本發(fā)明涉及一種帶熒光標(biāo)簽的SRAP標(biāo)記(FluorescentSRAP,FSRAP)方法。
背景技術(shù)：
：SRAP(Sequence－relatedamplifiedpolymorphism)是2001年美國(guó)加州大學(xué)的Li和Quiros[Lietal.TheoApplGenet,2001,103:455-461]開(kāi)發(fā)的一種基于PCR的分子標(biāo)記，它克服了RFLP、RAPD、SSR和AFLP等標(biāo)記的缺點(diǎn)，如:RFLP標(biāo)記對(duì)DNA濃度、純度的要求高；RAPD存在共遷移，無(wú)法鑒別雜合子和純合子，穩(wěn)定性和重復(fù)性差，且產(chǎn)率低；AFLP的成本昂貴且步驟復(fù)雜；SSR的引物開(kāi)發(fā)耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)。因此，SRAP分子標(biāo)記具有經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)便、產(chǎn)率高、穩(wěn)定及便于克隆目標(biāo)片斷的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、比較基因組學(xué)和遺傳連鎖圖的構(gòu)建等研究。SRAP分子標(biāo)記是對(duì)ORFs(Openreadingframes，開(kāi)放式閱讀框)通過(guò)特定的引物設(shè)計(jì)進(jìn)行擴(kuò)增。研究表明基因外顯子G、C含量豐富，內(nèi)含子A、T豐富。SRAP分子標(biāo)記共有正向和反向兩套引物。正向引物中使用“CCGG”序列，是為了使之特異結(jié)合開(kāi)放閱讀框區(qū)域中的外顯子。由于不同個(gè)體中外顯子序列通常是保守的、低多態(tài)性水平的，這使得外顯子無(wú)法做為標(biāo)記。富含AT的區(qū)域通常出現(xiàn)在啟動(dòng)子和內(nèi)含子中，反向引物的核心序列為AATT，特異性結(jié)合AT富含區(qū)，擴(kuò)增出基于內(nèi)含子和外顯子的SRAP多態(tài)性標(biāo)記。不同的物種，不同的個(gè)體，由于內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔長(zhǎng)度不同，而產(chǎn)生多態(tài)性擴(kuò)增產(chǎn)物。引物是SRAP分子標(biāo)記的關(guān)鍵。PCR反應(yīng)體系中使用一對(duì)SRAP分子標(biāo)記引物：正向引物長(zhǎng)17bp，5`端的前10bp是一段非特異性的填充序列，緊接著是CCGG,它們一起組成核心序列,然后是靠著3`的是3個(gè)選擇性堿基，3個(gè)可選擇性的堿基是可以變化的，它的變化能產(chǎn)生一系列的引物，它們有著共同的核心序列。反向引物長(zhǎng)18bp,即由5`的11個(gè)無(wú)特異性的填充序列和緊接著的AATT組成的核心序列,及3`的3個(gè)選擇性堿基，對(duì)內(nèi)含子和啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增。SRAP分子標(biāo)記最早是在蕓薹作物中開(kāi)發(fā)利用的，到目前為止，SRAP標(biāo)記已在小麥、水稻、擬南芥、棉花、馬鈴薯、番茄、辣椒、芹菜等植物遺傳多樣性分析中得到廣泛應(yīng)用，具有重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便、共顯性高、條帶易分離等優(yōu)點(diǎn)，適合遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源的鑒定評(píng)價(jià)、重要性狀基因標(biāo)記等生物學(xué)研究。發(fā)明人從2008年開(kāi)始利用SRAP標(biāo)記進(jìn)行的遺傳多樣性、近等基因系的評(píng)價(jià)和遺傳圖譜的構(gòu)建等研究，先后利用SRAP標(biāo)記研究了中國(guó)半夏屬植物的親緣關(guān)系[歐陽(yáng)鐘鳴,趙靜,彭正松,楊在君,魏淑紅.中國(guó)半夏屬植物親緣關(guān)系的SRAP分析,植物科學(xué)學(xué)報(bào),2012,30(2):116-121.]；利用SRAP標(biāo)記評(píng)價(jià)了小麥三雌蕊近等基因系[楊在君,彭正松,周永紅,彭麗娟,魏淑紅.利用SRAP分子標(biāo)記評(píng)價(jià)小麥三雌蕊近等基因系的遺傳背景,2012,26(1):22-27.]；以及利用SRAP標(biāo)記定位了小麥三雌蕊基因Pis1[文章已接受]。經(jīng)過(guò)多年的研究，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，雖然SRAP標(biāo)記具有眾多的優(yōu)點(diǎn)，但操作起來(lái)仍然比較耗時(shí)，這主要是受銀染和顯影耗時(shí)較長(zhǎng)的影響，同時(shí)普通聚丙烯酰胺凝膠電泳一般使用1mm的膠，分辨率和穩(wěn)定性都不太理想。