本發(fā)明屬于生物制品技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種牦牛軟骨硫酸軟骨素的制備方法。

背景技術(shù)：

硫酸軟骨素(Chondroitin Sulfate，CS)是來自動(dòng)物喉骨、鼻軟骨、氣管等富含軟骨組織的一類重要酸性高分子黏性多糖。根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同可將其分為硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素B、硫酸軟骨素C、硫酸軟骨素D、硫酸軟骨素E等不同類型。不同動(dòng)物體內(nèi)所存在的硫酸軟骨素類型不同，豬、牛、羊的喉鼻骨和關(guān)節(jié)骨中主要含有硫酸軟骨素A，鯊魚、烏賊等海洋動(dòng)物的軟骨中主要含有硫酸軟骨素C。通常情況下，硫酸軟骨素是白色或者微黃色的，是無臭、略帶咸味的粉末狀態(tài)，有較強(qiáng)的吸濕性，并且CS在水中容易溶解，但在甲醇、乙醚、丙酮和冰醋酸這些有機(jī)溶劑中不溶。硫酸軟骨素的水溶液是一種粘稠狀的液體，在一些特定條件（強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和高溫環(huán)境）下容易發(fā)生降解反應(yīng)，分解為分子量較小的低聚糖，使溶液的粘度變小。硫酸軟骨素發(fā)生化學(xué)反應(yīng)變成鹽后，對(duì)熱的穩(wěn)定性會(huì)增強(qiáng)，即使溫度到達(dá)80℃也不易被破壞。

硫酸軟骨素在酸性、堿性及酶解條件下會(huì)生成不飽和糖類物質(zhì)，包括低分子硫酸軟骨素和硫酸軟骨素的寡糖或雙糖均與β-消除反應(yīng)有關(guān)。一般用530nm處的可見光吸光度值來表示硫酸軟骨素在酸性、堿性和中性條件下的降解程度，吸光度值越大表示降解的程度越大，從而反映出硫酸軟骨素在不同條件下的穩(wěn)定性。硫酸軟骨素易與鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子等陽離子相結(jié)合。硫酸軟骨素的內(nèi)部結(jié)構(gòu)中含有的半縮醛基具有還原性，可以把堿性酒石酸銅溶液里面的Cu²⁺還原成Cu₂O。硫酸軟骨素在中性、低溫的環(huán)境下比較穩(wěn)定，但在高溫、強(qiáng)酸條件下比較容易發(fā)生降解反應(yīng)，分子量降低。

硫酸軟骨素具有多種重要生物活性。例如：具有抗炎、抗癌、抗HIV、降血脂、抗凝血活性的功效；能有效預(yù)防關(guān)節(jié)炎、減輕打鼾；還可以改善食物風(fēng)味、口感、光澤及保濕性等。鑒于其潛在的醫(yī)藥價(jià)值，2010年《中華人民共和國藥典》將硫酸軟骨素列為防治心血管疾病和關(guān)節(jié)病的最佳藥物。同時(shí)硫酸軟骨素作為膳食補(bǔ)充劑和保濕劑，廣泛應(yīng)用于食品和化妝品領(lǐng)域。

目前，硫酸軟骨素的提取方法多為中性鹽法、堿法、酶法、堿鹽法、超聲波法、乙酸抽提法、酶催化法、發(fā)酵法等。常用的硫酸軟骨素純化方法主要有機(jī)溶劑沉淀法、季銨鹽化合物沉淀法、超濾膜過濾法、色譜法、電泳法等。但每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)。中性鹽法提取率低且浪費(fèi)原材料，經(jīng)濟(jì)效益低；堿法提取率較高，但生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，且污染環(huán)境；酶法產(chǎn)率和純度較高，生產(chǎn)周期較短，污染較小，是一種較理想的提取方法；超聲波法提取率較低且雜質(zhì)去除較難，這限制了生產(chǎn)上的應(yīng)用；乙酸抽提法操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)周期短且成本低，但是目前國內(nèi)還未采用大規(guī)模生產(chǎn)；發(fā)酵法操作方便且安全，但菌株培養(yǎng)困難而且容易發(fā)生突變?，F(xiàn)有技術(shù)中使用頻次較高的提取工藝流程為軟骨粉→堿提→酶解→吸附、脫蛋白→醇沉淀→干燥→硫酸軟骨素。上述提取工藝方法中對(duì)軟骨粉的利用率不完全，導(dǎo)致部分的流失；同時(shí)普遍缺乏高效率的提純步驟，導(dǎo)致硫酸軟骨素純度較低，質(zhì)量不理想。而且上述硫酸軟骨素制備產(chǎn)品只針對(duì)普通大眾群體，并不能作為清真制品使用。

