xiàn)dibo和dibac與硝酮進(jìn)行快速環(huán)加成,其反應(yīng)速率常數(shù)比與疊氮化物的環(huán)加成的反應(yīng)速率常數(shù)高最高達(dá)300倍,所述兩篇文獻(xiàn)均以引用方式納入本文。
但是,在現(xiàn)有技術(shù)中已知的用于生物正交標(biāo)記的環(huán)辛炔探針有幾點(diǎn)缺陷。首先,只有dibac可商購(gòu)獲得,這阻礙了其廣泛應(yīng)用。其合成制備需要高級(jí)的化學(xué)專業(yè)技術(shù)。此外,目前可獲得的探針的合成很耗時(shí)(對(duì)于difo2需要8個(gè)化學(xué)步驟,對(duì)于difo3需要10個(gè)化學(xué)步驟,對(duì)于dibac需要9個(gè)化學(xué)步驟)和/或產(chǎn)率低(對(duì)于dibo總共10%)。第三,dibo和dibac中存在的兩個(gè)苯并芳基部分導(dǎo)致嚴(yán)重的空間位阻以及親脂特性。dibo和dibac的親脂特性可導(dǎo)致通過(guò)范德華相互作用的非特異性蛋白結(jié)合,這是不合乎需要的。
因此,非常需要新的、易得的和具有反應(yīng)活性的生物正交探針用于無(wú)金屬點(diǎn)擊反應(yīng),例如與疊氮化物、硝酮和其他1,3-偶極子的1,3-偶極環(huán)加成。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
在第一個(gè)方面,本發(fā)明涉及式(ia)、(ib)或(ic)的化合物,
其中:
m為0或1;
n為0或8;
p為0或1;
z是n或c(r3),其中r3選自[(l)p-q]、氫、鹵素、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基,所述烷基任選地被一個(gè)或多個(gè)選自o、n和s的雜原子間斷,其中所述烷基、(雜)芳基、烷基(雜)芳基和(雜)芳基烷基獨(dú)立地且任選地被一個(gè)或多個(gè)取代基取代,所述取代基獨(dú)立地選自c1-c12烷基、c2-c12烯基、c2-c12炔基、c3-c12環(huán)烷基、c1-c12烷氧基、c2-c12烯氧基、c2-c12炔氧基、c3-c12環(huán)烷基氧基、鹵素、氨基、氧基和甲硅烷基,其中所述烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和環(huán)烷基氧基任選地被取代,所述烷基、烷氧基、環(huán)烷基和環(huán)烷氧基任選地被一個(gè)或多個(gè)選自o、n和s的雜原子間斷,其中所述甲硅烷基用式(r4)3si-表示,其中r4獨(dú)立地選自c1-c12烷基、c2-c12烯基、c2-c12炔基、c3-c12環(huán)烷基、c1-c12烷氧基、c2-c12烯氧基、c2-c12炔氧基和c3-c12環(huán)烷基氧基,其中所述烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和環(huán)烷基氧基任選地被取代,所述烷基、烷氧基、環(huán)烷基和環(huán)烷氧基任選地被一個(gè)或多個(gè)選自o、n和s的雜原子間斷;
y是o、c(o)或c(r5)2,其中r5獨(dú)立地選自氫、鹵素、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基,所述烷基任選地被一個(gè)或多個(gè)選自o、n和s的雜原子間斷,其中所述烷基、(雜)芳基、烷基(雜)芳基和(雜)芳基烷基任選地被取代;
任選地,當(dāng)m=1時(shí),y和z以及連接y和z的鍵一起形成環(huán)烷基或(雜)芳基,其中所述環(huán)烷基和(雜)芳基任選地被取代,如果y和z形成(雜)芳基,那么–(l)p-q基團(tuán)是(雜)芳基上的取代基;
l是連接基團(tuán),選自直鏈或支鏈c1-c24亞烷基、c2-c24亞烯基、c2-c24亞炔基、c3-c24環(huán)亞烷基、c5-c24環(huán)亞烯基、c8-c24環(huán)亞炔基、c7-c24烷基(雜)亞芳基、c7-c24(雜)芳基亞烷基、c8-c24(雜)芳基亞烯基、c9-c24(雜)芳基亞炔基,所述亞烷基、亞烯基、亞炔基、環(huán)亞烷基、環(huán)亞烯基、環(huán)亞炔基、烷基(雜)亞芳基、(雜)芳基亞烷基、(雜)芳基亞烯基和(雜)芳基亞炔基任選地被一個(gè)或多個(gè)取代基取代,所述取代基獨(dú)立地選自c1-c12烷基、c2-c12烯基、c2-c12炔基、c3-c12環(huán)烷基、c5-c12環(huán)烯基、c8-c12環(huán)炔基、c1-c12烷氧基、c2-c12烯氧基、c2-c12炔氧基、c3-c12環(huán)烷基氧基、鹵素、氨基、氧基和甲硅烷基,其中所述甲硅烷基可用式(r4)3si-表示,其中r4的定義如上所述;
q是選自氫、鹵素、r6、-ch=c(r6)2、-c≡cr6、-[c(r6)2c(r6)2o]q-r6(其中q為1到200)、-cn、-n3、-ncx、-xcn、-xr6、-n(r6)2、-+n(r6)3、-c(x)n(r6)2、-c(r6)2xr6、-c(x)r6、-c(x)xr6、-s(o)r6、-s(o)2r6、-s(o)or6、-s(o)2or6、-s(o)n(r6)2、-s(o)2n(r6)2、-os(o)r6、-os(o)2r6、-os(o)or6、-os(o)2or6、-p(o)(r6)(or6)、-p(o)(or6)2、-op(o)(or6)2、-si(r6)3、-xc(x)r6、-xc(x)xr6、-xc(x)n(r6)2、-n(r6)c(x)r6、-n(r6)c(x)xr6和-n(r6)c(x)n(r6)2的官能團(tuán),其中x是氧或硫并且其中r6獨(dú)立地選自氫、鹵素、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基;
r1獨(dú)立地選自氫、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基;并且
r2獨(dú)立地選自鹵素、-or6、-no2、-cn、-s(o)2r6、c1-c12烷基、c1-c12芳基、c1-c12烷基芳基和c1-c12芳基烷基,其中r6的定義如上所述,并且其中所述烷基、芳基、烷基芳基和芳基烷基任選地被取代。
本發(fā)明還涉及綴合物,例如環(huán)辛炔綴合物,其中式(ia)、(ib)和/或(ic)的化合物通過(guò)官能團(tuán)q綴合到標(biāo)記物。
本發(fā)明的另一方面是提供用于制備通式(ia)、(ib)或(ic)的化合物的方法,該方法包含以下步驟:
(a)將稠合的3元環(huán)或者4元環(huán)引入式(viia)、(viib)或(viic)的環(huán)辛二烯以形成雙環(huán)環(huán)辛烯化合物:
其中:
n=0到8;
r1獨(dú)立地選自氫、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基;并且
r2獨(dú)立地選自鹵素、-or6、-no2、-cn、-s(o)2r6、c1-c12烷基、c1-c12芳基、c1-c12烷基芳基和c1-c12芳基烷基,其中所述烷基、芳基、烷基芳基和芳基烷基任選地被取代,并且其中r6獨(dú)立地選自氫、鹵素、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基,
(b)溴化所得的雙環(huán)環(huán)辛烯化合物以形成雙環(huán)環(huán)辛烷化合物,并且
(c)使所得的雙環(huán)環(huán)辛烷化合物脫溴化氫。
本發(fā)明還涉及修飾靶分子的方法,其中本發(fā)明的綴合物與包含1,3-偶極子或1,3-(雜)二烯的化合物發(fā)生反應(yīng)。
本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的綴合物用于靶分子的生物正交標(biāo)記、成像或修飾(例如表面修飾)的用途。
最后,本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的綴合物并且還包含可藥用載體的組合物。
附圖說(shuō)明
圖1示出了對(duì)疊氮化物標(biāo)記的衣殼蛋白和綴合至alexafluor555的環(huán)辛烷的spaac反應(yīng)(左)和空白反應(yīng)(右)的sds-page分析。
圖2示出了用綴合至alexafluor555的環(huán)辛烷官能化的衣殼蛋白的esi-tof質(zhì)譜圖。
圖3示出了對(duì)用綴合至alexafluor555的環(huán)辛烷官能化的衣殼蛋白的fplc分析。
圖4示出了代謝整合ac4mannaz、用dibo-或bcn-生物素標(biāo)記并用alexafluor488-綴合的抗生蛋白鏈菌素檢測(cè)后用流式細(xì)胞儀測(cè)定的完整mv3細(xì)胞的細(xì)胞表面熒光。
圖5示出了代謝整合ac4mannaz、用dibo-或bcn-生物素標(biāo)記并用alexafluor488-綴合的抗生蛋白鏈菌素檢測(cè)后的mv3細(xì)胞的熒光強(qiáng)度和細(xì)胞活力。
圖6示出了預(yù)先在不存在或存在ac4mannaz(50μm)的條件下培養(yǎng)、用dibo-或bcn-生物素標(biāo)記并用alexafluor488-綴合的抗生蛋白鏈菌素檢測(cè)的經(jīng)標(biāo)記細(xì)胞的代表性共聚焦圖像。
具體實(shí)施方式
定義
本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中所用的動(dòng)詞“包含”及其變形以非限制性含義使用,意指包括該詞后面的條目,但不排除未具體提及的條目。
此外,除非上下文中明確表示有且只有一個(gè)要素,否則當(dāng)以不定冠詞“一”或“一個(gè)”涉及一種元素時(shí)不排除存在多于一個(gè)所述要素的可能性。因此,所述不定冠詞“一”或“一個(gè)”通常表示“至少一個(gè)”。