因此，開(kāi)發(fā)出操作簡(jiǎn)單、分辨率高和穩(wěn)定性好SRAP標(biāo)記(FluorescentSRAP,FSRAP)對(duì)遺傳多樣性研究、遺傳圖譜的構(gòu)建以及分子標(biāo)記輔助育種均具有重大的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種新的帶熒光標(biāo)簽的SRAP標(biāo)記(FluorescentSRAP,FSRAP)方法。本發(fā)明帶熒光標(biāo)簽的SRAP標(biāo)記方法，其正向引物為帶熒光標(biāo)簽的引物。優(yōu)選地，所述熒光標(biāo)簽是IRDye700或IRDye800。所述標(biāo)記方法的步驟如下：(1)提取待檢樣本中的DNA；(2)用正向引物為帶熒光標(biāo)簽的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)結(jié)果檢測(cè)：對(duì)DNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。步驟(2)中，所述擴(kuò)增的體系為：1×PCRbuffer,Mg2+1.8mmol/L,dNTP0.15mmol/L，正反向引物各0.4μmol/L，DNA模板20ng,Taq酶1U，反應(yīng)體系為10μL。步驟(2)中，所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性40s,35℃復(fù)性60s,72℃延伸60s,共5個(gè)循環(huán)；94℃40s,50℃60s，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸10min,4℃保溫。步驟(3)中，所述檢測(cè)的方法是聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染電泳或利用遺傳分析系統(tǒng)LI-COR4300電泳的方法。本發(fā)明還提供了一種鑒定小麥品種MY29和MY29TP的方法，它是采用采用SEQIDNO.3～6所示的引物對(duì)1(即以SEQIDNO.3所示引物為正向引物，SEQIDNO.6所示引物為反向引物)或者SEQIDNO.15～6所示的引物對(duì)2(即以SEQIDNO.15所示引物為正向引物，SEQIDNO.6所示引物為反向引物)，按照前述方法進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明FSRAP檢測(cè)方式于穩(wěn)定性好、品種間多態(tài)性豐富、分辨率高，同時(shí)可以有效區(qū)分小麥的不同品種，檢測(cè)快速，應(yīng)用前景良好。下面通過(guò)具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但是并不是對(duì)本發(fā)明的限制，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。附圖說(shuō)明圖1FSRAP正向引物結(jié)構(gòu)圖2FSRAP標(biāo)記和普通SRAP標(biāo)記比較。A:普通SRAP標(biāo)記結(jié)果，B:FSRAP標(biāo)記結(jié)果圖3引物組合me1-em30擴(kuò)增結(jié)果。M:marker，箭頭所在位置表示差異條帶圖4利用FSRAP標(biāo)記構(gòu)建的小麥遺傳圖譜圖5利用FSRAP標(biāo)記鑒定小麥品種MY29和MY29TP具體實(shí)施方式1、下列實(shí)施例中所用實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器如下：(1)實(shí)驗(yàn)材料小麥栽培品種綿陽(yáng)29(MY29)由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與核技術(shù)研究所的楊武云研究員提供。小麥三雌蕊近等基因系MY29TP及MY29×MY29TP雜交的F2群體(共200個(gè)單株)，均為發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室培育。(2)所用試劑植物DNA提取試劑盒(多糖多酚樣本)為Biotechnology品牌；50-700bpDNAmarker購(gòu)自成都蘭博生物科技有限公司；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；PCR反應(yīng)所需試劑購(gòu)自寶生物(大連)有限公司。(3)所用儀器BIO-RADT100PCR儀為BIO-RAD公司產(chǎn)品；NanoDrop2000超微量分光光度為Thermo公司產(chǎn)品；LI-COR4300遺傳分析系統(tǒng)為L(zhǎng)I-COR公司產(chǎn)品。