我國是世界上領(lǐng)先的畜牧大國，因此硫酸軟骨素原料的來源更加廣泛，價(jià)格也更加實(shí)惠，比其他國家具有很大的優(yōu)勢(shì)。但是眼下我國在軟骨加工與應(yīng)用方面還很薄弱。具體表現(xiàn)在生產(chǎn)加工工藝不成熟、銷路不暢通等方面。例如許多CS生產(chǎn)商仍然采用濃稀堿法和稀堿稀鹽法等傳統(tǒng)工藝，造成產(chǎn)量較低，而一些企業(yè)的精制工藝通常包含除雜、脫色等過程，工藝控制太過繁瑣，因而導(dǎo)致質(zhì)量不穩(wěn)定，其后果仍然是收率低下。同時(shí)，堿、鹽等副產(chǎn)物容易造成環(huán)境污染。所以，發(fā)展一種操作簡(jiǎn)單、提取率較高的硫酸軟骨素提取方法具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明克服現(xiàn)有制備方法中軟骨粉利用率較低的問題，提供一種牦牛軟骨硫酸軟骨素的制備方法，增加分離純化步驟提高硫酸軟骨素純度及質(zhì)量，可制得符合清真生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)品。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：

一種牦牛軟骨硫酸軟骨素的制備方法，包括如下步驟：

A、原料預(yù)處理

將牦牛軟肋、月牙骨等軟骨投入恒溫蒸煮鍋中, 加水淹沒過軟骨于恒溫80℃蒸煮4～6h，蒸煮后的軟骨撈出用水沖洗干凈，切成1～2cm³小塊，然后將軟骨小塊放入烘箱，恒溫60℃烘干6～8h至恒重，再粉碎為200目制得牦牛軟骨粉粒；

B、超聲波輔助堿鹽提取

每克牦牛軟骨粉粒中加入5-9ml質(zhì)量濃度2-10％的NaOH溶液，上述溶液中逐漸加入NaCl粉末溶解使溶液中Na⁺離子摩爾濃度升至2-4mol/L，置于超聲波清洗器中超聲處理1.5-3.5h，雙層200目紗布濾除殘?jiān)瑸V液備用；

C、木瓜蛋白酶酶解

步驟B中濾液滴加濃度2mol/L的HCL溶液調(diào)節(jié)pH值至6.4-7.2，上述溶液加入木瓜蛋白酶，使木瓜蛋白酶質(zhì)量濃度為40-200μg/ml ，于30-50℃水解0.5-2.5h，水解后將水浴升高至85℃滅酶；

D、吸附、脫蛋白

滅酶濾液中加入2～3g活性炭粉末進(jìn)行吸附，吸附過程中間歇攪拌4h，于4℃下靜置自然澄清，抽取上清液；

E、醇沉

上清液中加入無水乙醇使乙醇質(zhì)量濃度升至70％，室溫下靜置8～10h后，轉(zhuǎn)速5000r/min下離心處理5min后回收固體物質(zhì)，固體物質(zhì)用無水乙醇洗滌脫水兩次；

F、真空干燥

固體物質(zhì)在恒溫60℃、真空度0.07Mpa下真空干燥至恒溫，研磨粉碎成400～550目粉末制得硫酸軟骨素成品。

所述步驟B中每克牦牛軟骨粉粒中加入6.5ml質(zhì)量濃度8％的NaOH溶液，上述溶液中逐漸加入NaCl粉末溶解使溶液中Na⁺離子摩爾濃度升至2.5mol/L，置于超聲波清洗器中超聲處理2.7h，雙層200目紗布濾除殘?jiān)瑸V液備用。

所述步驟C中濾液滴加濃度2mol/L的HCL溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，上述溶液每850ml中加入1g木瓜蛋白酶，于恒溫37蛋水解1.5h，水解后將水浴升高至85℃滅酶。

所述步驟A中蒸煮過程中去除殘留的肌肉、脂肪和其他結(jié)締組織。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明用于制備硫酸軟骨素，純度可達(dá)90％以上，且在原有的硫酸軟骨素制備工藝的基礎(chǔ)上提高了對(duì)軟骨粉的利用率以及硫酸軟骨素純度，原料和用料均采用符合清真要求的產(chǎn)品，所制的硫酸軟骨素可應(yīng)用于清真產(chǎn)品中，適合大量推廣應(yīng)用。

1、本發(fā)明在原有傳統(tǒng)的硫酸軟骨素提取工藝上加以改進(jìn)，在堿鹽提取步驟采用超聲波輔助大大減少提取時(shí)間，縮短了硫酸軟骨素生產(chǎn)周期，提高提取效率；并且流程中增加一道醇沉步驟，使硫酸軟骨素純度得到提升，提高產(chǎn)品質(zhì)量，擴(kuò)大經(jīng)濟(jì)效益。

2、本發(fā)明中原料采用牦牛骨，酶解時(shí)采用木瓜蛋白酶，可用于清真產(chǎn)品的開發(fā)，填補(bǔ)市場(chǎng)空白。

附圖說明

圖1為D-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2為堿液濃度對(duì)牦牛軟骨CS含量的影響