本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中公開(kāi)的化合物可被描述為稠合的環(huán)辛炔化合物,即其中第二個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)稠合到所述環(huán)辛炔部分的環(huán)辛炔化合物。在稠合的環(huán)辛炔化合物中所述環(huán)辛炔部分的三鍵可位于三個(gè)可能的位置(即所述環(huán)辛炔部分的2、3或4位(依據(jù)“iupacnomenclatureoforganicchemistry”,rulea31.2編號(hào)))中的任何一個(gè)。本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中對(duì)于任何稠合的環(huán)辛炔化合物的描述均意在包括所述環(huán)辛炔部分的所有三種單獨(dú)的區(qū)域異構(gòu)體(regioisomer)。
本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中公開(kāi)的化合物可包含一種或多種不對(duì)稱中心,并且所述化合物可能存在不同的非對(duì)映異構(gòu)體和/或?qū)τ钞悩?gòu)體。除非另有說(shuō)明,否則本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中對(duì)任何化合物的描述均意在包括所有非對(duì)映異構(gòu)體及其混合物。此外,除非另有說(shuō)明,否則本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中對(duì)任何化合物的描述均意在包括所述單獨(dú)的對(duì)映異構(gòu)體以及所述對(duì)映異構(gòu)體的任意混合物(外消旋的或相反)??梢岳斫獾氖?,當(dāng)將化合物的結(jié)構(gòu)描述為具體的對(duì)應(yīng)異構(gòu)體時(shí),本申請(qǐng)的發(fā)明不限于所述具體的對(duì)映異構(gòu)體。
所述化合物可以不同的互變異構(gòu)形式存在。除非另有說(shuō)明,本發(fā)明的化合物意在包括所有的互變異構(gòu)形式。
本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中公開(kāi)的化合物還可存在外型(exo)和內(nèi)型(endo)區(qū)域異構(gòu)體。除非另有說(shuō)明,否則本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中對(duì)任何化合物的描述意在包括化合物的單獨(dú)的外型區(qū)域異構(gòu)體和單獨(dú)的內(nèi)型區(qū)域異構(gòu)體,及其混合物。
此外,本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中公開(kāi)的化合物還可存在順式和反式異構(gòu)體。除非另有說(shuō)明,否則本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中對(duì)任何化合物的描述意在包括化合物的單獨(dú)的順式異構(gòu)體和單獨(dú)的反式異構(gòu)體,及其混合物。作為實(shí)例,可以理解的是,當(dāng)將化合物的結(jié)構(gòu)描述為順式異構(gòu)體時(shí),本申請(qǐng)的發(fā)明不排除其相應(yīng)的反式異構(gòu)體或所述順式異構(gòu)體和反式異構(gòu)體的混合物。
未被取代的烷基具有通式cnh2n+1,并且可為直鏈或支鏈。未被取代的烷基還可包含環(huán)狀部分并因此具有隨之而來(lái)的通式cnh2n-1。任選地,所述烷基可被本文中進(jìn)一步具體提及的一種或多種取代基取代。合適的烷基的實(shí)例包括,但不限于,甲基、乙基、丙基、2-丙基、叔丁基、1-己基、1-十二烷基等。
未被取代的烯基具有通式cnh2n-1,并且可以是直鏈或者支鏈。合適的烯基的實(shí)例包括但不限于,乙烯基、丙烯基、異丙烯基、丁烯基、戊烯基、癸烯基、十八烯基和二十碳烯基等。未被取代的烯基還可包含環(huán)狀部分并因此具有隨之而來(lái)的通式cnh2n-3。
未被取代的烯具有通式cnh2n,而未被取代的炔具有通式cnh2n-2。
芳基包含至少6個(gè)碳原子,并可包括單環(huán)、雙環(huán)和多環(huán)的結(jié)構(gòu)。可任選地,所述芳基可被本文中進(jìn)一步具體提及的一種或多種取代基取代。芳基的實(shí)例包括例如苯基、萘基、蒽基等的基團(tuán)。
芳基烷基和烷基芳基包含至少7個(gè)碳原子,并可包括單環(huán)和雙環(huán)的結(jié)構(gòu)。任選地,所述芳基可被本文中進(jìn)一步具體提及的一種或多種取代基取代。芳基烷基為例如苯甲基等。烷基芳基為例如4-叔丁基苯基等。
將芳基表示為(雜)芳基時(shí),該符號(hào)意在包括芳基和雜芳基。同樣地,烷基(雜)芳基意在包括烷基芳基和烷基雜芳基,并且(雜)芳基烷基意在包括芳基烷基和雜芳基烷基。
雜芳基包含1到4個(gè)選自氧、氮和硫的雜原子。
稠合的環(huán)辛炔化合物
基于環(huán)炔的反應(yīng)性隨著環(huán)尺寸的減小而增加這一事實(shí),具有小于8個(gè)碳原子的環(huán)炔綴合物在生物正交化學(xué)中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。不幸的是,由于偏離理想的180°c–c·c角度導(dǎo)致的張力能增加,到目前為止尚不能以純的形式分離環(huán)庚炔及更小的環(huán)。
增加張力能的另一種方式是通過(guò)將環(huán)辛炔苯并至芳基(該策略在wo2009/067663中用于dibo)。隨后可通過(guò)在所述環(huán)中引入另一個(gè)sp2-型原子進(jìn)一步提高張力能(該方法由vandelft用于dibac并由bertozzi用于barac)。但是,如上所述,環(huán)辛炔中存在兩個(gè)芳基部分不僅產(chǎn)生了嚴(yán)重的空間位阻,而且增加了所述環(huán)辛炔化合物親脂特性,這是不想要的。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種非常有效的誘導(dǎo)額外的環(huán)張力的方法,其包括將環(huán)辛炔稠合到3元環(huán)或者4元環(huán)上,得到稠合的環(huán)辛炔化合物,更具體地分別得到雙環(huán)[6.1.0]壬炔和雙環(huán)[6.2.0]癸炔體系。這些雙環(huán)體系出乎意料地非常適合作為生物正交探針,因?yàn)樗鼈冊(cè)谂c1,3-偶極子的(3+2)環(huán)加成中和與1,3-(雜)二烯的(雜)diels-alder反應(yīng)中兼具相對(duì)的穩(wěn)定性與高反應(yīng)性。此外,除產(chǎn)生環(huán)張力之外,所述稠合的3元環(huán)或者4元環(huán)結(jié)構(gòu)也極其適合用于放置綴合官能團(tuán)和/或標(biāo)記物上的柄(handle),并且可被便利地官能化用于例如靶分子的生物正交標(biāo)記、成像和/或修飾(例如表面修飾)的應(yīng)用。
因此在第一方面,本發(fā)明涉及通式(ia)、(ib)或(ic)的化合物,
其中:
m為0或1;
n為0到8;
p為0或1;
z是n或c(r3),其中r3選自[(l)p-q]、氫、鹵素、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基,所述烷基任選地被一個(gè)或多個(gè)選自o、n和s的雜原子間斷,其中所述烷基、(雜)芳基、烷基(雜)芳基和(雜)芳基烷基獨(dú)立地且任選地被一個(gè)或多個(gè)取代基取代,所述取代基獨(dú)立地選自c1-c12烷基、c2-c12烯基、c2-c12炔基、c3-c12環(huán)烷基、c1-c12烷氧基、c2-c12烯氧基、c2-c12炔氧基、c3-c12環(huán)烷基氧基、鹵素、氨基、氧基和甲硅烷基,其中所述烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和環(huán)烷基氧基任選地被取代,所述烷基、烷氧基、環(huán)烷基和環(huán)烷氧基任選地被一個(gè)或多個(gè)選自o、n和s的雜原子間斷,其中所述甲硅烷基用式(r4)3si-表示,其中r4獨(dú)立地選自c1-c12烷基、c2-c12烯基、c2-c12炔基、c3-c12環(huán)烷基、c1-c12烷氧基、c2-c12烯氧基、c2-c12炔氧基和c3-c12環(huán)烷基氧基,其中所述烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和環(huán)烷基氧基任選地被取代,所述烷基、烷氧基、環(huán)烷基和環(huán)烷氧基任選地被一個(gè)或多個(gè)選自o、n和s的雜原子間斷;
y是o、c(o)或c(r5)2,其中r5獨(dú)立地選自氫、鹵素、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基,所述烷基任選地被一個(gè)或多個(gè)選自o、n和s的雜原子間斷,其中所述烷基、(雜)芳基、烷基(雜)芳基和(雜)芳基烷基任選地被取代;
任選地,當(dāng)m=1時(shí),y和z以及連接y和z的鍵一起形成環(huán)烷基或(雜)芳基,其中所述環(huán)烷基和(雜)芳基任選地被取代,如果y和z形成(雜)芳基,那么–(l)p-q基團(tuán)是(雜)芳基上的取代基;
l是連接基團(tuán),其選自直鏈或支鏈的c1-c24亞烷基、c2-c24亞烯基、c2-c24亞炔基、c3-c24環(huán)亞烷基、c5-c24環(huán)亞烯基、c8-c24環(huán)亞炔基、c7-c24烷基(雜)亞芳基、c7-c24(雜)芳基亞烷基、c8-c24(雜)芳基亞烯基、c9-c24(雜)芳基亞炔基,所述亞烷基、亞烯基、亞炔基、環(huán)亞烷基、環(huán)亞烯基、環(huán)亞炔基、烷基(雜)亞芳基、(雜)芳基亞烷基、(雜)芳基亞烯基和(雜)芳基亞炔基任選地被一個(gè)或多個(gè)取代基取代,所述取代基獨(dú)立地選自c1-c12烷基、c2-c12烯基、c2-c12炔基、c3-c12環(huán)烷基、c5-c12環(huán)烯基、c8-c12環(huán)炔基、c1-c12烷氧基、c2-c12烯氧基、c2-c12炔氧基、c3-c12環(huán)烷基氧基、鹵素、氨基、氧基和甲硅烷基,其中所述甲硅烷基可用式(r4)3si-表示,其中r4的定義如上所述;