2、DNA提取利用植物DNA提取試劑盒(Biotechnology)提取29(MY29)，MY29，MY29×MY29TP雜交的F2群體(200個(gè)單株)的DNA，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度和純度。DNA溶液的ODA260/A280值應(yīng)為1.8-2.0。3、引物序列本實(shí)施例中所用引物序列如表1所示，正向引物的5`端加上了一個(gè)熒光標(biāo)簽IRDye700或IRDye800。表1本實(shí)施例中所用引物序列實(shí)施例1FSRAP標(biāo)記與普通SRAP標(biāo)記的比較1、實(shí)驗(yàn)方法為驗(yàn)證FSRAP標(biāo)記優(yōu)于普通SRAP標(biāo)記，以MY29和MY29TP為實(shí)驗(yàn)材料，選用相同引物序列的FSRAP引物和SRAP引物同時(shí)擴(kuò)增MY29和MY29TP的基因組DNA，然后比較這兩種引物的擴(kuò)增條帶。普通SRAP標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)流程參照發(fā)明人之前發(fā)表的文章進(jìn)行[楊在君,彭正松,周永紅,彭麗娟,魏淑紅.利用SRAP分子標(biāo)記評(píng)價(jià)小麥三雌蕊近等基因系的遺傳背景,2012,26(1):22-27.]。FSRAP的PCR體系與普通SRAP的PCR體系完全一致，只是將正向引物換成帶熒光標(biāo)簽的引物。具體為：PCR體系包括：1×PCRbuffer,Mg2+1.8mmol/L,dNTP0.15mmol/L，正反向引物各0.4μmol/L，DNA模板20ng,Taq酶1U，反應(yīng)體系為10μL。PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性40s,35℃復(fù)性60s,72℃延伸60s,共5個(gè)循環(huán)；94℃40s,50℃60s，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸10min,4℃保溫。FSRAP標(biāo)記的檢測(cè)是利用LI-COR4300遺傳分析系統(tǒng)進(jìn)行。PAGE膠制備；將洗凈晾干的BOROFLOAT玻璃裝配好并以邊條(0.25mm)隔開(kāi),小心套入制膠夾(GIBCO/BRL)中。準(zhǔn)備就緒后用注射器將25ml變性凝膠混合液(8％聚丙烯酰胺，灌膠前加入200μl10％過(guò)硫酸銨和20μlTEMED，并迅速混勻)從制膠夾頂部緩緩注入最后插入梳子并加夾子保護(hù)，凝聚2h。電泳分離；從制膠夾取出膠板，取出梳子并反向插入，擦凈玻璃外側(cè)并固定于電泳槽上，上下槽各加500ml1×TBE緩沖液,接通電源1500V電壓預(yù)電泳25min至電流為30mA，在PCR增產(chǎn)物中加入等體積的StopBuffer，94℃變性3min后立即冰浴冷卻10min。預(yù)電泳完畢后沖洗點(diǎn)樣孔，每孔加樣0.5-0.7μl，1500V恒壓電泳3h左右，電泳過(guò)程中通過(guò)LI-COR4300遺傳分析系統(tǒng)的紅外檢測(cè)器對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，電泳結(jié)束后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果以MY29和MY29TP為實(shí)驗(yàn)材料，利用引物組合me2-em13，me32-em13，me32-em14進(jìn)行SRAP和FSRAP擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別利用普通聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染和利用遺傳分析系統(tǒng)LI-COR4300電泳，每個(gè)材料重復(fù)3次。結(jié)果如圖2所示，F(xiàn)SRAP擴(kuò)增的條帶數(shù)目比普通SRAP多，且分辨率也較普通SRAP標(biāo)記高，如：利用FSRAP標(biāo)記me2-em13這對(duì)引物在MY29和MY29TP中有兩個(gè)差異位點(diǎn)，而普通SRAP標(biāo)記則看不出差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明FSRAP檢測(cè)方式的靈敏度更高，更高更有效地?cái)U(kuò)增相關(guān)的條帶，分辨率高。實(shí)施例2FSRAP標(biāo)記的穩(wěn)定性考察為了驗(yàn)證FSRAP標(biāo)記的穩(wěn)定性，用相同的引物(引物組合me2-em13，me32-em13，me32-em14)，擴(kuò)增MY29和MY29TP的基因組DNA，重復(fù)3次，比較擴(kuò)增條帶是否存在差異，PCR反應(yīng)和電泳具體操作參照實(shí)施例1。