圖3為Na⁺濃度對(duì)牦牛軟骨CS含量的影響

圖4為料液比對(duì)牦牛軟骨CS含量的影響

圖5為提取溫度對(duì)牦牛軟骨CS含量的影響

圖6為超聲時(shí)間對(duì)牦牛軟骨CS含量的影響

圖7為料液比與超聲時(shí)間響應(yīng)曲面圖

圖8為堿液濃度與超聲時(shí)間響應(yīng)曲面圖

圖9為堿液濃度與料液比響應(yīng)曲面圖

圖10為酶解反應(yīng)溫度對(duì)CS百分含量的影響

圖11為酶反應(yīng)濃度對(duì)CS百分含量的影響

圖12為酶解液pH值對(duì)牦牛軟骨CS百分含量的影響

圖13為酶解反應(yīng)時(shí)間對(duì)牦牛軟骨CS百分含量的影響

圖14為加酶量與酶解溫度響應(yīng)面圖

圖15為酶解溫度與pH響應(yīng)面圖

圖16為加酶量與pH響應(yīng)面圖

圖17為本發(fā)明的制備方法流程圖。

具體實(shí)施方式

一種牦牛軟骨硫酸軟骨素的制備方法，包括如下步驟：

A、原料預(yù)處理

將牦牛軟肋、月牙骨等軟骨投入恒溫蒸煮鍋中, 加水淹沒過軟骨于恒溫80淹蒸煮4～6h，蒸煮過程中去除殘留的肌肉、脂肪和其他結(jié)締組織蒸煮后的軟骨撈出用水沖洗干凈，切成1～2cm³小塊，然后將軟骨小塊放入烘箱，恒溫60，烘干6～8h至恒重，再粉碎為200目制得牦牛軟骨粉粒；

B、超聲波輔助堿鹽提取

每克牦牛軟骨粉粒中加入5-9ml質(zhì)量濃度2-10％的NaOH溶液，上述溶液中逐漸加入NaCl粉末溶解使溶液中Na⁺離子摩爾濃度升至2-4mol/L，置于超聲波清洗器中超聲處理1.5-3.5h，雙層200目紗布濾除殘?jiān)瑸V液備用；

C、木瓜蛋白酶酶解

步驟B中濾液滴加濃度2mol/L的HCL溶液調(diào)節(jié)pH值至6.4-7.2，上述溶液加入木瓜蛋白酶，使木瓜蛋白酶質(zhì)量濃度為40-200入木瓜蛋白酶，于30-500水解0.5-2.5h，水解后將水浴升高至85解滅酶；

D、吸附、脫蛋白

滅酶濾液中加入2～3g活性炭粉末進(jìn)行吸附，吸附過程中間歇攪拌4h，于4于下靜置自然澄清，抽取上清液；

E、醇沉

上清液中加入無水乙醇使乙醇質(zhì)量濃度升至70％，室溫下靜置8～10h后，轉(zhuǎn)速5000r/min下離心處理5min后回收固體物質(zhì)，固體物質(zhì)用無水乙醇洗滌脫水兩次；

F、真空干燥

固體物質(zhì)在恒溫60物、真空度0.07Mpa下真空干燥至恒溫，研磨粉碎成400～550目粉末制得硫酸軟骨素成品。

優(yōu)選的所述步驟B中每克牦牛軟骨粉粒中加入6.5ml質(zhì)量濃度8％的NaOH溶液，上述溶液中逐漸加入NaCl粉末溶解使溶液中Na⁺離子摩爾濃度升至2.5mol/L，置于超聲波清洗器中超聲處理2.7h，雙層200目紗布濾除殘?jiān)?，濾液備用。

優(yōu)選的所述步驟C中濾液滴加濃度2mol/L的HCL溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，上述溶液每850ml中加入1g木瓜蛋白酶，于恒溫37蛋水解1.5h，水解后將水浴升高至85解滅酶。

實(shí)施例1

一種牦牛軟骨硫酸軟骨素的制備方法，包括如下步驟：

A、原料預(yù)處理

將牦牛軟肋、月牙骨等軟骨投入恒溫蒸煮鍋中, 加水淹沒過軟骨于恒溫80淹蒸煮4h，蒸煮過程中去除殘留的肌肉、脂肪和其他結(jié)締組織蒸煮后的軟骨撈出用水沖洗干凈，切成1～2cm³小塊，然后將軟骨小塊放入烘箱，恒溫60，烘干6h至恒重，再粉碎為200目制得牦牛軟骨粉粒；

B、超聲波輔助堿鹽提取

每克牦牛軟骨粉粒中加入5ml質(zhì)量濃度2％的NaOH溶液，上述溶液中逐漸加入NaCl粉末溶解使溶液中Na⁺離子摩爾濃度升至2mol/L，置于超聲波清洗器中超聲處理1.5h，雙層200目紗布濾除殘?jiān)?，濾液備用；

C、木瓜蛋白酶酶解

步驟B中濾液滴加濃度2mol/L的HCL溶液調(diào)節(jié)pH值至6.4，上述溶液加入木瓜蛋白酶，使木瓜蛋白酶質(zhì)量濃度為40述溶液加入木，于30述水解0.5h，水解后將水浴升高至85解滅酶；

