本發(fā)明涉及的是制備米糠蛋白ACE抑制肽的方法，具體涉及高壓電場(chǎng)與酶法復(fù)合制備米糠蛋白ACE抑制肽的方法。
二、
背景技術(shù)：
米糠是稻谷的副產(chǎn)品之一，是一種量大面廣的可再生資源，我國(guó)對(duì)于米糠的深度開(kāi)發(fā)利用及相應(yīng)理論研究尚處于低水平階段，大部分作為畜禽飼料被浪費(fèi)掉，僅有少量用來(lái)榨油或提取植酸鈣、肌醇、谷維素等較高價(jià)值的再生產(chǎn)品。米糠重量雖只占稻米重量的6%-8%，但卻含有90%以上人體必需元素，米糠還含有抗癌及其他促進(jìn)人體健康的功能性物質(zhì)，如膳食纖維，維生素、礦物質(zhì)、谷維素、植酸、蛋白酶抑制劑等；同時(shí)還可以從廉價(jià)的米糠資源中獲得高價(jià)值的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、蛋白活性肽、生育酚、二十八碳烷醇、角鯊烯、神經(jīng)酰胺等，對(duì)人體健康和現(xiàn)代文明病的預(yù)防及治療具有重要作用。
米糠蛋白肽易于被人體吸收利用，同時(shí)兼具低過(guò)敏性、溶解性好等特點(diǎn)，并且米糠蛋白肽在抗氧化、降血壓血脂、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性、阿片樣拮抗活性、免疫調(diào)節(jié)等生物功能活性方面都已有相關(guān)報(bào)道，是一種非常有實(shí)用前途的功能活性肽。ACE抑制肽是對(duì)現(xiàn)代常見(jiàn)病高血壓具有良好生理調(diào)節(jié)功效的一類生物活性肽。與化學(xué)合成ACE抑制劑或藥物相比，從天然食源性物質(zhì)中獲取的ACE抑制劑雖見(jiàn)效較慢，但易被人體吸收利用，同時(shí)調(diào)節(jié)血壓時(shí)效更長(zhǎng)，相對(duì)溫和持久，對(duì)人體腎臟、肝臟等器官無(wú)毒副作用。
三、
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了高壓電場(chǎng)與酶法復(fù)合制備米糠蛋白ACE抑制肽的方法，這種高壓電場(chǎng)與酶法復(fù)合制備米糠蛋白ACE抑制肽的方法縮短酶解時(shí)間，提高米糠蛋白ACE抑制肽活性。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的具體技術(shù)方案如下：這種高壓電場(chǎng)與酶法復(fù)合制備米糠蛋白ACE抑制肽的方法：
一、以米糠為原料提取米糠蛋白；
二、向米糠蛋白中加入蒸餾水配制成懸浮液，控制底物質(zhì)量百分比濃度為2-6%，將溫度升溫至90℃，加熱預(yù)處理10min；加入1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值，恒溫恒pH下攪拌15min，待pH穩(wěn)定后加入蛋白酶水解40-90min，水解過(guò)程中進(jìn)行高壓電場(chǎng)處理，電場(chǎng)強(qiáng)度500-1000v/cm、酶解溫度55-63℃、pH 7.8-8.5；反應(yīng)結(jié)束后迅速加熱10 min，對(duì)蛋白酶進(jìn)行充分的滅活處理；離心分離酶解液，收集上清液，即得米糠蛋白水解液；
三、將米糠蛋白水解液冷凍干燥，得到米糠蛋白ACE抑制肽。
上述方案中蛋白酶為堿性蛋白酶Alcalase2.4 L，堿性蛋白酶Alcalase2.4 L的酶用量為2000U/g。
上述方案中步驟二中離心分離酶解液的轉(zhuǎn)速為4000r/min，離心時(shí)間15min。
上述方案中步驟二中酶解時(shí)間90min、底物濃度3.6%、電場(chǎng)強(qiáng)度750v/cm、酶解溫度62℃、pH8.5。
上述方案步驟三得到的米糠蛋白ACE抑制肽的抑制率為78.30%。
有益效果：
1、本發(fā)明與常規(guī)酶解方法相比，可縮短酶解時(shí)間60mim，提高米糠蛋白ACE抑制肽活性12%。
2、在一定范圍內(nèi)，高壓電場(chǎng)作用下可促進(jìn)蛋白酶的活力，本發(fā)明利用高壓電場(chǎng)在一定范圍內(nèi)活化酶,激發(fā)了酶更多的活性位點(diǎn)或是增大了酶現(xiàn)存活性位點(diǎn)起催化作用的范圍, 因此提高了反應(yīng)速率，縮短了酶解時(shí)間。
四、具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明：
實(shí)施例1：
一、以米糠為原料提取米糠蛋白；
