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一種類海膽肽口服液的制備方法與流程

文檔序號:11145198閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種類海膽肽口服液及其制備方法,其特征在于:經(jīng)過下列工藝步驟:

(1)、海膽黃細胞RNA的提取

(1.1)、勻漿處理

稱取100~200mg海膽黃組織在液氮中磨碎,加入1~2ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理;

(1.2)、靜置

將步驟(1.1)中得到的勻漿后的混合物在室溫條件下靜置3~5min,使核酸蛋白復(fù)合物完全分離;

(1.3)、離心去雜質(zhì)

將步驟(1.2)中得到的靜置后的混合物于2~8℃條件下,10000g離心8~10min,收取上清液;

(1.4)、抽提

將步驟(1.3)中得到的上清液中加入其體積10%~20%的氯仿,劇烈振蕩15~20s,室溫靜置2~3min;

(1.5)、離心

將步驟(1.4)中得到的室溫靜置后的混合物于2~8℃條件下,10000g離心10~15min;樣品分為三層:有機相、水相和中間層;

(1.6)、沉淀

將步驟(1.5)中的水相層轉(zhuǎn)移到新試管中,按體積比1:1~2的比例加入異丙醇,室溫靜置8~10min,于2~8℃條件下,10000g離心8~10min,管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀,移去上清液,即得RNA沉淀;

(1.7)、洗滌

向步驟(1.6)中得到的RNA沉淀中加入1~1.5ml、濃度為75%的乙醇溶液進行洗滌,再于2~8℃條件下,6000~7500g離心3~5min,棄上清液,得洗滌后的RNA沉淀;

(1.8)、干燥

將步驟(1.7)中得到的洗滌后的RNA沉淀室溫放置干燥5~10min,然后加入25~200μl無RNase的水,用槍頭吸打混勻,于55~60℃條件下靜置8~10min,使RNA溶解,-70℃保存,備用;

(2)、反轉(zhuǎn)錄

將步驟(1.8)中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法,利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptTMII和隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄,獲得海膽黃細胞的cDNA;

(3)、構(gòu)建表達載體

將步驟(2)中得到的海膽黃細胞的cDNA以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,利用大量隨機引物:引物L-隨機和R-隨機 PCR擴增25個循環(huán)后回收,酶切后,回收產(chǎn)物與pET32(a)載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,得到含有表達載體pET32(a)-隨機的大腸桿菌,挑取菌落,接種入LB液體培養(yǎng)基,待菌液濃度為OD值接近1.0時,向其中加入菌液體積10%~15%的甘油,-70℃保存,得到轉(zhuǎn)化入表達載體的菌株;

(4)、蛋白表達

挑取步驟(3)中保存的菌株,接種體積為10ml LB液體培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)8~12h;將10ml菌液加入到500ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)8~12h;將500ml菌液接種至50~80L發(fā)酵罐中,跟蹤菌體生長指標,待OD600≈0.4~0.6,向其中加入IPTG至終濃度為0.3~0.4mM,繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6h;開罐取菌液,12000g離心30~60s,用發(fā)酵液體積10%~20%的、濃度為1%的SDS溶液進行重懸,混勻,冰上超聲破碎;12000g離心30~60s,取上清液,即為海膽黃RNA隨機原核表達粗產(chǎn)物;

(5)、酶切

將步驟(4)中的海膽黃RNA隨機原核表達粗產(chǎn)物采用復(fù)合蛋白酶進行充分酶切,得到類海膽酶切溶液;其中,所述的復(fù)合蛋白酶為中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶中的兩種或多種;復(fù)合蛋白酶使用量為海膽黃RNA隨機原核表達粗產(chǎn)物質(zhì)量的1%~2.5%;

(6)、超濾濃縮

將步驟(5)中得到的類海膽酶切溶液利用2000Kd的超濾管進行超濾,收集濾過液,即得2000Kd以下的2~6個氨基酸大小的類海膽肽溶液;

(7)、調(diào)配

稱取步驟(6)中得到的類海膽肽溶液加入其質(zhì)量6%~6.5%的枸杞提取液、1%~1.5%的薄荷提取液、0.00015~0.00018%的乳酸鏈球菌素混合均勻,得調(diào)配液;

(8)、滅菌

將步驟(7)中得到的調(diào)配液經(jīng)精濾膜精濾后,進行高溫瞬時滅菌;

(9)、灌裝

將步驟(8)中得到的滅菌后的精濾液用灌裝機按預(yù)設(shè)重量進行分瓶真空灌裝,封口,獲得類海膽肽口服液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種類海膽肽口服液及其制備方法,其特征在于:所述的枸杞提取液其是稱取枸杞采用去離子水沖洗后,按照料液比1:30~40添加去離子水,浸泡2~3h,蒸煮20~30min,過濾,收集濾液后進行抽濾,澄清透過液即得枸杞提取液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種類海膽肽口服液及其制備方法,其特征在于:所述的薄荷提取液其稱取薄荷采用去離子水沖洗后,按照料液比1:30~40添加去離子水,浸泡2~3h,打漿,蒸煮20~30min,過濾,收集濾液后進行抽濾,澄清透過液即得薄荷提取液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種類海膽肽口服液及其制備方法,其特征在于:所述的勻漿后的混合物靜置時的室溫控制為15~30℃。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種類海膽肽口服液及其制備方法,其特征在于:所述的高溫瞬時滅菌的滅菌溫度為120~140℃,滅菌時間為4~6s。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種類海膽肽口服液及其制備方法,其特征在于:所述的真空灌裝的真空度為0.04~0.05Mpa,灌裝溫度控制在60~75℃。

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