本發(fā)明涉及分子生物學(xué),診斷醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體的說(shuō),本發(fā)明涉及利用瓊脂糖凝膠電泳、毛細(xì)管電泳及T載體克隆測(cè)序的方法對(duì)中國(guó)人群常見(jiàn)SCA亞型1、2、3、6、7、8、17、DRPLA進(jìn)行基因診斷。
背景技術(shù):
遺傳性脊髓小腦型共濟(jì)失調(diào)(SCA)是一類(lèi)包括多種亞型共濟(jì)失調(diào)在內(nèi)的進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,呈常染色體顯性遺傳,發(fā)病率約為5/10萬(wàn),占神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病的10%-15%。病變部位主要在小腦、腦干、脊髓,病理改變形式主要是神經(jīng)元細(xì)胞脫失和膠質(zhì)增生。臨床表現(xiàn)為小腦性共濟(jì)失調(diào),伴構(gòu)音障礙、意向性震顫,眼球活動(dòng)障礙,錐體束和(或)錐體外系征等。SCA在臨床上表現(xiàn)為眾多的類(lèi)型,各型之間常有重疊交叉的癥狀,臨床表現(xiàn)在不同的種族、家系,不同的患者中均不盡相同,致使臨床診斷的標(biāo)準(zhǔn)混雜。近年來(lái),國(guó)外學(xué)者經(jīng)連鎖分析發(fā)現(xiàn)SCA在多條染色體區(qū)帶上存在相關(guān)的致病基因,從而肯定了SCA具有高度的遺傳異質(zhì)性,并且提出今后應(yīng)以基因型作為分型診斷依據(jù)。目前,已定位SCAl,SCA2,SCA3,SCA4,SCA5,SCA6,SCA7,SCA8,SCAIO,SCAll,SCAl2,SCAl3等,并克隆了SCAl,2,3,6,7,8,10基因,發(fā)現(xiàn)SCAl、2、3、6、7基因的編碼區(qū)內(nèi)均含有一段高度多態(tài)的、不穩(wěn)定的CAG三核苷酸重復(fù)序列,其異常擴(kuò)增與致病相關(guān)。
正常人基因內(nèi)的CAG三核苷酸重復(fù)由數(shù)次至數(shù)十次,當(dāng)重復(fù)數(shù)超出正常范圍時(shí),則導(dǎo)致疾病表型出現(xiàn)。異常擴(kuò)增的CAG重復(fù)數(shù)與發(fā)病年齡呈負(fù)相關(guān),與病情嚴(yán)重程度也有一定關(guān)系,且在世代傳遞中不穩(wěn)定,可進(jìn)一步擴(kuò)增,導(dǎo)致后代發(fā)病年齡提早,病情加重,即遺傳早現(xiàn)現(xiàn)象。目前,三核苷酸重復(fù)的動(dòng)態(tài)突變,作為一種新的致病遺傳機(jī)理而被提出,但其產(chǎn)生的分子機(jī)制及致病機(jī)制尚未明確。
目前臨床應(yīng)用上對(duì)于SCA致病基因CAG三核苷酸重復(fù)突變檢測(cè)對(duì)臨床診斷為SCA的患者進(jìn)行進(jìn)一步的分子診斷,多僅單用某一方法進(jìn)行基因診斷,其中聚丙烯酰胺凝膠電泳或者瓊脂糖凝膠電泳,具有高靈敏度的優(yōu)點(diǎn),但是其特異度低,也不能確定具體的CAG重復(fù)次數(shù)。而毛細(xì)管電泳雖能在一定的精確度上確定CAG重復(fù)次數(shù),但是不能很好的確定突變基因內(nèi)部結(jié)構(gòu),其診斷的特異性及靈敏度相對(duì)較低。T載體克隆測(cè)序則能很好的測(cè)定基因內(nèi)部結(jié)構(gòu),但由于可能出現(xiàn)的DNA鏈滑移而不能精確測(cè)定CAG重復(fù)次數(shù)。
SCA1,2,3,6,7,8,17,DRPLA等亞型是中國(guó)人群SCA發(fā)病率最高的8個(gè)亞型,目前的診斷方法多為對(duì)單個(gè)基因進(jìn)行逐個(gè)的分析,尚無(wú)對(duì)這8種亞型的專(zhuān)一的診斷試劑盒。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
所述SCA致病基因CAG三核苷酸重復(fù)突變檢測(cè)試劑盒中含有如下引物,用下述引物對(duì)樣本DNA擴(kuò)增,并依次進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、毛細(xì)管電泳和T載體克隆測(cè)序檢測(cè):
