本發(fā)明涉及分子檢測技術領域，具體涉及一種用于檢測D型流感病毒的熒光PCR引物和探針及檢測方法。

背景技術：

流行性感冒(簡稱流感)是由流感病毒感染引起的急性呼吸道傳染病，它發(fā)病率高、傳染性強、潛伏期短，對人群尤其是兒童、老年人及機體免疫力低下的易患人群造成很大的危害。該病癥狀可累及全身，主要表現(xiàn)為急性高熱、全身疼痛、顯著乏力和輕度的呼吸道癥狀，可引起嚴重的并發(fā)癥導致死亡。20世紀以來全球至少有4次流感大流行[雷達，等，2009；宋樂，江曉靜，2014]。流感屬于乙類傳染性，其致病因子流感病毒(Influenza virus)屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，是一種帶包膜并且分節(jié)段的單負鏈RNA病毒(候文郁，等，2014)。根據(jù)流感病毒的NP蛋白和M蛋白的抗原性質不同，可將流感病毒分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。甲型流感病毒的傳染性、致病性和變異性都明顯高于其他兩種血清型，能引起世界性流感大流行(許沙沙，等，2015)；乙型流感病毒常引起局部暴發(fā)，不引起世界性流感大流行；丙型流感病毒主要以散在形式出現(xiàn)，侵襲嬰幼兒，一般不引起流行(KAITLIN RL,et a1.2013)。

流感病毒的檢測方法包括分離培養(yǎng)法、免疫學檢測和分子生物學檢測。分離培養(yǎng)法是一種基于細胞病變的檢測方法，有TCID₅₀的測定和空斑實驗，是流感病毒滴度測定的常規(guī)實驗方法，TClD₅₀實驗測得結果的主觀性較強，結果不夠精確；空斑實驗是病毒學中一種比較準確的定量方法，但實驗操作的熟練程度要求較高，以上兩種方法比較費時費力，且我國大部分實驗室達不到重大傳染病病毒分離培養(yǎng)要求，因而實驗室通常采用免疫學檢測與核酸檢測法進行診斷(蘇明權，等，2011)。免疫學檢測方法包括血凝(HA)與血凝抑制(HI)試驗、免疫熒光(IF)技術和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。免疫學檢測方法具有特異性強，敏感性高，適應面廣，方法簡便快速，制樣簡單等特點，但存在操作費時且敏感性較差的問題(Brittain-long R,et a1.2008)。在血凝(HA)與血凝抑制(HI)試驗中，紅細胞濃度、稀釋液、反應的溫度、加抗原與加紅細胞之間的時間間隔及結果的判定標準均會影響試驗結果，而且HI試驗需預處理血清中的非特異性血凝抑制因子，其缺點是存在一定的假陽性。免疫熒光技術的非特異性染色問題也尚未完全解決，結果判定的客觀性不足，技術程序也還比較復雜。與免疫熒光相似，ELISA檢測過程中，同樣會出現(xiàn)假陽性。分子生物學檢測是業(yè)內公認靈敏度和特異度最好的一種檢測方法。該方法是在PCR原理的基礎上，先后建立了多種PCR相關檢測方法，最常用的如逆轉錄PCR(RT-PCR)、實時熒光PCR以及新型的環(huán)介導等溫擴增技術(RT-LAMP)技術。本研究利用熒光RT-PCR反應的快速、靈敏及污染性小等特點，建立了基于TaqMan探針的多重熒光RT-PCR檢測方法，期望在D型流感病毒的檢測中發(fā)揮作用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種用于檢測D型流感病毒的熒光PCR引物和探針及檢測方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的：