D、吸附、脫蛋白

滅酶濾液中加入2g活性炭粉末進(jìn)行吸附，吸附過程中間歇攪拌4h，于4于下靜置自然澄清，抽取上清液；

E、醇沉

上清液中加入無水乙醇使乙醇質(zhì)量濃度升至70％，室溫下靜置8h后，轉(zhuǎn)速5000r/min下離心處理5min后回收固體物質(zhì)，固體物質(zhì)用無水乙醇洗滌脫水兩次；

F、真空干燥

固體物質(zhì)在恒溫60物、真空度0.07Mpa下真空干燥至恒溫，研磨粉碎成400～550目粉末制得硫酸軟骨素成品。

實(shí)施例2

一種牦牛軟骨硫酸軟骨素的制備方法，包括如下步驟：

A、原料預(yù)處理

將牦牛軟肋、月牙骨等軟骨投入恒溫蒸煮鍋中, 加水淹沒過軟骨于恒溫80淹蒸煮6h，蒸煮過程中去除殘留的肌肉、脂肪和其他結(jié)締組織蒸煮后的軟骨撈出用水沖洗干凈，切成1～2cm³小塊，然后將軟骨小塊放入烘箱，恒溫60，烘干8h至恒重，再粉碎為200目制得牦牛軟骨粉粒；

B、超聲波輔助堿鹽提取

每克牦牛軟骨粉粒中加入9ml質(zhì)量濃度10％的NaOH溶液，上述溶液中逐漸加入NaCl粉末溶解使溶液中Na⁺離子摩爾濃度升至4mol/L，置于超聲波清洗器中超聲處理3.5h，雙層200目紗布濾除殘?jiān)?，濾液備用；

C、木瓜蛋白酶酶解

步驟B中濾液滴加濃度2mol/L的HCL溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2，上述溶液加入木瓜蛋白酶，使木瓜蛋白酶質(zhì)量濃度為200溶液加入木瓜，于500水解2.5h，水解后將水浴升高至85解滅酶；

D、吸附、脫蛋白

滅酶濾液中加入3g活性炭粉末進(jìn)行吸附，吸附過程中間歇攪拌4h，于4于下靜置自然澄清，抽取上清液；

E、醇沉

上清液中加入無水乙醇使乙醇質(zhì)量濃度升至70％，室溫下靜置10h后，轉(zhuǎn)速5000r/min下離心處理5min后回收固體物質(zhì)，固體物質(zhì)用無水乙醇洗滌脫水兩次；

F、真空干燥

固體物質(zhì)在恒溫60物、真空度0.07Mpa下真空干燥至恒溫，研磨粉碎成400～550目粉末制得硫酸軟骨素成品。

實(shí)施例3

一種牦牛軟骨硫酸軟骨素的制備方法，包括如下步驟：

A、原料預(yù)處理

將牦牛軟肋、月牙骨等軟骨投入恒溫蒸煮鍋中, 加水淹沒過軟骨于恒溫80淹蒸煮5h，蒸煮過程中去除殘留的肌肉、脂肪和其他結(jié)締組織蒸煮后的軟骨撈出用水沖洗干凈，切成1～2cm³小塊，然后將軟骨小塊放入烘箱，恒溫60，烘干7h至恒重，再粉碎為200目制得牦牛軟骨粉粒；

B、超聲波輔助堿鹽提取

每克牦牛軟骨粉粒中加入6.5ml質(zhì)量濃度8％的NaOH溶液，上述溶液中逐漸加入NaCl粉末溶解使溶液中Na⁺離子摩爾濃度升至2.5mol/L，置于超聲波清洗器中超聲處理2.7h，雙層200目紗布濾除殘?jiān)?，濾液備用；

C、木瓜蛋白酶酶解

步驟C中濾液滴加濃度2mol/L的HCL溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，上述溶液每850ml中加入1g木瓜蛋白酶，于恒溫37蛋水解1.5h，水解后將水浴升高至85解滅酶；

D、吸附、脫蛋白

滅酶濾液中加入g活性炭粉末進(jìn)行吸附，吸附過程中間歇攪拌4h，于4于下靜置自然澄清，抽取上清液；

E、醇沉

上清液中加入無水乙醇使乙醇質(zhì)量濃度升至70％，室溫下靜置9h后，轉(zhuǎn)速5000r/min下離心處理5min后回收固體物質(zhì)，固體物質(zhì)用無水乙醇洗滌脫水兩次；

F、真空干燥

固體物質(zhì)在恒溫60物、真空度0.07Mpa下真空干燥至恒溫，研磨粉碎成400～550目粉末制得硫酸軟骨素成品。

值得說明的是，為更清楚的說明和解釋本實(shí)施例，本實(shí)施例采用實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行闡述。