q是選自氫、鹵素、r6、-ch=c(r6)2、-c≡cr6、-[c(r6)2c(r6)2o]q-r6(其中q為1到200)、-cn、-n3、-ncx、-xcn、-xr6、-n(r6)2、-+n(r6)3、-c(x)n(r6)2、-c(r6)2xr6、-c(x)r6、-c(x)xr6、-s(o)r6、-s(o)2r6、-s(o)or6、-s(o)2or6、-s(o)n(r6)2、-s(o)2n(r6)2、-os(o)r6、-os(o)2r6、-os(o)or6、-os(o)2or6、-p(o)(r6)(or6)、-p(o)(or6)2、-op(o)(or6)2、-si(r6)3、-xc(x)r6、-xc(x)xr6、-xc(x)n(r6)2、-n(r6)c(x)r6、-n(r6)c(x)xr6和-n(r6)c(x)n(r6)2的官能團(tuán),其中x是氧或硫并且其中r6獨(dú)立地選自氫、鹵素、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基;
r1獨(dú)立地選自氫、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基;并且
r2獨(dú)立地選自鹵素、-or6、-no2、-cn、-s(o)2r6、c1-c12烷基、c1-c12芳基、c1-c12烷基芳基和c1-c12芳基烷基,其中r6的定義如上所述并且其中所述烷基、芳基、烷基芳基和芳基烷基任選地被取代。
本發(fā)明所述稠合的環(huán)辛炔的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它們易于合成。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是這些分子的多個(gè)部分可以進(jìn)行簡(jiǎn)單、直接的修飾。
優(yōu)選式(ia)的所述稠合環(huán)辛炔化合物。該化合物中,三鍵位于所述環(huán)辛炔部分的4-位,即與所述稠合的3元環(huán)或4元環(huán)相對(duì)的位置。根據(jù)所述環(huán)辛炔化合物上取代基的性質(zhì),這可能導(dǎo)致(ia)的可能的區(qū)域異構(gòu)體的數(shù)目減少。
在式(ia)、(ib)和(ic)的化合物中,z上的取代基–[(l)p-q]可位于相對(duì)于所述環(huán)辛炔環(huán)的外(exo)位或內(nèi)(endo)位。兩個(gè)r1-取代基相對(duì)于彼此可為順式或反式的位置。
優(yōu)選地,q選自-cn、-n3、-ncx、-xcn、-xr6、-n(r6)2、-+n(r6)3、-c(x)n(r6)2、-c(r6)2xr6、-c(x)r6、-c(x)xr6、-xc(x)r6、-xc(x)xr6、-xc(x)n(r6)2、-n(r6)c(x)r6、-n(r6)c(x)xr6和-n(r6)c(x)n(r6)2,其中x和r6的定義如上所述。更優(yōu)選地,x是氧。最優(yōu)選地,q選自-or6、-n(r6)2、-+n(r6)3、-c(o)n(r6)2、-c(o)or6、-oc(o)r6、-oc(o)or6、-oc(o)n(r6)2、-n(r6)c(o)r6、-n(r6)c(o)or6和-n(r6)c(o)n(r6)2。此外,官能團(tuán)q可任選地被掩蔽或保護(hù)。所述r6可相互獨(dú)立地進(jìn)行選擇,也就是說(shuō)例如-n(r6)2取代基中的2個(gè)r6基團(tuán)可彼此不同。
在一個(gè)實(shí)施方案中,p為0,即q直接鍵合到z。在另一個(gè)實(shí)施方案中,p為1。在另一個(gè)實(shí)施方案中,p為1并且l是ch2。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,r1是氫。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,n為0。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,r2是吸電子基團(tuán),即hammett取代常數(shù)σ為正值的基團(tuán)。合適的吸電子基團(tuán)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的,并且包括例如鹵素(特別為氟)、-or6、-no2、-cn、-s(o)2r6、取代的c1-c12烷基、取代的c1-c12芳基或取代的c1-c12烷基芳基,其中所述取代基是吸電子基團(tuán)。優(yōu)選地,所述取代的烷基、芳基和烷基芳基是氟代c1-c12烷基(例如-cf3)、氟代c1-c12芳基(例如-c6f5)、或氟代c1-c12烷基芳基(例如-[3,5-(cf3)2(c6h3)])。
m=0且z=cr3的化合物
本發(fā)明涉及的一類具體的化合物是式(ia)、(ib)或(ic)類的化合物,其中所述環(huán)辛炔部分稠合到3元環(huán)結(jié)構(gòu)。因此,在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,如上所定義,m為0。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,z是c(r3),其中r3如上所定義。因此,本發(fā)明還涉及式(ia)、(ib)或(ic)的化合物,其中所述化合物具有式(iia)、(iib)或(iic):
其中n、p、r1、r2、r3、l和q如上述式(ia)、(ib)和(ic)的化合物中所定義。
如上所述,式(iia)、(iib)和(iic)的化合物中的取代基–[(l)p-q]可位于相對(duì)于所述環(huán)辛炔環(huán)的外或內(nèi)位,并且兩個(gè)r1取代基相對(duì)于彼此可位于順式或反式位置。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,r1取代基為順式位置。
在一個(gè)實(shí)施方案中,p為0,即q直接鍵合到環(huán)丙基環(huán)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,p為1。在另一個(gè)實(shí)施方案中,p為1并且l是ch2。
同樣在式(iia)、(iib)或(iic)的化合物中,當(dāng)p為0和p為1時(shí),q優(yōu)選地選自-cn、-n3、-ncx、-xcn、-xr6、-n(r6)2、-+n(r6)3、-c(x)n(r6)2、-c(r6)2xr6、-c(x)r6、-c(x)xr6、-xc(x)r6、-xc(x)xr6、-xc(x)n(r6)2、-n(r6)c(x)r6、-n(r6)c(x)xr6和-n(r6)c(x)n(r6)2,其中x和r6的定義如上所述。更優(yōu)選地,x是氧。最優(yōu)選地,q選自-or6、-n(r6)2、-+n(r6)3、-c(o)n(r6)2、-c(o)or6、-oc(o)r6、-oc(o)or6、-oc(o)n(r6)2、-n(r6)c(o)r6、-n(r6)c(o)or6和-n(r6)c(o)n(r6)2。此外,官能團(tuán)q可任選地被掩蔽或保護(hù)。r6基團(tuán)可相互獨(dú)立地進(jìn)行選擇,也就是說(shuō)例如-n(r6)2取代基中的2個(gè)r6基團(tuán)可彼此不同。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,q是–or6,優(yōu)選為–oh。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,q是-c(o)or6。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,r3是氫或[(l)p-q]。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,r1是氫。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,n為0。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,r2是吸電子基團(tuán),即hammett取代常數(shù)σ為正值的基團(tuán)。合適的吸電子基團(tuán)為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的,并且包括例如鹵素(特別為氟)、-or6、-no2、-cn、-s(o)2r6、取代的c1-c12烷基、取代的c1-c12芳基或取代的c1-c12烷基芳基,其中所述取代基是吸電子基團(tuán)。優(yōu)選地,所述取代的烷基、芳基和烷基芳基是氟代c1-c12烷基(例如-cf3)、氟代c1-c12芳基(例如-c6f5)、或氟代c1-c12烷基芳基(例如-[3,5-(cf3)2(c6h3)])。
在式(iia)、(iib)和(iic)的化合物中,優(yōu)選式(iia)的化合物,因?yàn)樗鼈兛删哂袑?duì)稱的軸或平面,因而減少可能形成的潛在區(qū)域異構(gòu)體的數(shù)目。
特別優(yōu)選其中p為1、l是ch2、q是–oh、r1是氫、r3是氫或[(l)p-q]并且n為0的實(shí)施方案。
m=0且z=n的化合物
本發(fā)明還涉及通式為(ia)、(ib)或(ic)的化合物,其中m為0且z是n。這些化合物具有通式(iiia)、(iiib)或(iiic):
其中n、p、r1、r2、l和q如上式(ia)、(ib)和(ic)的化合物中所定義。
兩個(gè)r1取代基相對(duì)于彼此可位于順式或反式的位置。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述r1取代基位于順式位置。