一種用于檢測D型流感病毒的熒光PCR引物和探針，包括一組用于檢測D型流感病毒的檢測引物和探針，具體如下：

F-primer：GAGAAACCAGCTTACTGCC(SEQ NO.1)，

R-primer：CTCATCTCTAGATTCCGCAT(SEQ NO.2)，

Probe：FAM-ATGACCCAGAGAAGTCAGTACGA-BHQ1(SEQ NO.3)。

一種用于檢測D型流感病毒的熒光PCR試劑盒，包括上述的引物和探針。

一種D型流感病毒的熒光PCR檢測方法，它包括以下步驟：

S1.提取待檢測樣品的RNA，并以此為模板RNA；

S2.以權利要求1所述的引物和探針進行RT-PCR反應；

S3.根據(jù)擴增曲線，對照陽性標準品和陰性標準品的擴增結果，判斷樣品是否為D型流感病毒。

進一步地，所述RT-PCR反應體系為總體積為25μL，其中上游、下游引物10μmol/L各1.0μL，探針10μmol/L 0.5μL，模板RNA 5.0μL，最后補水至25μL；將加入反應液的PCR管5000r/min離心30s后放入檢測儀器，反應程序設置：第一階段：42℃10min，95℃3min；第二階段：95℃30s，45℃30s，72℃30s，5個循環(huán)；第三階段：95℃15s，55℃40s，40個循環(huán)，在55℃40s收集熒光信號。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明根據(jù)GenBank中公布的A型、B型、C型和D型流感病毒的NS基因序列，進行多序列比對之后，使用分子生物學軟件Oligo7.0在D型流感病毒基因的保守區(qū)設計一套特異性的引物和探針，通過RT-PCR反應，實現(xiàn)檢測方法簡單，檢測迅速，便捷的定量檢測，同時靈敏度試驗顯示最低能夠檢測到10個拷貝。

附圖說明

圖1為本發(fā)明RT-PCR體系鑒定結果；

圖2為本發(fā)明RT-PCR靈敏度鑒定結果；

圖3為本發(fā)明RT-PCR特異性鑒定結果(由左向右為10⁹-10¹)。

具體實施方式

下面結合具體實施例進一步詳細描述本發(fā)明的技術方案，但本發(fā)明的保護范圍不局限于以下所述。

試驗例

A型流感滅活病毒7株，分別為H1N1、H3N2、H5N1、H5N2、H6N2、H7N9和H9N2；B型流感病毒RNA 21份，均存放于-80℃冰箱保藏，C型和D型流感病毒NS基因克隆質粒各1份，根據(jù)美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)上公布的C型和D型流感病毒非結構蛋白(NS)序列全基因合成并克隆到PES載體上。

病毒RNA柱式提取試劑盒為北京森康公司產品，RNA體系反應液TaKaRa One step PrimeScriptTM RT-PCR Kit，為TaKaRa公司產品。

根據(jù)GenBank中公布的A型、B型、C型和D型流感病毒的NS基因序列，進行多序列比對之后，使用分子生物學軟件Oligo7.0在D型流感病毒基因的保守區(qū)設計一套特異性的引物、探針，由上海輝睿生物科技有限公司合成。引物、探針用DEPC水稀釋成100pmol/μL溶液，-20℃保存?zhèn)溆?。引物序列見?。

表1 D型流感病毒引物、探針序列

RNA提取方法分別按照RNA提取試劑盒說明書的要求進行，獲得的模板的260/280比值應在1.8～2.0之間才說明提取的RNA適合做后續(xù)的擴增反應。

以樣品RNA和質粒為模板進行熒光反轉錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)擴增。PCR反應體系總體積為25μL，按照TaKaRa反應試劑盒RR064A的說明書配制，其中上游、下游引物10μmol/L各1.0μL，探針10μmol/L 0.5μL，RNA模版5.0μL，最后補水至25μL。將加入反應液的PCR管5000r/min離心30s后放入檢測儀器，反應程序設置：第一階段：42℃10min，95℃3min；第二階段：95℃30s，45℃30s，72℃30s，5個循環(huán)；第三階段：95℃15s，55℃40s(收集熒光信號)，40個循環(huán)，檢測結果如圖1。

方法靈敏度試驗：將合成D型流感病毒重組質粒作為陽性標準品。用紫外分光光度計測定質粒濃度，根據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)換算為目的基因的拷貝數(shù)，以10倍梯度稀釋至10拷貝/μL，對梯度稀釋的陽性對照進行熒光RT-PCR反應檢測；

將濃度為10⁹至10¹的9個梯度的陽性標準品使用上述的反應體系和反應條件進熒光RT-PCR擴增，以驗證建立方法的靈敏度，檢測結果如圖2。

方法特異性試驗：將樣品RNA和質粒作為模板，使用上述的反應體系和反應條件進行熒光RT-PCR擴增擴增，以驗證所建立方法的特異性，檢測結果如圖3。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當理解本發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應在本發(fā)明所附權利要求的保護范圍內。

SEQUENCE LISTING

<110> 珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心

<120> 一種用于檢測D型流感病毒的熒光PCR引物和探針及檢測方法

<130> 2016

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

GAGAAACCAG CTTACTGCC 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

CTCATCTCTA GATTCCGCAT 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ATGACCCAGA GAAGTCAGTA CGA 23