硫酸軟骨素制備方法，包括如下步驟：

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1原料處理

牦牛軟骨于沸水中煮3-4h，撈起后去除殘留脂肪、肌肉及其他結(jié)締組織，用自來水沖洗干凈后烘干，用粉碎機(jī)慢慢粉碎，放置4℃冰箱里保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 牦牛軟骨CS制備工藝流程

牦牛軟骨粉→超聲波輔助堿鹽提取→紗布過濾→濾液→調(diào)節(jié)pH→木瓜蛋白酶酶解→滅酶→活性炭脫色→離心去蛋白→上清液→乙醇沉淀→乙醇洗條脫水→干燥→CS成品

1.3 牦牛硫酸軟骨素含量測(cè)定

本試驗(yàn)用硫酸-咔唑法測(cè)定牦牛硫酸軟骨素的含量。

1.3.1 試劑的配制

①D-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。D-葡萄糖醛酸采用經(jīng)105℃干燥至恒重，作為D-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品，精確稱取0.0100g標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶解定容于100mL容量瓶中，作為母液備用。②供試品溶液。準(zhǔn)確稱取硫酸軟骨素樣品0.0200g，用蒸餾水溶解定容于100 mL容量瓶中，待測(cè)。③咔唑試劑。準(zhǔn)確稱取咔唑0.1250g用無水乙醇溶解定容于100 mL 棕色容量瓶中，4℃冰箱保存。④硼砂－濃硫酸試劑。稱取四硼酸鈉9.5342g，用濃硫酸溶解定容于1000 mL 棕色容量瓶中，在4℃冰箱保存。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精準(zhǔn)量取D-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液母液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL容量瓶中，然后用蒸餾水定容，得到濃度分別為10、20、30、40、50μg/mL的D-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。取6只試管置于冰浴中冷至4℃左右，分別加入硼砂硫酸液5ml，再分別取不同濃度的D-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各1mL以及空白式樣蒸餾水1mL加入各試管中，混合均勻，此時(shí)用冰浴不斷冷卻。采用沸水浴加熱10min，然后取出冷卻到室溫，可以置于冷水中冷卻。再加入0.2mL咔唑試劑，混合均勻，放入沸水中加熱15min，然后冷至室溫。用空白式樣在530nm波長(zhǎng)處側(cè)吸光度A調(diào)零，將吸光度A作為縱坐標(biāo)，D-葡萄糖醛酸濃度c為橫坐標(biāo)作圖，可繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3樣品含量的測(cè)定

精確量取供試品溶液1.0mL，同樣按上述方法操作，測(cè)定A530nm，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中D-葡萄糖醛酸濃度,然后根據(jù)換算公式?求得牦牛硫酸軟骨素的含量。

硫酸軟骨素含量(%)＝葡萄糖醛酸含量/45.12%×100% ?

1.4超聲波輔助堿鹽提取條件的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其優(yōu)化

1.4.1 單因素試驗(yàn)

將硫酸軟骨素含量作為指標(biāo)，對(duì)牦牛硫酸軟骨素超聲波輔助堿鹽提取各項(xiàng)條件按照下表進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

表1. 超聲波輔助堿鹽提取因素水平編碼表

1.4.2響應(yīng)面法分析與優(yōu)化

根據(jù)得到的單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Benhnken中心設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析優(yōu)化牦牛軟骨硫酸軟骨素的超聲波輔助堿鹽提取工藝。

1.5木瓜蛋白酶酶解條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

1.5.1單因素試驗(yàn)

將硫酸軟骨素含量作為指標(biāo)，對(duì)牦牛硫酸軟骨素超聲波輔助堿鹽提取各項(xiàng)條件按照下表進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

表2木瓜蛋白酶酶解因素水平編碼表

1.5.2響應(yīng)面法分析與優(yōu)化

根據(jù)得到的單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Benhnken中心設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析優(yōu)化牦牛軟骨硫酸軟骨素的木瓜蛋白酶酶解提取工藝。

2 結(jié)果與討論

2.1硫酸-咔唑法測(cè)定牦牛軟骨硫酸軟骨素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

以橫坐標(biāo)是D-葡萄糖醛酸濃度C，縱坐標(biāo)是吸光度A，繪制牦牛軟骨中硫酸軟骨素含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

2.2牦牛軟骨硫酸軟骨素超聲波輔助堿鹽提取單因素試驗(yàn)

本次論文實(shí)驗(yàn)進(jìn)行超聲輔助堿鹽提取的主要作用，目的是為了分解牦牛軟骨的組織結(jié)構(gòu)，從而可以將硫酸軟骨素與其他各成分分開。改提取過程是提高CS含量的關(guān)鍵。其中影響提取效果的條件有堿液濃度、Na⁺濃度、料液比、提取溫度、超聲時(shí)間，本次試驗(yàn)就是以這些為因素條件，分析其對(duì)牦牛軟骨硫酸軟骨素含量的影響。