在一個(gè)實(shí)施方案中,p為0,即q直接鍵合到n。在另一個(gè)實(shí)施方案中,p為1。在另一個(gè)實(shí)施方案中,p為1并且l是ch2。
同樣在式(iiia)、(iiib)或(iiic)的化合物中,當(dāng)p為0和p為1時(shí),q優(yōu)選地選自-cn、-n3、-ncx、-xcn、-xr6、-n(r6)2、-+n(r6)3、-c(x)n(r6)2、-c(r6)2xr6、-c(x)r6、-c(x)xr6、-xc(x)r6、-xc(x)xr6、-xc(x)n(r6)2、-n(r6)c(x)r6、-n(r6)c(x)xr6和-n(r6)c(x)n(r6)2,其中x和r6的定義如上所述。更優(yōu)選地,x是氧。最優(yōu)選地,q選自-or6、-n(r6)2、-+n(r6)3、-c(o)n(r6)2、-c(o)or6、-oc(o)r6、-oc(o)or6、-oc(o)n(r6)2、-n(r6)c(o)r6、-n(r6)c(o)or6和-n(r6)c(o)n(r6)2。此外,官能團(tuán)q可任選地被掩蔽或保護(hù)。所述r6可相互獨(dú)立地進(jìn)行選擇,也就是說(shuō)例如-n(r6)2取代基中的2個(gè)r6基團(tuán)可彼此不同。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,r1是氫。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,n為0。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,r2是吸電子基團(tuán),即hammett取代常數(shù)σ為正值的基團(tuán)。合適的吸電子基團(tuán)為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的,并且包括例如鹵素(特別為氟)、-or6、-no2、-cn、-s(o)2r6、取代的c1-c12烷基、取代的c1-c12芳基或取代的c1-c12烷基芳基,其中所述取代基是吸電子基團(tuán)。優(yōu)選地,所述取代的烷基、芳基和烷基芳基是氟代c1-c12烷基(例如-cf3)、氟代c1-c12芳基(例如-c6f5)、或氟代c1-c12烷基芳基(例如-[3,5-(cf3)2(c6h3)])。
在式(iiia)、(iiib)和(iiic)的化合物中,優(yōu)選式(iiia)的化合物,因?yàn)樗鼈兙哂袑?duì)稱元素,因而減少可能形成的潛在區(qū)域異構(gòu)體的數(shù)目。
m=1且z=c(r3)的化合物
本發(fā)明還涉及通式為(ia)、(ib)或(ic)的化合物,其中m為1且z是c(r3),且這些化合物具有通式(iva)、(ivb)或(ivc):
其中y是o、c(o)或c(r5)2,并且n、p、l、q、r1、r2、r3和r5如上所定義。
同樣在式(iva)、(ivb)和(ivc)的化合物中,取代基–[(l)p-q]可位于相對(duì)于所述環(huán)辛炔環(huán)的外或內(nèi)位,并且兩個(gè)r1取代基相對(duì)于彼此可位于順式或反式的位置。
在如上所示的式(iva)、(ivb)和(ivc)的化合物中,所述z-基團(tuán)(即鍵合到r3和-[(l)p-q]取代基的c-原子)位于所述稠合的環(huán)辛炔化合物的9-位。但是,也包括(ivb)和(ivc)的區(qū)域異構(gòu)體,其中z-基團(tuán)位于所述稠合的雙環(huán)癸炔的10-位,由此所述-[(l)p-q]取代基可位于外或內(nèi)位置。
在一個(gè)實(shí)施方案中,p為0,即q直接鍵合到環(huán)丁基環(huán)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,p為1。在另一個(gè)實(shí)施方案中,p為1并且l是ch2。
同樣在式(iva)、(ivb)或(ivc)的化合物中,當(dāng)p為0和p為1時(shí),q優(yōu)選地選自-cn、-n3、-ncx、-xcn、-xr6、-n(r6)2、-+n(r6)3、-c(x)n(r6)2、-c(r6)2xr6、-c(x)r6、-c(x)xr6、-xc(x)r6、-xc(x)xr6、-xc(x)n(r6)2、-n(r6)c(x)r6、-n(r6)c(x)xr6和-n(r6)c(x)n(r6)2,其中x和r6的定義如上所述。更優(yōu)選地,x是氧。最優(yōu)選地,q選自-or6、-n(r6)2、-+n(r6)3、-c(o)n(r6)2、-c(o)or6、-oc(o)r6、-oc(o)or6、-oc(o)n(r6)2、-n(r6)c(o)r6、-n(r6)c(o)or6和-n(r6)c(o)n(r6)2。此外,官能團(tuán)q可任選地被掩蔽或保護(hù)。所述r6可相互獨(dú)立地進(jìn)行選擇,也就是說(shuō)例如-n(r6)2取代基中的2個(gè)r6基團(tuán)可彼此不同。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,y是o。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,y是c(o)。當(dāng)y是o和y是c(o)時(shí),優(yōu)選r1為氫。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,n為0。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,r2是吸電子基團(tuán),即hammett取代常數(shù)σ為正值的基團(tuán)。合適的吸電子基團(tuán)為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的,并且包括例如鹵素(特別為氟)、-or6、-no2、-cn、-s(o)2r6、取代的c1-c12烷基、取代的c1-c12芳基或取代的c1-c12烷基芳基,其中所述取代基是吸電子基團(tuán)。優(yōu)選地,所述取代的烷基、芳基和烷基芳基是氟代c1-c12烷基(例如-cf3)、氟代c1-c12芳基(例如-c6f5)、或氟代c1-c12烷基芳基(例如-[3,5-(cf3)2(c6h3)])。
優(yōu)選式(iva)的化合物。在該化合物中,三鍵位于所述環(huán)辛炔部分的4-位,即與稠合的環(huán)丁基環(huán)相對(duì)。
m=1且z=n的化合物
本發(fā)明還涉及通式為(ia)、(ib)或(ic)的化合物,其中m為1且z是n。這些化合物具有通式(va)、(vb)或(vc):
其中y是c(o)或c(r5)2,并且n、p、l、q、r1、r2和r5如上所定義。
在此處所示的式(va)、(vb)和(vc)的化合物中,所述4元環(huán)的n-原子位于所述雙環(huán)體系的9-位。但是,本發(fā)明還涉及式(vb)或(vc)的區(qū)域異構(gòu)體,其中所述4元環(huán)的n-原子位于所述雙環(huán)體系的10-位。此外,兩個(gè)r1取代基相對(duì)于彼此可位于順式或反式的位置。
在一個(gè)實(shí)施方案中,p為0,即q直接鍵合到所述4元環(huán)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,p為1。在另一個(gè)實(shí)施方案中,p為1并且l是ch2。
同樣在式(va)、(vb)或(vc)的化合物中,當(dāng)p為0和p為1時(shí),q優(yōu)選地選自-cn、-n3、-ncx、-xcn、-xr6、-n(r6)2、-+n(r6)3、-c(x)n(r6)2、-c(r6)2xr6、-c(x)r6、-c(x)xr6、-xc(x)r6、-xc(x)xr6、-xc(x)n(r6)2、-n(r6)c(x)r6、-n(r6)c(x)xr6和-n(r6)c(x)n(r6)2,其中x和r6的定義如上所述。更優(yōu)選地,x是氧。最優(yōu)選地,q選自-or6、-n(r6)2、-+n(r6)3、-c(o)n(r6)2、-c(o)or6、-oc(o)r6、-oc(o)or6、-oc(o)n(r6)2、-n(r6)c(o)r6、-n(r6)c(o)or6和-n(r6)c(o)n(r6)2。此外,官能團(tuán)q可任選地被掩蔽或保護(hù)。所述r6可相互獨(dú)立地進(jìn)行選擇,也就是說(shuō)例如-n(r6)2取代基中的2個(gè)r6基團(tuán)可彼此不同。
如果y是c(r5)2,r5優(yōu)選地為氫。當(dāng)y是c(r5)2和y是c(o)時(shí),優(yōu)選r1為氫。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,n為0。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,r2是吸電子基團(tuán),即hammett取代常數(shù)σ為正值的基團(tuán)。合適的吸電子基團(tuán)為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的,并且包括例如鹵素(特別為氟)、-or6、-no2、-cn、-s(o)2r6、取代的c1-c12烷基、取代的c1-c12芳基或取代的c1-c12烷基芳基,其中所述取代基是吸電子基團(tuán)。優(yōu)選地,所述取代的烷基、芳基和烷基芳基是氟代c1-c12烷基(例如-cf3)、氟代c1-c12芳基(例如-c6f5)、或氟代c1-c12烷基芳基(例如-[3,5-(cf3)2(c6h3)])。
如上所述,優(yōu)選式(va)的化合物,其中三鍵位于所述環(huán)辛炔部分的4-位,即與所述稠合的環(huán)丁基環(huán)相對(duì)。
m=1且y和z形成環(huán)狀烷基或(雜)芳基的化合物
本發(fā)明還涉及通式為(ia)、(ib)或(ic)的化合物,其中m為1時(shí),y和z以及連接y和z的鍵一起形成環(huán)狀烷基或(雜)芳基,其中所述環(huán)烷基和(雜)芳基任選地被取代,如果y和z形成(雜)芳基,那么–(l)p-q基團(tuán)為(雜)芳基上的取代基。