SCA1正向引物:AACTGGAAATGTGGACGTA(SEQ ID NO.1);
SCA1反向引物:CAACATGGGCAGTCTGAG(SEQ ID NO.2);
SCA2正向引物:GGGCCCCTCACCATGTCG(SEQ ID NO.3);
SCA2反向引物:GAGGACGAGGAGACCGAGGAC(SEQ ID NO.4);
SCA3正向引物:CCAGTGACTACTTTGATTCG(SEQ ID NO.5);
SCA3反向引物:CTTACCTAGATCACTCCCAA(SEQ ID NO.6);
SCA6正向引物:CACGTGTCCTATTCCCCTGTGATCC(SEQ ID NO.7);
SCA6反向引物:TGGGTACCTCCGAGGGCCGCTGGTG(SEQ ID NO.8);
SCA7正向引物:TGTTACATTGTAGGAGCGGAA(SEQ ID NO.9);
SCA7反向引物:CACGACTGTCCCAGCATCACTT(SEQ ID NO.10);
SCA8正向引物:TTTGAGAAAGGCTTGTGAGGACTGAGAATG(SEQ ID NO.11);
SCA8反向引物:GGTCCTTCATGTTAGAAAACCTGGCT(SEQ ID NO.12);
SCA12正向引物:TGCTGGGAAAGAGTCGTG(SEQ ID NO.13);
SCA12反向引物:CCCAGCGCACTCACCCTC(SEQ ID NO.14);
SCA17正向引物:ATGCCTTATGGCACTGGACTG(SEQ ID NO.15);
SCA17反向引物:CTGCTGGGACGTTGACTGCTG(SEQ ID NO.16);
DRPLA正向引物:TGACCAACAGCAATGCCCATCCAG(SEQ ID NO.17);
DRPLA反向引物:TCAGAGACCCAGGGAGGGAGACAT(SEQ ID NO.18)。
在使用上述引物對(duì)進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)時(shí),引物對(duì)中正向引物的3’端均加有FAM熒光標(biāo)記。
SCA1,2,3,6,7,8,17,DRPLA等亞型是中國(guó)人群SCA發(fā)病率最高的8個(gè)亞型,本發(fā)明的試劑盒,能對(duì)這8種亞型同時(shí)進(jìn)行篩查,篩查步驟為:
(1)將病人DNA樣本進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,進(jìn)行初步診斷;
(2)將病人DNA樣本進(jìn)行毛細(xì)管電泳,進(jìn)一步診斷;
(3)對(duì)于上述步驟中診斷為“患病”的樣本相應(yīng)亞型進(jìn)行T載體克隆測(cè)序,確定CAG三核苷酸重復(fù)突變次數(shù)。
在上述三步中,只有第二步使用加有熒光標(biāo)記的引物。在第一步,瓊脂糖凝膠電泳中,主要用于PCR擴(kuò)增目的片段,染色用EB,因此不需要熒光;在第二步,必需要用到熒光引物,主要用于PCR擴(kuò)增目的片段,熒光信號(hào)作為檢測(cè)信號(hào);在第三步,T載體克隆測(cè)序中,主要用于PCR擴(kuò)增目的片段,條帶切膠回收,供構(gòu)建重組載體用;因此不需要熒光,也不能加熒光信號(hào)。
本發(fā)明試劑盒是目前國(guó)內(nèi)對(duì)上述八種亞型診斷流程最完善的試劑盒,其成本低,技術(shù)方法成熟可靠,操作步驟相對(duì)簡(jiǎn)便,易于在臨床進(jìn)行推廣,有利于對(duì)疾病進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)和診斷。本發(fā)明融合瓊脂糖凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、T載體克隆測(cè)序這三種方法的突變檢測(cè)試劑盒,能有效提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度。
附圖說(shuō)明
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步具體說(shuō)明。