2.2.1 堿液濃度對(duì)牦牛軟骨CS含量的影響

通過試驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算，并分析作圖(圖2)可以發(fā)現(xiàn)，隨著堿液濃度的逐漸升高，牦牛軟骨CS含量首先是逐步升高達(dá)到最高點(diǎn)，當(dāng)超過最適濃度時(shí)，CS含量就會(huì)逐漸下降。即當(dāng)堿液濃度為6%時(shí)，牦牛軟骨CS含量達(dá)到最高點(diǎn)；堿液濃度大于6%時(shí)，硫酸軟骨素含量就會(huì)逐漸降低。這可能是由于隨著堿液濃度的逐漸升高，處于糖鏈還原端的糖基在堿性條件下，逐漸生成間糖酸和異糖酸而脫落造成了堿對(duì)糖鏈反應(yīng)過度(副反應(yīng))的現(xiàn)象，使得CS含量下降。因此，選擇堿液濃度為6%時(shí)較佳。

2.2.2 Na⁺濃度對(duì)牦牛軟骨CS含量的影響

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得圖3，可看出，隨著Na⁺濃度的上升牦牛軟骨CS含量先升高后又大幅度降低。Na⁺濃度在2.5mol/L 時(shí)CS含量達(dá)到最高。所以2.5mol/L左右為較佳的Na⁺濃度的選擇。高濃度的鹽可使游離蛋白質(zhì)完全沉淀，因此鹽濃度不能過低，否則會(huì)使產(chǎn)品澄清度下降，蛋白質(zhì)沉淀不完全，導(dǎo)致CS含量減少。但過高濃度的鹽不僅會(huì)造成浪費(fèi)，而且也會(huì)降低CS含量。

2.2.3 料液比對(duì)牦牛軟骨CS含量的影響

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可作圖4，從圖中可以看出，隨著料液比的上升牦牛軟骨CS含量先大幅度上升然后又大幅度下降。當(dāng)料液比為1∶7時(shí)得CS含量最高，但當(dāng)料液比高于1∶7時(shí)，CS含量大幅降低，所以料液比1∶7左右為較佳條件。本試驗(yàn)中是以10g牦牛軟骨粉為原料，如果料液比過小，溶劑量就相對(duì)很少，致使溶液濃度過高，不利于多糖的浸出，所以在一定范圍內(nèi)，增大料液比可使原料與堿鹽溶液充分反應(yīng)，使降解更加徹底，提高CS含量，料液比也不能過高，否則會(huì)使堿液體積分?jǐn)?shù)下降，也不利于硫酸軟骨素的提取。

2.2.4 提取溫度對(duì)牦牛軟骨CS含量的影響

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可作圖5，從圖中可以看出，隨著溫度的逐漸上升時(shí)，牦牛軟骨CS含量也在逐漸升高，在溫度達(dá)到40也時(shí)，CS含量達(dá)到最高，溫度繼續(xù)上升超過最適溫度時(shí)，CS含量就會(huì)逐漸下降，當(dāng)提取的溫度為50就，溶液的顏色變?yōu)槌燃t色，說明硫酸軟骨素此時(shí)開始分解，從而嚴(yán)重影響最終的CS含量。所以提取的溫度為40。左右時(shí)為較佳的提取條件。

2.2.5 超聲時(shí)間對(duì)牦牛軟骨CS含量的影響

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可作圖6看出，隨著超聲時(shí)間的增長(zhǎng)牦牛軟骨CS含量先是大幅度升高，當(dāng)超聲時(shí)間為2.5小時(shí)時(shí)，CS含量達(dá)到最高，超聲時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，CS含量又逐漸下降。超聲時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)硫酸軟骨素由于長(zhǎng)時(shí)間處于提取的環(huán)境中，導(dǎo)致硫酸軟骨素發(fā)生降解從而影響最終CS含量。所以超聲時(shí)間為2.5小時(shí)左右時(shí)為較佳的提取條件。

2.3 牦牛軟骨硫酸軟骨素超聲波輔助堿鹽提取的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

利用Box-Benhnken中心設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)原理，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)以堿液濃度、料液比和超聲這三個(gè)因素為自變量，用-1、0、+1來代表堿液濃度、料液比和超聲時(shí)間這三個(gè)自變量因素的低、中、高水平，牦牛軟骨硫酸軟骨素的含量作為試驗(yàn)的響應(yīng)值，設(shè)計(jì)L₁₇(3³)試驗(yàn)，取值見表3。17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為兩個(gè)點(diǎn)，析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中自變量取值在A,B,C構(gòu)成三維頂點(diǎn)為析因點(diǎn)，區(qū)域的中心點(diǎn)為零點(diǎn)，為估計(jì)試驗(yàn)誤差，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次。并對(duì)每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，進(jìn)行了三次平行試驗(yàn)，得到的牦牛軟骨CS含量進(jìn)行計(jì)算，取平均值。

表3 響應(yīng)面三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3.1響應(yīng)面方差分析

用Design-Expert(Response Surface Regression)程序?qū)?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，方差分析表見3.3，并得出回歸方程(1):