所述環(huán)狀基團(tuán)優(yōu)選為芳基,特別為苯并芳基,如在式(via)、(vib)和(vic)中:
其中p、n、r1、r2、l和q如上所定義。
-(l)p-q取代基可位于所述苯并芳基的鄰位或間位,并且在式(via)、(vib)和(vic)的化合物中,r1-取代基相對(duì)于彼此可位于順式或反式的位置。
在一個(gè)實(shí)施方案中,p為0,即q直接鍵合到所述芳基。在另一個(gè)實(shí)施方案中,p為1。在另一個(gè)實(shí)施方案中,p為1并且l是ch2。
當(dāng)p為0和p為1時(shí),q優(yōu)選地選自-cn、-n3、-ncx、-xcn、-xr6、-n(r6)2、-+n(r6)3、-c(x)n(r6)2、-c(r6)2xr6、-c(x)r6、-c(x)xr6、-xc(x)r6、-xc(x)xr6、-xc(x)n(r6)2、-n(r6)c(x)r6、-n(r6)c(x)xr6和-n(r6)c(x)n(r6)2,其中x和r6的定義如上所述。更優(yōu)選地,x是氧。最優(yōu)選地,q選自-or6、-n(r6)2、-+n(r6)3、-c(o)n(r6)2、-c(o)or6、-oc(o)r6、-oc(o)or6、-oc(o)n(r6)2、-n(r6)c(o)r6、-n(r6)c(o)or6和-n(r6)c(o)n(r6)2。此外,官能團(tuán)q可任選地被掩蔽或保護(hù)。所述r6可相互獨(dú)立地進(jìn)行選擇,這是指例如-n(r6)2取代基中的2個(gè)r6基團(tuán)可彼此不同。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,r1是氫。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,n為0。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,r2是吸電子基團(tuán),即hammett取代常數(shù)σ為正值的基團(tuán)。合適的吸電子基團(tuán)為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的,并且包括例如鹵素(特別為氟)、-or6、-no2、-cn、-s(o)2r6、取代的c1-c12烷基、取代的c1-c12芳基或取代的c1-c12烷基芳基,其中所述取代基是吸電子基團(tuán)。優(yōu)選地,所述取代的烷基、芳基和烷基芳基是氟代c1-c12烷基(例如-cf3)、氟代c1-c12芳基(例如-c6f5)、或氟代c1-c12烷基芳基(例如-[3,5-(cf3)2(c6h3)])。
如上所述,優(yōu)選式(via)的化合物,其中三鍵位于所述環(huán)辛炔部分的4-位。
綴合物
本發(fā)明所述稠合的環(huán)辛炔化合物非常適合用于無(wú)金屬點(diǎn)擊反應(yīng)中,因此這些化合物在例如多種靶分子的生物正交標(biāo)記、成像和/或修飾(包括表面修飾)的應(yīng)用中是通用手段。本發(fā)明的一個(gè)方面提供綴合物,其中本發(fā)明的式(ia)、(ib)和/或(ic)的化合物通過(guò)官能團(tuán)q綴合到標(biāo)記物。
術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記物”是指可綴合到本發(fā)明的式(ia)、(ib)和(ic)的化合物的任何識(shí)別標(biāo)簽。本領(lǐng)域已知有大量標(biāo)記物,可用于多種不同的用途。根據(jù)具體的用途,可選擇適合該具體用途的標(biāo)記物。適用于具體用途的適合標(biāo)記物為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的,并且包括但不限于,所有種類的熒光團(tuán)、生物素、聚乙二醇(peg)鏈、聚丙二醇(ppg)鏈、混合的聚乙二醇/聚丙二醇鏈、放射性同位素、類固醇、藥用化合物、脂質(zhì)、肽、聚糖(包括低聚糖和多糖)、核苷酸(包括寡核苷酸和多核苷酸)以及肽標(biāo)簽。適合的熒光團(tuán)的實(shí)例為例如所有種類的alexafluor(例如alexafluor555)、花青染料(例如cy3或cy5)、香豆素衍生物、熒光素、羅丹明、別藻藍(lán)蛋白、色霉素等。適合的肽標(biāo)簽的實(shí)例包括flag或his標(biāo)簽。適合的聚糖的一個(gè)實(shí)例是刀豆素。優(yōu)選地,所述標(biāo)記物選自熒光團(tuán)、生物素、聚乙二醇鏈、聚丙二醇鏈、混合的聚乙二醇/聚丙二醇鏈、放射性同位素、類固醇、藥用化合物、脂質(zhì)、肽、聚糖、核苷酸和肽標(biāo)簽。
官能團(tuán)q可直接連接到所述標(biāo)記物或者通過(guò)連接體(linker)或連接單元(linkingunit)間接連接到所述標(biāo)記物。連接單元是本領(lǐng)域中公知的,其具有的一般結(jié)構(gòu)為q-s-q,其中q如上所定義,并且s選自直鏈或支鏈c1-c200亞烷基、c2-c200亞烯基、c2-c200亞炔基、c3-c200環(huán)亞烷基、c5-c200環(huán)亞烯基、c8-c200環(huán)亞炔基、c7-c200烷基亞芳基、c7-c200芳基亞烷基、c8-c200芳基亞烯基、c9-c200芳基亞炔基。任選地,所述亞烷基、亞烯基、亞炔基、環(huán)亞烷基、環(huán)亞烯基、環(huán)亞炔基、烷基亞芳基、芳基亞烷基、芳基亞烯基、芳基亞炔基可被取代,并且任選地所述基團(tuán)可被一個(gè)或多個(gè)雜原子(優(yōu)選為1到100個(gè)雜原子)間斷,所述雜原子優(yōu)選地選自o、s和nr6,其中r6如上所定義。最優(yōu)選地,所述雜原子是o。
合適的連接單元的實(shí)例包括但不限于,(聚)乙二醇二胺(例如1,8-二氨基-3,6-二氧雜辛烷或含較長(zhǎng)的乙二醇鏈的等價(jià)物)、聚乙二醇或聚環(huán)氧乙烷鏈、聚丙二醇或聚環(huán)氧丙烷鏈、1,x-二氨基烷(其中x是所述烷中的碳原子數(shù))等。另一類合適的連接體包含可切割連接體??汕懈钸B接體是本領(lǐng)域中公知的。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及綴合物,其中式(iia)、(iib)和/或(iic)的化合物通過(guò)官能團(tuán)q綴合到標(biāo)記物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述式(iia)、(iib)和/或(iic)的綴合化合物是p為1并且l是ch2。r1和/或r3優(yōu)選地為h。在另一個(gè)實(shí)施方案中,n為0(q、n、p、l、r1和r3如上所定義)。最優(yōu)選地,p為1、l是ch2、r1是h、r3是h并且n為0。
在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及綴合物,其中式(iiia)、(iiib)和/或(iiic)的化合物通過(guò)官能團(tuán)q綴合到標(biāo)記物。在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述式(iiia)、(iiib)和/或(iiic)的綴合化合物中p為1并且l是ch2。在另一個(gè)實(shí)施方案中,p為0,因此官能團(tuán)q直接鍵合到n-原子。r1優(yōu)選地為h。在另一個(gè)實(shí)施方案中,n為0(q、n、p、l、r1和r3如上所定義)。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中,p為1、l是ch2、r1是h并且n為0。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中,p為0、r1是h并且n為0。
在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及綴合物,其中式(iva)、(ivb)和/或(ivc)的化合物通過(guò)官能團(tuán)q綴合到標(biāo)記物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述式(iva)、(ivb)和/或(ivc)的綴合化合物中p為1并且l是ch2。r1和/或r3優(yōu)選地為h,并且y優(yōu)選地為c(o)或o。在另一個(gè)實(shí)施方案中,n為0(q、n、p、l、r1和r3如上所定義)。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中,y是o或c(o)、p為1、l是ch2、r1是h、r3是h并且n為0。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中,y是o或c(o)、p為0、r1是h、r3是h并且n為0。
此外,本發(fā)明涉及綴合物,其中式(va)、(vb)和/或(vc)的化合物通過(guò)官能團(tuán)q綴合到標(biāo)記物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述式(va)、(vb)和/或(vc)的綴合化合物中p為1并且l是ch2。r1優(yōu)選地為h。y優(yōu)選地為c(o)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,n為0(q、n、p、l、y、r1和r3如上所定義)。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中,y是c(o)、p為1、l是ch2、r1是h并且n為0。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中,y是c(o)、p為0、r1是h并且n為0。
本發(fā)明還涉及綴合物,其中式(via)、(vib)和/或(vic)的化合物通過(guò)官能團(tuán)q綴合到標(biāo)記物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,r1是h。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,p為0,即q直接鍵合到芳基。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的綴合物用于靶分子的生物正交標(biāo)記、成像或修飾(例如表面修飾)的用途。