圖1 SCA1毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果;
圖2 SCA2毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果;
圖3 SCA3毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果;
圖4 SCA6毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果;
圖5 SCA7毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果;
圖6 SCA8毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果;
圖7 SCA12毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果;
圖8 SCA17毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果;
圖9 DRPLA毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施方式
1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目的條帶
1.1PCR體系(25ul)
注:①5*PCR enhancer成分:2.7M甜菜堿,6.7mM DTT,6.7%DMSO,及55ug/ml BSA。
②用于不同亞型檢測(cè)的瓊脂糖凝膠電泳、毛細(xì)管電泳及T載體克隆測(cè)序的PCR反應(yīng)體系(除所用引物外)及溫度(如下)均一致。
③引物使用規(guī)則:不同亞型之間使用不同的引物進(jìn)行擴(kuò)增,具體引物序列參見(jiàn)SEQ ID NO.1—18;應(yīng)用于瓊脂糖凝膠電泳及T載體克隆測(cè)序的PCR使用普通的不加熒光的引物,用于毛細(xì)管電泳的PCR必須使用帶熒光的正向引物或反向引物。
1.2PCR反應(yīng)溫度
2瓊脂糖凝膠電泳
2.1試劑與材料
⑴電泳緩沖液(0.5×TBE或1×TBE)
5×TBE(貯存液):0.45mol/L Tris堿、45mol/L硼酸、0.01mol/L EDTA(高壓蒸汽滅菌后室溫保存)
⑵載樣液
①6×載樣液:40%蔗糖、0.25%溴酚藍(lán);
②2×載樣液:13%蔗糖、0.08%溴酚藍(lán)。
⑶10mg/ml溴化乙錠(EB)
100mg EB溶于10ml水中,溶解后避光保存。
⑷電泳儀
⑸水平電泳槽(包括槽、梳子、凝膠成樣器、電源線)
⑹透射式紫外照射儀(254nm,366nm)
⑺透明膠帶
⑻照相機(jī)或凝膠掃描系統(tǒng)
2.2操作步驟
⑴用膠帶將洗凈干燥的凝膠成樣器兩端封好,置于水平臺(tái)面上,在成樣器的一端約1cm處放置梳子。
⑵稱量所需agarose粉末于錐形瓶中,加入電泳緩沖液,搖勻后置微波爐或電爐上(加石棉網(wǎng))加熱,沸騰后取出搖勻,再加熱,直至凝膠完全熔解,取出室溫冷卻。
⑶待凝膠冷卻至50℃左右,倒入封好的凝膠成樣器,使厚度在5mm左右,盡量避免氣泡產(chǎn)生,若有氣泡,馬上用吸管吸出。
⑷凝膠凝固后,小心拆除膠帶,將凝膠與成樣器一起放入電泳槽中。
⑸加入電泳緩沖液,使液面高于膠面1~2mm,小心向上拔出梳子;用微量移液器將樣品和DNA標(biāo)準(zhǔn)大小樣品分別與載樣液混勻后,加入各加樣孔內(nèi),由于載樣液中蔗糖比重較大,DNA沉入孔底。
⑹蓋上電泳槽,接通電源,調(diào)至適當(dāng)電壓,開(kāi)始電泳。根據(jù)載樣液中溴酚藍(lán)的指示,判斷樣品的大概位置,決定是否終止電泳,在0.8%的agarose中,溴酚藍(lán)位于300bp DNA位置。
⑺切斷電源,取出凝膠,放入0.5μg/ml的EB水溶液中染色10~15分鐘。
⑻將凝膠放到透射式紫外照射儀下觀察結(jié)果,波長(zhǎng)254nm,并用加紅色濾色片的相機(jī)照相或用凝膠掃描系統(tǒng)記錄電泳結(jié)果。
3回收純化PCR產(chǎn)物
⑴干凈的解剖刀從瓊脂糖膠上將目的片斷切下;
⑵稱重,1體積的凝膠(100mg—100μl)中加入3倍體積的QG Buffer,回收柱的最大容量是400mg;
