本發(fā)明屬于基因診斷制品技術領域，具體涉及一種晶體蛋白βB2(CRYBB2)在制備檢測先天性白內(nèi)障基因診斷制品中的應用。

發(fā)明背景

先天性白內(nèi)障(congenital cataract)是導致兒童低視力和盲的常見眼病，發(fā)病率約為0.01％-0.06％，白內(nèi)障能導致嬰幼兒失明或弱視，失明兒童中有22％～30％為白內(nèi)障所致，是一組嚴重的致盲疾病，嚴重影響兒童的視力發(fā)育，已成為兒童失明的第二位原因。先天性白內(nèi)障可獨立發(fā)生，也可作為眼部或全身綜合征的伴發(fā)癥狀，常累及雙眼，常伴發(fā)眼前節(jié)發(fā)育不良，如虹膜缺損、Peters異常、瞳孔異位及眼球震顫等，這些多發(fā)畸形常使大多數(shù)患者喪失視力，是先天性致盲的重要原因之一。該病目前尚缺乏有效的治療手段，因此嚴重影響著患者的生活質(zhì)量，給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟和精神負擔。

迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)200多個基因和位點與先天性白內(nèi)障相關，先天性白內(nèi)障基因/位點的鑒定對揭示先天性白內(nèi)障疾病的致病機理及研究其防治措施具有重要意義。與先天性白內(nèi)障相關的基因編碼的蛋白涉及到晶狀體蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、連接蛋白及跨膜轉(zhuǎn)運蛋白等。國內(nèi)外的遺傳學研究結(jié)果表明該病很大程度上是由于遺傳因素導致的。先天性白內(nèi)障具有顯著的遺傳異質(zhì)性，存在多個候選致病基因，這已經(jīng)成為先天性白內(nèi)障的發(fā)病機制的研究以及針對病因的診斷和治療研究的瓶頸。這種現(xiàn)狀促使進一步去發(fā)現(xiàn)和了解該病新的致病基因，為后續(xù)的基因診斷、產(chǎn)前診斷及基因治療提供基礎。

先天性白內(nèi)障發(fā)病較早，病情逐漸進展，常雙眼發(fā)病，對視力影響嚴重，早期治療至關重要，但嬰幼兒先天性白內(nèi)障的延遲發(fā)現(xiàn)和治療現(xiàn)象在我國十分嚴重，術后并發(fā)癥多并且容易復發(fā)，加之手術費用昂貴，給患者家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟和精神負擔。建立先天性白內(nèi)障的相關的基因突變檢測系統(tǒng)，并應用于臨床工作和優(yōu)生優(yōu)育，有助于遺傳性先天性白內(nèi)障的基因診斷和相應的基因治療，有助于突變基因攜帶者的檢出，有助于通過產(chǎn)前檢查降低疾病的發(fā)生率，有助于有效地控制這種疾病的發(fā)生。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種CRYBB2基因在制備檢測先天性白內(nèi)障診斷制品中的應用，從而彌補現(xiàn)有技術的不足。

申請人從一個3代呈常染色體顯性遺傳的先天性白內(nèi)障家系中，對該家系中一名患者進行了視覺系統(tǒng)異常相關單基因遺傳病的505個基因的二代高通量測序，經(jīng)一代測序法驗證找到了該家系的致病基因CRYBB2存在遺傳上的致病突變，從而促成了本發(fā)明。