合成方法
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供式(ia)、(ib)和(ic)的化合物的合成方法。本發(fā)明因此涉及制備通式(ia)、(ib)或(ic)的化合物的方法,該方法包括如下步驟:
(a)將稠合的3元環(huán)或4元環(huán)引入式(viia)、(viib)或(viic)的環(huán)辛二烯以形成雙環(huán)環(huán)辛烯化合物:
其中:
n=0到8;
r1獨(dú)立地選自氫、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基;并且
r2獨(dú)立地選自鹵素、-or6、-no2、-cn、-s(o)2r6、c1-c12烷基、c1-c12芳基、c1-c12烷基芳基和c1-c12芳基烷基,其中所述烷基、芳基、烷基芳基和芳基烷基任選地被取代,并且其中r6獨(dú)立地選自氫、鹵素、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基,
(b)溴化所得的雙環(huán)環(huán)辛烯化合物以形成雙環(huán)環(huán)辛烷化合物,并且
(c)使所得的雙環(huán)環(huán)辛烷化合物脫溴化氫以形成通式(ia)、(ib)或(ic)的化合物。
步驟(a)中所述式(viia)、(viib)或(viic)的環(huán)辛二烯可以是順,順-環(huán)辛二烯或順,反-環(huán)辛二烯。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述環(huán)辛二烯是順,順-環(huán)辛二烯。在第二個(gè)實(shí)施方案中,所述環(huán)辛二烯是順,反-環(huán)辛二烯。也就是說(shuō),含r1-取代基的雙鍵可具有e-或z-構(gòu)象。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,r1是h。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,n為0。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,r1是h且n為0。
官能團(tuán)q可在所述合成方法中的任意點(diǎn)引入。例如,可在步驟(a)(形成所述雙環(huán)環(huán)辛烯化合物)過(guò)程中引入所述官能團(tuán)。還可以在一個(gè)額外的步驟中引入所述官能團(tuán),例如在所述溴化步驟(b)之前或之后,或者所述脫溴化氫步驟(c)之后。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠知曉,引入所述官能團(tuán)的策略完全取決于所需要引入的具體官能團(tuán)的性質(zhì)。
很顯然,用于步驟(a)——將稠合的3元環(huán)或4元環(huán)引入式(viia)、(viib)或(viic)的環(huán)辛二烯中——的方法的選擇取決于所引入的3元環(huán)或4元環(huán)的類型。例如,含n-原子的3元環(huán)可通過(guò)與含氮烯的化合物反應(yīng)稠合到所述環(huán)辛二烯而形成式(iiia)、(iiib)或(iiic)的化合物。例如,可通過(guò)使環(huán)辛二烯與含烯酮的化合物反應(yīng)將4元環(huán)引入所述環(huán)辛二烯而形成式(iva)、(ivb)或(ivc)的化合物(其中,y是c(o))??赏ㄟ^(guò)環(huán)辛二烯與(活化的)異氰酸酯反應(yīng)而將含n-原子的4元環(huán)引入所述環(huán)辛二烯形成式(va)、(vb)或(vc)的化合物(其中y是c(o)),即含β-內(nèi)酰胺的化合物。隨后的氫化形成式(va)、(vb)或(vc)的化合物,其中y是ch2。例如,可通過(guò)所述環(huán)辛二烯與(取代的)苯炔化合物反應(yīng)制備式(via)、(vib)或(vic)的化合物。
步驟(b)——環(huán)辛烯化合物的溴化——和步驟(c)——環(huán)辛烷化合物的脫溴化氫——被認(rèn)為是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)的有機(jī)轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn),可從容易獲得的起始材料容易地且快速地以高產(chǎn)率制備例如式(iia)、(iib)或(iic)的化合物。因此,本發(fā)明還涉及制備式(iia)、(iib)或(iic)的化合物的方法,該方法包括如下步驟:
(a)環(huán)丙烷化式(viia)、(viib)或(viic)的環(huán)辛二烯以形成雙環(huán)環(huán)辛烯化合物:
其中,n、r1和r2如上所定義,
(b)溴化所得的雙環(huán)環(huán)辛烯化合物以形成雙環(huán)環(huán)辛烷化合物,并且
(c)使所得的雙環(huán)環(huán)辛烷化合物脫溴化氫以形成式(iia)、(iib)或(iic)的化合物。
步驟(a)中所述式(viia)、(viib)或(viic)的環(huán)辛二烯可以是順,順-環(huán)辛二烯或順,反-環(huán)辛二烯。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述環(huán)辛二烯是順,順-環(huán)辛二烯。在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述環(huán)辛二烯是順,反-環(huán)辛二烯。也就是說(shuō),含r1-取代基的雙鍵可具有e-或z-構(gòu)象。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,r1是h。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,n為0。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,r1是h且n為0。
同樣在該情況中,所述官能團(tuán)q可以在一個(gè)額外的步驟中引入,例如所述溴化步驟(b)之前或之后,或者所述脫溴化氫步驟(c)之后。例如,步驟(a)——所述環(huán)辛二烯的環(huán)丙烷化——可通過(guò)使卡賓、類卡賓(carbenoid)或卡賓前體與環(huán)辛二烯反應(yīng)實(shí)現(xiàn),任選地存在催化劑。步驟(b)和步驟(c)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)的有機(jī)轉(zhuǎn)化。
作為實(shí)例,只需4步即可在很短的時(shí)間內(nèi)(僅1-2天)以高產(chǎn)率合成式內(nèi)型-(iia)的化合物,其中p為1、l是ch2、q是oh、n為0、并且r1和r3是h(內(nèi)型-9-(羥甲基)雙環(huán)[6.1.0]壬-4-炔)。本發(fā)明所述合成方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是只需要有限的色譜純化,因此減少了整個(gè)合成所需的總時(shí)間。
靶分子的修飾
本發(fā)明的綴合物可成功地用于靶分子(例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和聚糖)的生物正交標(biāo)記、成像或修飾(包括表面修飾)。因此,本發(fā)明還涉及修飾靶分子的方法,其中本發(fā)明的綴合物與含1,3-偶極子或1,3-(雜)二烯的化合物反應(yīng)。作為實(shí)例,方案1中示出了環(huán)炔與疊氮化物的張力促進(jìn)環(huán)加成(spaac)或環(huán)炔與硝酮的張力促進(jìn)環(huán)加成(spanc)。環(huán)辛炔與1,3-(雜)二烯的反應(yīng)稱作(雜)diels-alder反應(yīng)。這些反應(yīng)也稱作無(wú)金屬點(diǎn)擊反應(yīng)。
1,3-偶極化合物是本領(lǐng)域中公知的(參見(jiàn),例如f.a.careyandr.j.sundberg,advancedorganicchemistry,parta:structureandmechanisms,第3rd版,1990,第635–637頁(yè)),并且其包括氧化腈、疊氮化物、重氮甲烷、硝酮、腈胺等。優(yōu)選地,所述含1,3-偶極子的化合物是含疊氮化物的化合物、含硝酮的化合物或含氧化腈的化合物。
(雜)diels-alder反應(yīng)和1,3-(雜)二烯也是本領(lǐng)域中公知的。除其他的實(shí)例外,1,3-二烯的實(shí)例還包括1,3-丁二烯、1,3-環(huán)戊二烯、1,3-環(huán)己二烯、呋喃、吡咯及其經(jīng)取代的變體。除其他的實(shí)例外,1,3-雜二烯的實(shí)例還包括1-氧雜-1,3-丁二烯、1-氮雜-1,3-丁二烯、2-氮雜-1,3-丁二烯、3-氮雜-1,3-丁二烯及其經(jīng)取代的變體。
通過(guò)本發(fā)明的方法可修飾很多種靶分子,即含1,3-偶極子或1,3-(雜)二烯的化合物。合適的靶分子是本領(lǐng)域中公知的,并且包括但不限于,生物分子例如蛋白質(zhì)、肽、聚糖、脂質(zhì)、核酸、酶、激素等。原則上,任何含1,3-偶極子或1,3-(雜)二烯的化合物都適合作為靶分子。
本發(fā)明所述修飾靶分子的方法的應(yīng)用包括但不限于,診斷和治療應(yīng)用、活細(xì)胞(例如mv3細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、jurkat細(xì)胞、cho細(xì)胞或hek細(xì)胞)的細(xì)胞標(biāo)記、生物聚合物(蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸、聚糖)修飾、用于質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)和聚糖的富集、聚合物性質(zhì)調(diào)節(jié)、表面修飾等。