CS(%)=50.48+7.87A-0.93B+0.12C+1.26AB+0.25AC+2.97BC-1.74A²-7.34B²-5.98C²

由響應(yīng)面方差分析表4可看出，模型的Prob>F(a)為<0.0001，表示此模型是極其顯著的；模型的失擬項(xiàng)表明模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值間不擬合的概率，表4中模型失擬項(xiàng)的Prob>F(a)為0.1589 >0.05，證明模型失擬項(xiàng)不顯著，模型選擇合適，試驗(yàn)誤差小，可用該模型對(duì)牦牛軟骨硫酸軟骨素提取進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表4響應(yīng)面方差分析

注:(a) Prob>F(a)的大小表示模型和各個(gè)不同考察因素的顯著水平。(b)Prob>F(a)小于0.05表示模型或者各個(gè)不同因素具有顯著影響，Prob>F值小于0.01表明影響非常顯著。

2.3.2響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化

通過對(duì)Design-Expert軟件繪制響應(yīng)面曲線圖與等高線圖(圖7、8、9)來進(jìn)行可視化的分析，用來進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用以及確定最優(yōu)點(diǎn)。

從各響應(yīng)面圖7、圖8、圖9中可以看出，堿液的濃度對(duì)牦牛軟骨硫酸軟骨素含量的影響作用比較明顯，而各因素影響其含量的順序?yàn)閴A液濃度>料液比>超聲時(shí)間。通過響應(yīng)面的分析優(yōu)化，得出硫酸軟骨素含量最高的提取條件為：料液比為1g:6.44ml,堿液濃度為7.92%，超聲堿鹽提取時(shí)間為2.68h,牦牛軟骨硫酸軟骨素的含量預(yù)測(cè)值高達(dá)55.65%，在考慮到實(shí)際的情況有所限制，把其改善為料液比為1g：6.5ml,堿液濃度為8%，提取時(shí)間為2.7h，此條件下硫酸軟骨素的產(chǎn)率為55.60%與預(yù)測(cè)值基本相符。

2.4酶解單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1酶解反應(yīng)溫度對(duì)牦牛軟骨CS含量的影響

將超聲輔助堿鹽提取的硫酸軟骨素浸提液晃動(dòng)搖勻，依次均勻分裝到五個(gè)編號(hào)不同的錐形瓶中，均加入活化的木瓜蛋白酶使其濃度均保持為120U/mL，調(diào)節(jié)pH至6.8，分別于30別、35別、40別、45別、50別的水浴鍋中進(jìn)行1.5h酶解,結(jié)果如圖10所示。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酶解反應(yīng)的溫度為40。時(shí)，牦牛軟骨中葡萄糖醛酸的百分含量為18.85%，硫酸軟骨素的百分含量為41.78%。當(dāng)酶解反應(yīng)溫度過低或過高時(shí)，硫酸軟骨素含量都會(huì)隨之而降低，這是由于溫度對(duì)木瓜蛋白酶的酶活性的影響比較大。溫度過高酶失活，降解程度也跟著降低。因此，選擇酶解溫度為40酶時(shí)較佳。

2.4.2酶反應(yīng)濃度對(duì)CS百分含量的影響

將超聲輔助堿鹽提取的牦牛軟骨硫酸軟骨素浸提液晃動(dòng)搖勻，依次均勻分裝到五個(gè)編號(hào)的錐形瓶中，經(jīng)量取體積計(jì)算，各加入不同量的木瓜蛋白酶活化液，使酶解反應(yīng)體系中酶濃度(U/mL)依次為40、80、120、160、200U/mL，調(diào)節(jié)pH至6.8，在溫度為40溫的水浴鍋中進(jìn)行1.5h酶解，結(jié)果如圖11所示。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，在其他因素一定的情況下，硫酸軟骨素的百分含量會(huì)隨著酶反應(yīng)濃度的增大而增加。當(dāng)酶濃度為120U/mL，酶解物中牦牛硫酸軟骨素百分含量達(dá)到最大值41.78%。當(dāng)酶濃度超過120U/mL以上，硫酸軟骨素含量反而降低。這是因?yàn)檩^低的酶濃度，不能使所有的反應(yīng)物都能與酶物質(zhì)相結(jié)合，致使蛋白質(zhì)的水解程度不夠徹底;而當(dāng)酶反應(yīng)濃度逐漸增大時(shí)，體系中底物就可以與酶分子充分相結(jié)合，此時(shí)硫酸軟骨素多以蛋白多糖的形式存在，并得到充分的釋放，牦牛軟骨的硫酸軟骨素百分含量升高。