本發(fā)明首先提供CRYBB2基因用途，是在制備用于檢測先天性白內(nèi)障診斷制品中的應用；

上述的診斷制品，作為實施例的優(yōu)選，是檢測先天性白內(nèi)障的引物。

上述的引物對，其引物信息如下：

CRYBB2-1F:GTCTCAAGGCCCCACAGAG SEQ ID NO:1

CRYBB2-1R:GAAGGGCAACTAAGTCTGGG SEQ ID NO:2

CRYBB2-2F:CCACGTCTACCACCCAGTTC SEQ ID NO:3

CRYBB2-2R:CACAACTTGATCACCTCACCC SEQ ID NO:4

CRYBB2-3F:CTGCCATAGGAAGCTTGGAG SEQ ID NO:5

CRYBB2-3R:GGTGGCAGAGAGAGAAAGTAGG SEQ ID NO:6

CRYBB2-4F:GAGCATGGGGTGGGAAG SEQ ID NO:7

CRYBB2-4R:GACCCCAGAGTCTCAGTTCC SEQ ID NO:8

CRYBB2-5F:GGCTTCACCCTTCCTAGTGG SEQ ID NO:9

CRYBB2-5R:CTGTTGCCCTACTCCTAGCAC SEQ ID NO:10。

本發(fā)明還提供一種用于檢測先天性白內(nèi)障的試劑盒，包含有上述的引物對中的兩種或幾種。

本發(fā)明還提供一種與先天性白內(nèi)障疾病相關的SNP位點，為CRYBB2基因編碼區(qū)域由起始密碼子起第355位堿基。

其中用于檢測上述SNP位點的引物信息如下：

CRYBB2-4F:GAGCATGGGGTGGGAAG SEQ ID NO:7

CRYBB2-4R:GACCCCAGAGTCTCAGTTCC SEQ ID NO:8

本發(fā)明提供了CRYBB2基因的新的用途，從而提供了一種有效的進行先天性白內(nèi)障疾病基因診斷、產(chǎn)前基因篩查及遺傳咨詢的途徑，應用效果表明本發(fā)明所提供的基因的SNP位點及檢測引物可以有效的用于臨床患者及胎兒絨毛或羊水進行CRYBB2基因突變位點的快速檢測。

附圖說明

圖1：實施例1的先天性白內(nèi)障家系內(nèi)患者CRYBB2測序圖，其中A：患者父親，正常表型；B：患者。該家系中三名患者CRYBB2基因編碼區(qū)域由起始密碼子起第355位堿基發(fā)生了雜合突變，其堿基由G變?yōu)锳。

具體實施方式

申請人在一個先天性白內(nèi)障家系中發(fā)現(xiàn)CRYBB2基因的突變位點，并證實該基因的突變是該病的致病基因，從而促成了本發(fā)明。

CRYBB2基因位于染色體22q11.23,可轉(zhuǎn)錄成大約618bp的mRNA(NCBI登錄號為NM_000496.2)，直接翻譯形成205個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。

實施例1：從先天性白內(nèi)障家系中篩選CRYBB2基因的突變位點

1、提取外周血基因組DNA：

在符合國家相關政策規(guī)定，并在取樣對象同意的基礎上，抽取家系成員外周靜脈血2-5ml，放入EDTA抗凝管內(nèi)，-80℃凍存?zhèn)溆茫粌龃娴腅DTA抗凝血在室溫融化后，取500μL放于離心管，加入等體積TE(pH8.0)，混勻，4℃，10000rpm離心10分鐘，棄上清。

加入180μL TE、20μLSDS(10％)、8μL蛋白酶K(l0mg/ml)混勻，置于37℃水浴過夜。從水浴中取出樣品，瞬時離心沉淀樣本。在反應管中加入等體積的Tris-飽和酚(約300μL)，充分混勻，室溫下10000rpm離心10分鐘，吸取上清液(約300μL)至一新離心管中。重復酚抽提一次，吸取上清液至一新離心管中。

加入等體積的Tris飽和酚:氯仿混合液(酚、氯仿各150μL)，混勻，室溫10000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至一新離心管。

加入等體積的Tris飽和酚:氯仿:異戊醇混合液(酚、氯仿、異戊醇各100μL)，混勻，室溫10000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至一新離心管。

加入l/10體積3mol/L、pH5.2醋酸鈉(約30μL)，2倍體積預冷100％乙醇，輕輕混合，可見白色絮狀沉淀。室溫10000rpm離心10分鐘，使DNA沉淀于管底，棄上清。

向DNA沉淀加入70％乙醇，漂洗一次，室溫7000rpm離心5分鐘，棄上清，置于室溫中揮發(fā)剩余乙醇，最后加入50μL TE(pH8.0)，4℃過夜溶解DNA。