在一個(gè)實(shí)施方案中,所述綴合物的反應(yīng)在體外實(shí)施。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述反應(yīng)在體內(nèi)即在生理?xiàng)l件下實(shí)施。
以上對(duì)可用于修飾靶分子的本發(fā)明的綴合物進(jìn)行了詳細(xì)描述。這些綴合物的很大的優(yōu)點(diǎn)之一是它們可在體內(nèi)和在體外使用。此外,本發(fā)明所述的綴合物只遭受較少的不想要的非特異性親脂相互作用,并且在無(wú)金屬點(diǎn)擊反應(yīng)中顯示出很好的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明所述的綴合物容易合成,并且所述綴合物的多個(gè)部分可進(jìn)行簡(jiǎn)單且直接的修飾。這使得可以為具體應(yīng)用而“精確調(diào)節(jié)”所述綴合物,并且可優(yōu)化該應(yīng)用的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,上述式(iia)、(iib)和/或(iic)的化合物或其綴合物與含1,3-偶極子或1,3-(雜)二烯的化合物反應(yīng)。例如,(iia)與芐基疊氮的環(huán)加成在水性條件下以優(yōu)良的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)(k=0.09–0.28m-1s-1,取決于溶劑)快速且干凈地進(jìn)行,形成相應(yīng)的三唑加合物。(iia)與c-苯甲酰胺-n-甲基硝酮的環(huán)加成的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)甚至更高(k=1.25m-1s-1)。令人意外地,外型-(iia)和內(nèi)型-(iia)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)相似,這表明(iia)化合物在c-9位置的立體化學(xué)對(duì)反應(yīng)性影響很小。因此,本發(fā)明的外型-和內(nèi)型-化合物的混合物可以用于某些應(yīng)用中,而不需要分離外型-和內(nèi)型-化合物,并且甚至進(jìn)一步簡(jiǎn)化了本發(fā)明化合物的合成。
本發(fā)明所述方法的另外的應(yīng)用包括,例如連接熒光團(tuán)綴合物——其中(iia)和alexafluor555綴合到含單一疊氮化物的病毒質(zhì)粒蛋白,以及通過(guò)化學(xué)指示劑策略檢測(cè)細(xì)胞表面聚糖。
藥物組合物
最后,本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的綴合物并且還包含可藥用載體的組合物。本領(lǐng)域已知多種適合的可藥用載體(參見(jiàn),例如r.c.rowe,p.j.sheskeyandp.j.weller(eds.),handbookofpharmaceuticalexcipients,第4th版,2003)。
實(shí)施例
實(shí)施例1:外型(exo)-和內(nèi)型(endo)-iia.2的合成
第一步,在乙酸銠的存在下,將重氮乙酸乙酯緩慢加入到大量過(guò)量(8倍當(dāng)量)的1,5-環(huán)辛二烯在二氯甲烷中的溶液中,產(chǎn)生比例為2:1的非對(duì)映異構(gòu)化合物外型-iia.1和內(nèi)型-iia.1(總產(chǎn)率為82%)。通過(guò)硅膠直接分離后,按照還原、溴化和消除(elimination)的直接三步過(guò)程,首先將所述iia.1的內(nèi)型-異構(gòu)體轉(zhuǎn)化為醇iia.2。因此,用lialh4對(duì)內(nèi)型-iia.1的酯還原(30分鐘)產(chǎn)生粗的中間體醇(30分鐘),其純度足以用于溴化反應(yīng)而不需中間純化(30分鐘)。需要指出的是,不需要如dibo的合成中一樣對(duì)醇進(jìn)行暫時(shí)保護(hù)。最后,將所得的二溴化物用溶于thf中的過(guò)量的kotbu處理(0℃→回流,2h),以對(duì)于從內(nèi)型-iia.1得到所需要的9-(羥甲基)雙環(huán)[6.1.0]壬-4-炔內(nèi)型-iia.2,所述三步的分離收率為61%??稍谝惶靸?nèi)僅用一次色譜純化進(jìn)行的一系列相似事件得到iia.2的非對(duì)映異構(gòu)外型-異構(gòu)體,收率為53%。
實(shí)施例2:反應(yīng)動(dòng)力學(xué)
對(duì)用典型的疊氮化物芐基疊氮進(jìn)行的環(huán)加成的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究。因此,將內(nèi)型-iia.2化合物溶于cd3cn和d2o的比例為3:1的混合物中,并與芐基疊氮混合至最終濃度為18mm?;瘜W(xué)轉(zhuǎn)化之后通過(guò)對(duì)鑒定峰的積分進(jìn)行質(zhì)子nmr,并顯示內(nèi)型-iia.2快速且干凈地反應(yīng)得到期望的三唑加合物。二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的計(jì)算顯示其速率常數(shù)為0.12m-1s-1。對(duì)于外型-iia.2測(cè)得類似的速率常數(shù)值0.10m-1s-1,這表明c-9位置的立體化學(xué)對(duì)反應(yīng)性幾乎沒(méi)有影響,內(nèi)型-構(gòu)象化合物僅具有略微高的速率。發(fā)現(xiàn)存在顯著的溶劑效應(yīng),因?yàn)樵赾d3cn和d2o的比例為1:2的混合物中相同的環(huán)加成反應(yīng)分別得到0.28m-1s-1(內(nèi)型-iia.2)和0.25m-1s-1(外型-iia.2)的速率常數(shù)。
實(shí)施例3:雙環(huán)[6.1.0]壬-4-炔(bcn)綴合物
綴合到生物素的bcn(iia.4)
將內(nèi)型-iia.1的醇部分轉(zhuǎn)化為如iia.3中的p-硝基苯基(pnp)碳酸鹽。然后與生物素-(poe)3-nh2反應(yīng)產(chǎn)生bcn-生物素綴合物iia.4(69%產(chǎn)率)。
綴合到alexafluor555的bcn(iia.6)
或者,化合物iia.3與1,8-二氨基-3,6-二氧雜辛烷反應(yīng)產(chǎn)生氨基封端的bcn-探針iia.5,其與市售的alexafluor555羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)后轉(zhuǎn)化為熒光團(tuán)綴合物iia.6。
或者,化合物iia.3與1,5-二氨基戊烷反應(yīng)后產(chǎn)生更加親脂的氨基封端bcn-探針。
實(shí)施例4:iia.6與疊氮化物標(biāo)記的衣殼蛋白的反應(yīng)(spaac標(biāo)記)
將衣殼蛋白制備為每分子中僅含一個(gè)疊氮化物官能團(tuán),其在所述衣殼組裝后位于所述衣殼的內(nèi)表面上。所述蛋白質(zhì)溶于緩沖液中(50mm磷酸鹽緩沖液ph7.5;1mnacl),其濃度為1mg/ml。alexafluor555-bcn綴合物iia.6溶于水中,并將4倍當(dāng)量的所述綴合物加入所述蛋白質(zhì)溶液。分析之前,將所述反應(yīng)混合物在室溫下孵育3小時(shí)。
所得反應(yīng)產(chǎn)物在12%sds-page凝膠上分析,在用考馬斯藍(lán)(coomassie-blue)染色之前記錄其熒光圖像。圖1中示出了所述反應(yīng)產(chǎn)物(左)和空白反應(yīng)(右)的sds-page分析。圖1的上部示出了考馬斯藍(lán)染色,下部示出了考馬斯藍(lán)染色之前的熒光圖像。這些結(jié)果清楚地顯示alexafluor555-bcn綴合物被納入所述衣殼蛋白中。
為進(jìn)行質(zhì)量分析,將所得粗反應(yīng)混合物在milliq中用0.1%tfa透析,隨后在jeolaccutof上通過(guò)電噴霧離子化飛行時(shí)間(esi-tof)對(duì)其進(jìn)行分析。圖2示出了與iia.6反應(yīng)的衣殼蛋白的esi-tof質(zhì)譜。峰b對(duì)應(yīng)于未反應(yīng)的衣殼蛋白的質(zhì)量,而峰a對(duì)應(yīng)于反應(yīng)產(chǎn)物。峰之間的質(zhì)量差是1135.1(預(yù)期是1135),這表明衣殼蛋白中單個(gè)的疊氮化物有效地與bcn-alexafluor555綴合物反應(yīng),該綴合物質(zhì)量為1135。
為測(cè)試所述功能化的衣殼蛋白的自組裝性能,將所述粗反應(yīng)混合物用ph5.0的緩沖液(50mmnaoac;1mnacl;10mmcacl2)透析,其應(yīng)該能夠誘導(dǎo)形成28nm尺寸的球形顆粒(b.j.m.verduin,febslett.1974,45,50–54,其以引用的方式納入本文)。通過(guò)透析組裝所述衣殼后,通過(guò)fplc分析所述反應(yīng)混合物。圖3示出了在superpose6柱上的尺寸排阻分析。在1.2ml洗脫體積處的280nm處的吸收峰表明形成了28nm尺寸的衣殼,并且在555nm處的重疊吸收顯示所述衣殼中存在alexa染料,并因此存在iia.6。
實(shí)施例5:iia.2與硝酮標(biāo)記的fratide蛋白的反應(yīng)(spanc標(biāo)記)