2.4.3酶解液pH值對(duì)牦牛軟骨CS的影響

將超聲輔助堿鹽提取后的硫酸軟骨素浸提液晃動(dòng)搖勻，依次均勻分裝到已經(jīng)編號(hào)的五個(gè)錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH使其值分別為6.4、6.6、6.8、7.0、7.2，然后加入活化后的木瓜蛋白酶液使其酶反應(yīng)濃度均為120U/mL，都在溫度為40在的水浴鍋中進(jìn)行1.5h酶解，結(jié)果如圖12所示。從圖中可以看出，酶解反應(yīng)體系中牦牛軟骨硫酸軟骨素的百分含量會(huì)隨著pH值的升高而增加。當(dāng)pH值為6.8時(shí)，牦牛軟骨中硫酸軟骨素百分含量達(dá)到最大值為41.78%；pH值超過6.8時(shí)，牦牛軟骨硫酸軟骨素含量就會(huì)逐漸減少。這是因?yàn)槊副旧硎且环N蛋白質(zhì)，且具有活性，pH值會(huì)影響其穩(wěn)定性，進(jìn)而影響酶與底物的結(jié)合以及酶催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的效率，所以說，在酶解反應(yīng)期間應(yīng)注意pH值的調(diào)節(jié)，以保持pH值的恒定。

2.4.4酶解反應(yīng)時(shí)間對(duì)CS百分含量的影響

將超聲輔助堿鹽提取的牦牛軟骨硫酸軟骨素浸提液晃動(dòng)搖勻，依次均勻分裝到五個(gè)已經(jīng)編號(hào)的錐形瓶中，分別加入活化的木瓜蛋白酶液使其酶濃度均為120U/mL，調(diào)節(jié)pH值至6.8，于408條件下分別酶解0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h，結(jié)果如圖13所示。從圖中可以看出，牦牛軟骨中硫酸軟骨素的百分含量會(huì)隨著酶解反應(yīng)時(shí)間的增加而提高。當(dāng)酶解反應(yīng)時(shí)間為1.5h時(shí)，牦牛軟骨中硫酸軟骨素含量可達(dá)到最大值為41.78%。一旦酶解反應(yīng)時(shí)間超過1.5h以后，整個(gè)反應(yīng)體中系牦牛軟骨硫酸軟骨素百分含量逐漸降低。這表明酶解反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)或者是過短都會(huì)對(duì)牦牛軟骨CS含量都會(huì)造成明顯的影響。

2.5牦牛軟骨硫酸軟骨素酶解提取的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

利用Box-Benhnken中心設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)原理，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)以酶解溫度、pH和加酶量這三個(gè)因素為自變量，用-1、0、+1來代表酶解溫度、pH和加酶量這三個(gè)自變量因素的低、中、高水平，牦牛軟骨硫酸軟骨素的含量作為試驗(yàn)的響應(yīng)值，設(shè)計(jì)L₁₇(3³)試驗(yàn)，取值見表5。

表5 響應(yīng)面三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.5.1響應(yīng)面方差分析

用Design-Expert(Response Surface Regression)程序?qū)?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，方差分析表見6，并得出回歸方程(1):

CS(%)=90.03-7.59A-0.90B-6.21C+2.18AB-1.24AC-3.15BC-4.83A²-9.36B²-8.60C²

由響應(yīng)面方差分析表6可看出，模型的Prob>F(a)為<0.0001，表示此模型是極其顯著的；模型的失擬項(xiàng)(Lack of Fit)表明模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值間不擬合的概率，表6中模型失擬項(xiàng)的Prob>F(a)為0.2269 >0.05，證明模型失擬項(xiàng)不顯著，模型選擇合適，試驗(yàn)誤差小，可用該模型對(duì)牦牛軟骨硫酸軟骨素提取進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表6響應(yīng)面方差分析

注:(a) Prob>F(a)的大小表示模型和各個(gè)不同考察因素的顯著水平。(b)Prob>F(a)小于0.05表示模型或者各個(gè)不同因素具有顯著影響，Prob>F值小于0.01表明影響非常顯著。

2.5.2響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化

通過對(duì)Design-Expert軟件繪制響應(yīng)面曲線圖來進(jìn)行可視化的分析，用來進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用以及確定最優(yōu)點(diǎn)。

從各響應(yīng)面圖14、圖15、圖16中可以看出，酶解溫度對(duì)牦牛軟骨硫酸軟骨素含量的影響作用比較明顯，而各因素影響其含量的順序?yàn)槊附鉁囟?gt;加酶量>pH。通過響應(yīng)面的分析優(yōu)化，得出硫酸軟骨素含量最高的提取條件為：酶解溫度為37.32面的分析為6.89，加酶量為1︰829，牦牛軟骨硫酸軟骨素的含量預(yù)測(cè)值高達(dá)91.56%，在考慮到實(shí)際的情況有所限制，把其改善為酶解溫度為37.00實(shí)，pH為6.9，加酶量為1︰830，此條件下硫酸軟骨素的產(chǎn)率為91.25%與預(yù)測(cè)值基本相符。

綜上，在超聲料液比1g：6.5ml、8%堿液濃度、提取時(shí)間2.7h，酶解溫度37.00提、pH為6.9、加酶量1︰830（120）條件下，硫酸軟骨素的產(chǎn)率可達(dá)91.25%。