對提取的DNA行瓊脂糖膠電泳，并應用紫外分光光度計在260nm和280nm比色，檢測DNA純度及濃度。

2、目標序列捕獲高通量測序：目標序列捕獲高通量測序技術是一種新型的基因組分析技術，使用一套核苷酸探針捕獲基因組上的目標序列，然后使用通用引物對這些捕獲到的序列進行擴增，再對這些擴增產(chǎn)物進行高通量生物信息學分析。取該家系中1名患者的基因組DNA，由北京德易東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心有限公司應用探針捕獲人類視覺系統(tǒng)異常相關單基因遺傳病的505個基因的外顯子區(qū)域，然后對富集的外顯子文庫進行高通量測序。將突變?yōu)V過4個正常人數(shù)據(jù)庫：單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，千人基因組計劃(ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/)，Hapmap8數(shù)據(jù)庫(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，及炎黃數(shù)據(jù)庫(http://yh.genomics.org.cn/)，應用直接測序法在該家系內(nèi)篩選到與致病單倍體型共分離的致病基因CRYBB2，并在正常人群外周血基因組DNA樣本中進行該位點的突變篩查，未發(fā)現(xiàn)該突變。

3、直接測序法尋找該家系內(nèi)患者CRYBB2基因的突變

PCR擴增目的片段：反應條件與反應體系：

(1)PCR反應條件：94℃3min；94℃40sec，55℃40se，72℃60sec，30-35cycles；72℃10min。

(2)反應體系：(TAKARA LA Taq polymerase)

應用該反應體系分別進行每名家系成員的基因組DNA模板與該CRYBB2引物的擴增反應。

PCR產(chǎn)物測序：應用常規(guī)Sanger測序法對上述PCR產(chǎn)物進行測序，其中應用引物對CRYBB2-4F:GAGCATGGGGTGGGAAG，CRYBB2-4R:GACCCCAGAGTCTCAGTTCC，在該家系中三名患者的CRYBB2基因編碼區(qū)域由起始密碼子起第355位堿基發(fā)生了雜合突變，其堿基由G變?yōu)锳(圖1)。多次測序結(jié)果表明該突變位點并不是因為擴增或測序錯誤引進的。該突變?yōu)橐恍律蛔?。該突變不存在于下面的四個數(shù)據(jù)庫中：單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫，千人基因組計劃，Hapmap8數(shù)據(jù)庫及炎黃數(shù)據(jù)庫，表明該突變非常罕見，該突變導致了CRYBB2蛋白第119位氨基酸由甘氨酸突變位精氨酸。應用點突變預測程序SIFT(Sorting Intolerant From Tolerant)預測發(fā)現(xiàn)，該突變導致了CRYBB2蛋白功能“damaging”級的損壞，從而引起了該家系中患者先天性白內(nèi)障的發(fā)生。而在200例正常當?shù)厝巳旱耐庵苎蚪MDNA樣本中進行該位點的突變篩查，未發(fā)現(xiàn)該突變。

根據(jù)CRYBB2的基因組序列設計擴增其各外顯子的引物對，其正反引物的序列信息如下：

CRYBB2-1F:GTCTCAAGGCCCCACAGAG

CRYBB2-1R:GAAGGGCAACTAAGTCTGGG

CRYBB2-2F:CCACGTCTACCACCCAGTTC

CRYBB2-2R:CACAACTTGATCACCTCACCC

CRYBB2-3F:CTGCCATAGGAAGCTTGGAG

CRYBB2-3R:GGTGGCAGAGAGAGAAAGTAGG

CRYBB2-4F:GAGCATGGGGTGGGAAG

CRYBB2-4R:GACCCCAGAGTCTCAGTTCC

CRYBB2-5F:GGCTTCACCCTTCCTAGTGG

CRYBB2-5R:CTGTTGCCCTACTCCTAGCAC

分別應用上述的每一對引物進行CRYBB2基因的檢測。

另在山東地區(qū)收集診斷明確的先天性性白內(nèi)障散發(fā)患者一名，提取其外周血基因組DNA，應用該患者的DNA模板與CRYBB2-4L和CRYBB2-4R引物進行PCR擴增，應用常規(guī)Sanger測序法對上述PCR產(chǎn)物進行測序，該患者的CRYBB2基因存在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的SNP突變，即編碼區(qū)域由起始密碼子起第355位堿基發(fā)生了雜合突變，其堿基由G變?yōu)锳。

通過上述的分析，證明CRYBB2基因可以用來檢測患者是否具有潛在患先天性白內(nèi)障的危險。通過將檢測者的CRYBB2基因的各外顯子片段于正常的對應片段比較，確定待檢測者的患病風險。