將fratide(15.6μg,3.4nmol,34μm)溶解于ph6.9的0.1mnh4oac緩沖液(100μl)中,并加入naio4(1.1μg,5.5nmol,48μm)。允許所述反應(yīng)在室溫下進(jìn)行40min,并加入p-甲氧基苯硫酚(9.2μg,66.0nmol,565μm)。將所述混合物在25℃下振蕩2h,并加入p-氨基苯甲醚(13.5μg,109.3μmol,845μm)、n-甲基羥胺鹽酸鹽(18.2μg,218.6nmol,1.5mm)以及bcn-ohii.a2(41.1μg,273.3nmol,1.8mm)。最后,將所述反應(yīng)混合物在25℃下振蕩24h以產(chǎn)生所需的綴合物。
通過(guò)質(zhì)譜(accu-tof)監(jiān)測(cè)所述反應(yīng)的過(guò)程。用高碘酸鈉處理后,在4533.8da處的分子離子峰——對(duì)應(yīng)于fratide蛋白——消失,而在4534.8da處出現(xiàn)分子離子峰,其對(duì)應(yīng)于甲基半縮醛。用n-甲基羥胺和bcn-oh處理后,分子離子峰出現(xiàn)在4681.4da處——對(duì)應(yīng)于與bcn-ohiia.2反應(yīng)后的fratide蛋白硝酮衍生物——作為主峰(去卷積后)。
實(shí)施例6:細(xì)胞表面標(biāo)記
通過(guò)以化學(xué)指示劑策略檢測(cè)細(xì)胞表面聚糖,研究了生物素綴合物iia.4用于生物正交標(biāo)記的有效性。通過(guò)代謝將n-疊氮基乙酰甘露糖胺(mannaz)納入mv3細(xì)胞,并通過(guò)facs和共聚焦顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。
細(xì)胞培養(yǎng)步驟
侵襲性的和轉(zhuǎn)移性的人黑色素瘤細(xì)胞(mv3)保持在培養(yǎng)基rpmi1640中,其在5%co2水飽和的氣氛中含有10%胎牛血清、青霉素/鏈霉素(各50u/ml)。
細(xì)胞表面疊氮化物標(biāo)記
在存在或不存在ac4mannaz(50μm)的條件下,將mv3細(xì)胞培養(yǎng)6天。3天后更換培養(yǎng)基和化合物。進(jìn)行進(jìn)一步的研究之前,用明視野顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞粘附和形態(tài)學(xué)分析。對(duì)于活細(xì)胞標(biāo)記,通過(guò)edta(1mm)將細(xì)胞脫附、洗滌和離心3次(pbs,300×grpm,5min,4℃),重懸浮于pbs中并在bcn-生物素(iia.4)(60μm)、dibo-生物素(60μm)或緩沖液(1h,20℃)中孵育,洗滌3次(pbs,300×g,2min,4℃),重懸浮于冰預(yù)冷的含alexafluor488-綴合的抗生蛋白鏈菌素的pbs(5μg/ml,invitrogen;終體積200μl)中。孵育(30min,4℃)后將細(xì)胞洗滌3次,重懸浮于pbs(200μl,4℃)中用于進(jìn)一步生物分析。
流式細(xì)胞術(shù)
在bdbiosciencesfacs-calibur流式細(xì)胞儀上用488nm氬激光實(shí)施流式細(xì)胞術(shù),并將數(shù)據(jù)用fcsexpress版本3研究版本(denovosoftware,losangeles,ca)分析。在碘化丙啶(2.5μg/ml)存在的條件下,對(duì)每個(gè)樣本中2×104個(gè)形態(tài)學(xué)上完整的細(xì)胞進(jìn)行分析。
圖4示出了在代謝納入ac4mannaz、用dibo-或bcn-生物素標(biāo)記后,并用alexafluor488-綴合的抗生蛋白鏈菌素檢測(cè)后,完整mv3細(xì)胞上的細(xì)胞表面熒光。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行的分析表明,用bcn-生物素或dibo-生物素標(biāo)記后用alexafluor488-綴合的抗生蛋白鏈菌素檢測(cè)的熒光強(qiáng)度增加超過(guò)100-倍,背景熒光水平為細(xì)胞未用ac4mannaz孵育時(shí)的可忽略背景熒光水平。
圖5示出了在代謝納入ac4mannaz、用dibo-或bcn-生物素標(biāo)記后,并用alexafluor488-綴合的抗生蛋白鏈菌素檢測(cè)后,mv3細(xì)胞的熒光強(qiáng)度和細(xì)胞活力。圖5a示出了4個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中綠色熒光(alexafluor488)的平均強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)差(sd),圖5b示出了聚糖標(biāo)記后完整細(xì)胞的活力。使用綠色熒光(alexafluor488)和碘化丙啶(pi)標(biāo)記物。數(shù)字顯示pi-陰性的活細(xì)胞的百分比。從圖5a可得出,bcn和dibo都能夠有效地標(biāo)記預(yù)先暴露于ac4mannaz的細(xì)胞,而bcn-生物素的標(biāo)記效率更高。圖5b顯示細(xì)胞——無(wú)論是未處理的、bcn處理的或是dibo處理的——具有高活力(所有情況下都>98%)。
共聚焦顯微鏡
細(xì)胞表面聚糖用bcn-生物素或dibo-生物素標(biāo)記,然后用alexafluor488-綴合的抗生蛋白鏈菌素標(biāo)記。標(biāo)記后,將細(xì)胞重懸浮于正常的培養(yǎng)基中,轉(zhuǎn)移到6-孔板中并在37℃下孵育30min。在室溫下用帶有氬488激光器的olympusfv1000共聚焦激光掃描顯微鏡對(duì)mv3細(xì)胞進(jìn)行活細(xì)胞成像,所述激光器的激發(fā)光為488nm,發(fā)射光為520nm并且放大倍數(shù)為40×。
圖6示出了預(yù)先在不存在或存在ac4mannaz(50μm)的情況下培養(yǎng)的經(jīng)標(biāo)記細(xì)胞的代表性共聚焦圖像。共聚焦圖像清楚地顯示,在將mv3細(xì)胞用ac4mannaz孵育后,接著用bcn-生物素或dibo-生物素和隨后的alexafluor488-綴合的抗生蛋白鏈菌素檢測(cè)mv3細(xì)胞表面聚糖時(shí),mv3細(xì)胞的細(xì)胞表面出現(xiàn)熒光,但沒(méi)有用ac4mannaz孵育的細(xì)胞的細(xì)胞表面未出現(xiàn)熒光。
實(shí)施例7:iia.7合成
(1r,8s,z)-二乙基雙環(huán)[6.1.0]壬-4-烯-9,9-二甲酸酯(iia.8)
在3h內(nèi)向1,5-環(huán)辛二烯(5.27ml,43.0mmol)和rh2(oac)4(100mg,0.23mmol)的ch2cl2(5ml)溶液中滴加重氮丙二酸二乙酯(1.0g,5.37mmol)的ch2cl2溶液(5ml)。所述溶液在室溫下攪拌24h。使ch2cl2蒸發(fā),并通過(guò)用填充二氧化硅的玻璃過(guò)濾器過(guò)濾而移除過(guò)量的環(huán)辛二烯(洗脫劑:庚烷)。將濾液在真空中濃縮,并通過(guò)在硅膠上進(jìn)行柱色譜(etoac:庚烷為1:10)純化所得剩余物,得到iia.8(1.03g,72%)。
1hnmr(cdcl3,400mhz):δ5.65-5.57(m,2h),4.10(2×q,j=7.2hz,4h),2.41-2.29(m,2h),2.15-2.06(m,3h),1.83-1.70(m,3h),1.31-1.23(2×t,j=7.2hz,6h)。
(1r,8s,z)-雙環(huán)[6.1.0]壬-4-烯-9,9-二基二甲醇(iia.9)
在0℃下向lialh4(103mg,2.70mmol)在et2o(10ml)中的懸液中滴加iia.8(400mg,1.50mmol)的et2o(10ml)溶液。小心地加入水至灰色固體變?yōu)榘咨?。然后加入na2so4(2g),過(guò)濾出所述固體并用et2o(100ml)徹底洗滌。在真空中濃縮所得濾液。通過(guò)在硅膠上進(jìn)行柱色譜(etoac:庚烷為3:1)純化所得剩余物,得到白色固體iia.9(190mg,69%)。
1hnmr(cdcl3,400mhz):δ5.66-5.58(m,2h),3.88(d,j=4.8hz,2h),3.58(d,j=4.8hz,2h),2.43-2.35(m,2h),2.20-1.99(m,6h),1.71-1.57(m,2h),0.95-0.88(m,2h).
((1r,8s)-4,5-二溴雙環(huán)[6.1.0]壬烷-9,9-二基)二甲醇(iia.10)
將二元醇iia.9(145mg,0.796mmol)溶于ch2cl2(5ml)中。在0℃下滴加br2(45μl,0.875mmol)的ch2cl2(1ml)溶液,至黃色穩(wěn)定不變。用10%na2s2o3溶液(5ml)將所得反應(yīng)混合物淬滅,并用ch2cl2(2×20ml)提取。將有機(jī)層干燥(na2so4)并真空濃縮。通過(guò)在硅膠上進(jìn)行柱色譜(etoac:庚烷為5:1)純化所得剩余物,得到白色固體iia.10(235mg,86%)。
1hnmr(cdcl3,400mhz):δ4.87-4.78(m,2h),3.96-3.88(m,2h),3.60(d,j=5.2hz,2h),2.75-2.63(m,2h),2.32-2.22(m,3h),2.20-2.13(m,1h),2.05-1.94(m,2h),1.74-1.57(m,2h),1.13-0.99(m,2h)。
(1r,8s)-雙環(huán)[6.1.0]壬-4-炔-9,9-二基二甲醇(iia.7)
在0℃下向所述二溴化物iia.10(100mg,0.292mmol)的thf(5ml)溶液中滴加kotbu溶液(1.29ml,在thf中1m,1.29mmol)。然后,使所述溶液回流1.5h。所述混合物冷卻至室溫后,用飽和nh4cl溶液(20ml)淬滅所述混合物,并用ch2cl2(3×20ml)提取。將有機(jī)層干燥(na2so4)并真空濃縮。通過(guò)在硅膠上進(jìn)行柱色譜(etoac)純化所得剩余物,得到白色固體iia.7(24mg,46%)。
1hnmr(cdcl3,400mhz):δ3.89(bs,2h),3.63(bs,2h),2.58(bs,2h),2.34-2.20(m,6h),1.68-1.59(m,2h),0.89-0.82(m,2h)。