穩(wěn)定性考察結(jié)果如圖2B所示，同一材料利用相同引物進(jìn)行3次PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的條帶完全一致，這說(shuō)明FSRAP標(biāo)記的穩(wěn)定性較好。實(shí)施例3利用FSRAP標(biāo)記構(gòu)建小麥的遺傳圖譜篩選在MY29和MY29TP中存在差異的FSRAP引物，利用篩選出的FSRAP標(biāo)記對(duì)MY29×MY29TP雜交的F2群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)LI-COR4300遺傳分析系統(tǒng)檢測(cè)后，統(tǒng)計(jì)出差異條帶，PCR反應(yīng)和電泳具體操作參照實(shí)施例1。采用JoinMap4.0軟件構(gòu)建小麥的FSRAP遺傳圖譜。電泳結(jié)果如圖3所示。共有13個(gè)FSRAP標(biāo)記上圖，這13個(gè)標(biāo)記分別屬于4個(gè)連鎖群，其中最多的是第2連鎖群，含5個(gè)標(biāo)記；最少的是第4連鎖群，僅2個(gè)標(biāo)記(圖4)。實(shí)施例4利用FSRAP標(biāo)記鑒定小麥品種MY29和MY29TPMY29和MY29TP為近等系，二者具有相似的農(nóng)藝性狀，因此在抽穗前無(wú)法通過(guò)形態(tài)學(xué)特征對(duì)MY29和MY29TP進(jìn)行鑒定，為此，我們開(kāi)發(fā)出適用于MY29和MY29TP苗期鑒定的FSRAP標(biāo)記。用于鑒定FSRAP標(biāo)記的引物序列如表2所示。表2本實(shí)施例中用于MY29和MY29TP鑒定的FSRAP標(biāo)記引物引物組合正向引物Me反向引物Emme2-em13IRDye700-TGAGTCCAAACCGGAGCGACTGCGTACGAATTACGme32-em13IRDye700-TGAGTCCAAACCGGGCTGACTGCGTACGAATTACG電泳結(jié)果如圖5所示，me2-em13引物組合能在MY29中擴(kuò)增出100bp左右的特異性條帶，在MY29TP中擴(kuò)增出150bp特異性條帶。me32-em13引物組合能在MY29中擴(kuò)增出350bp左右的特異性條帶。經(jīng)過(guò)多次重復(fù)試驗(yàn)證明這兩對(duì)引物在MY29和MY29TP中擴(kuò)增條帶非常穩(wěn)定，因此可用于MY29和MY29TP的鑒定。本實(shí)施例僅提供了一種小麥品種鑒定方法，利用該方法也可進(jìn)行小麥產(chǎn)量性狀、抗病性、抗逆性的鑒定。綜上，本發(fā)明FSRAP檢測(cè)方式于穩(wěn)定性好、品種間多態(tài)性豐富、分辨率高，同時(shí)可以有效區(qū)分小麥的不同品種，檢測(cè)快速，應(yīng)用前景良好。SEQUENCELISTING<110>西華師范大學(xué)<120>一種帶熒光標(biāo)簽的SRAP標(biāo)記方法<130>GY493-16P1614<160>15<170>PatentInversion3.5<210>1<211>17<212>DNA<213>Me1<400>1tgagtccaaaccggata17<210>2<211>18<212>DNA<213>Em5<400>2gactgcgtacgaattaac18<210>3<211>17<212>DNA<213>Me2<400>3tgagtccaaaccggagc17<210>4<211>18<212>DNA<213>Em8<400>4gactgcgtacgaattctg18<210>5<211>17<212>DNA<213>Me4<400>5tgagtccaaaccggacc17<210>6<211>18<212>DNA<213>Em13<400>6gactgcgtacgaattacg18<210>7<211>17<212>DNA<213>Me6<400>7tgagtccaaaccggtaa17<210>8<211>18<212>DNA<213>Em14<400>8gactgcgtacgaattatg18<210>9<211>17<212>DNA<213>Me8<400>9tgagtccaaaccggtgc17<210>10<211>18<212>DNA<213>Em23<400>10gactgcgtacgaatttaa18<210>11<211>17<212>DNA<213>Me9<400>11tgagtccaaaccggaac17<210>12<211>18<212>DNA<213>Em30<400>12gactgcgtacgaatttca18<210>13<211>17<212>DNA<213>Me10<400>13tgagtccaaaccggatg17<210>14<211>18<212>DNA<213>Em36<400>14gactgcgtacgaattgga18<210>15<211>17<212>DNA<213>Me32<400>15tgagtccaaaccgggct17當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3