二、向米糠蛋白中加入蒸餾水配制成懸浮液，控制底物質(zhì)量百分比濃度為2%，將溫度升溫至90℃，加熱預(yù)處理10min；加入1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值，恒溫恒pH下攪拌15min，待pH穩(wěn)定后加入蛋白酶水解40min，水解過(guò)程中進(jìn)行高壓電場(chǎng)處理，電場(chǎng)強(qiáng)度500v/cm、酶解溫度55℃、pH7.8，蛋白酶為堿性蛋白酶Alcalase2.4L，堿性蛋白酶Alcalase2.4L的酶用量為2000U/g；反應(yīng)結(jié)束后迅速加熱10min，對(duì)蛋白酶進(jìn)行充分的滅活處理；離心分離酶解液，離心分離酶解液的轉(zhuǎn)速為4000r/min，離心時(shí)間15min，然后收集上清液，即得米糠蛋白水解液；
三、將米糠蛋白水解液冷凍干燥，得到米糠蛋白ACE抑制肽，得到的米糠蛋白ACE抑制肽的抑制率為78.30%。
米糠蛋白ACE抑制肽的抑制率測(cè)得方法如下：將ACE底物HHL溶于0.1mol/L的含0.3mol/L NaCl的硼酸鹽緩沖液中（pH8.3），配制成5.0mol/L的濃度。取50μL 5mol/L HHL溶液與20μL ACE抑制劑混合，在37℃恒溫水浴中預(yù)熱5min。隨后加入10.0μL 的0.1U/mL ACE溶液，37℃反應(yīng)30min。迅速加入100μL 的1 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)，并加入蒸餾水至0.5mL。在避光條件下加入0.6mL喹啉，旋渦器上混合10s后加入0.2mL苯磺酰氯（BSC），立即蓋緊離心管管塞在旋渦混合器上混合20s，反應(yīng)液在30℃恒溫水浴鍋中避光放置30min。隨后向管中加入3.7mL無(wú)水乙醇，混勻，繼續(xù)避光放置30min 。用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)492nm的吸光值，計(jì)算ACE抑制程度。
式中：Aa：ACE及ACE抑制劑都存在的條件下的吸光度；
Ab：ACE抑制劑不參與反應(yīng)的條件下測(cè)得的吸光度；
Ac：ACE不參與反應(yīng)的條件下的吸光度。
實(shí)施例2：
一、以米糠為原料提取米糠蛋白；
二、向米糠蛋白中加入蒸餾水配制成懸浮液，控制底物質(zhì)量百分比濃度為3.6%，將溫度升溫至90℃，加熱預(yù)處理10min；加入1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值，恒溫恒pH下攪拌15min，待pH穩(wěn)定后加入蛋白酶水解90min，水解過(guò)程中進(jìn)行高壓電場(chǎng)處理，電場(chǎng)強(qiáng)度750v/cm、酶解溫度62℃、pH8.5，蛋白酶為堿性蛋白酶Alcalase2.4L，堿性蛋白酶Alcalase2.4L的酶用量為2000U/g；反應(yīng)結(jié)束后迅速加熱10min，對(duì)蛋白酶進(jìn)行充分的滅活處理；離心分離酶解液，離心分離酶解液的轉(zhuǎn)速為4000r/min，離心時(shí)間15min，然后收集上清液，即得米糠蛋白水解液；
三、將米糠蛋白水解液冷凍干燥，得到米糠蛋白ACE抑制肽，得到的米糠蛋白ACE抑制肽的抑制率為78.30%。
實(shí)施例3：
一、以米糠為原料提取米糠蛋白；
二、向米糠蛋白中加入蒸餾水配制成懸浮液，控制底物質(zhì)量百分比濃度為6%，將溫度升溫至90℃，加熱預(yù)處理10min；加入1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值，恒溫恒pH下攪拌15min，待pH穩(wěn)定后加入蛋白酶水解60min，水解過(guò)程中進(jìn)行高壓電場(chǎng)處理，電場(chǎng)強(qiáng)度1000v/cm、酶解溫度60℃、pH8，蛋白酶為堿性蛋白酶Alcalase2.4L，堿性蛋白酶Alcalase2.4L的酶用量為2000U/g；反應(yīng)結(jié)束后迅速加熱10min，對(duì)蛋白酶進(jìn)行充分的滅活處理；離心分離酶解液，離心分離酶解液的轉(zhuǎn)速為4000r/min，離心時(shí)間15min，然后收集上清液，即得米糠蛋白水解液；
三、將米糠蛋白水解液冷凍干燥，得到米糠蛋白ACE抑制肽，得到的米糠蛋白ACE抑制肽的抑制率為78.30%。
隨著環(huán)境電場(chǎng)的變化, 生物體內(nèi)物質(zhì)的電荷分布、排列、運(yùn)動(dòng)方式將隨之改變, 從而影響酶的生物活性。蛋白酶活性高會(huì)加快蛋白質(zhì)的分解, 促進(jìn)水解產(chǎn)物多肽的生成速度。酶活發(fā)生變化的機(jī)制可能是電場(chǎng)處理引發(fā)酶關(guān)鍵部位發(fā)生氧化反應(yīng), 也可能是酶的靜電性質(zhì)和構(gòu)象發(fā)生改變。
本發(fā)明應(yīng)用堿性蛋白酶Alcalase2.4 L結(jié)合高壓電場(chǎng)強(qiáng)度處理后, ACE抑制率提高，說(shuō)明高壓電場(chǎng)作用下可促進(jìn)蛋白酶的活力。高壓電場(chǎng)在一定范圍內(nèi)活化酶, 其機(jī)理可能是電場(chǎng)激發(fā)了酶更多的活性位點(diǎn)或是增大了酶現(xiàn)存活性位點(diǎn)起催化作用的范圍, 因此提高了反應(yīng)速率。