⑶50度水溫孵育10分鐘,或凝膠完全溶解,混合物的顏色應(yīng)和QG Buffer的顏色一致;
⑷加與凝膠等體積的異丙醇,混勻,此步不離心;
⑸將樣品轉(zhuǎn)入柱子中,13000rpm離心1分鐘;
⑹棄洗出液;
⑺加入0.5ml QG Buffer,離心1分鐘;
⑻加入0.75ml PE Buffer洗脫,離心1分鐘;
⑼棄洗出液,再離心1分鐘,將柱子轉(zhuǎn)移至干凈的1.5ml的EP管中,加水離心1分鐘。
運(yùn)用T載體克隆測(cè)序?qū)AG/CAA異常重復(fù)次數(shù)測(cè)定
1、回收PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接
參見(jiàn)pGEM-T說(shuō)明書(shū),按以下配比配制反應(yīng)體系:
將上述溶液混勻,然后將其離心至管底,16℃水浴過(guò)夜連接。
2、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
⑴取一滅菌的50ml離心管,加入10ml LB培養(yǎng)基,接種100μl(1:100)初級(jí)JM109菌液;
⑵固定于搖床上250rpm,37℃振蕩培養(yǎng)(搖至OD為0.4);
⑶3000rpm,4℃離心,10min;
⑷吸去上清,在沉淀中加入10ml冰上預(yù)冷的0.1M CaCl2溶液,重懸菌液,冰上孵育30min;
⑸3000rpm,4℃離心,10min;
⑹吸去上清,在沉淀中加入600μl冰上預(yù)冷的0.1M CaCl2溶液,重懸菌液,插于冰上備用。
3、轉(zhuǎn)化
⑴吸取連接產(chǎn)物5μl加入1.5ml微量離心管中,然后加入100μl制備好的感受態(tài),混勻后插入冰上孵育30min;
⑵于42℃水浴中熱激90sec,之后立即在冰上冷卻5min;
⑶加入600μl無(wú)抗性液體LB培養(yǎng)基,固定于搖床上180rpm,37℃振蕩培養(yǎng)50min;
⑷然后13000rpm離心1min,吸去上層培養(yǎng)基,用中tip吸殘留的100μl無(wú)抗性液體LB培養(yǎng)基打散JM109細(xì)菌,再將JM109細(xì)菌鋪于含A+(60μg/ml)的固體LB培養(yǎng)皿[培養(yǎng)基預(yù)先鋪有IPTG(200g/ml,8μl)和X-gal(20mg/ml,8μl)]上培養(yǎng)過(guò)夜。
4、挑選克隆
次日在藍(lán)白篩選明顯的固體LB培養(yǎng)皿上挑選白色克隆5個(gè),接種在加有3ml含A+液體培養(yǎng)基的15ml離心管中,在搖床上振蕩培養(yǎng)(250rpm,37℃)8h,然后分別取1.5ml菌液用手工法抽提質(zhì)粒;
⑴將菌液加入1.5ml離心管中,13000rpm,離心1分鐘;
⑵加入200μl溶液R1(含RNA酶),用槍打勻;
⑶加入200μl溶液R2,顛倒幾次,靜置4分鐘,加入200μl溶液R3,顛倒幾次,冰上孵育5分鐘;
⑷13000rpm,離心10分鐘,取上清,加入飽和酚300μl、三氯甲烷300μl,混勻;
⑸13000rpm,離心10分鐘,取上層液體,加入600μl三氯甲烷,混勻;
⑹13000rpm,離心10分鐘,取上層液體,加入2倍體積-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇,混勻;
⑺13000rpm,4℃離心15分鐘,倒去液體,吸干后加入75%乙醇洗一次,倒掉,在干燥箱中風(fēng)干,用20μl水溶解。
5、鑒定克隆
單酶切(PVUⅡ)檢測(cè)證實(shí)陽(yáng)性克隆
將上述溶液混勻,然后將其離心至管底,37℃培養(yǎng)箱反應(yīng)1h;取3μl反應(yīng)產(chǎn)物與1μl 6×中性載樣緩沖液混合后,上樣于6%中性聚丙烯酰胺膠,300V電泳40分鐘,銀染觀察結(jié)果。
6、測(cè)序
用QIAprep Spin抽提陽(yáng)性克隆質(zhì)粒
⑴將約5-10ml菌液以3000rpm,室溫離心10分鐘,去上清,收集沉淀,沉淀用250μl P1溶液重懸,將重懸的菌液轉(zhuǎn)入一新的1.5ml離心管;
⑵加入250μl P2溶液,輕輕顛倒4-6次,加入350μl N3溶液,輕輕顛倒4-6次;
⑶10000rpm,離心10分鐘,將上清轉(zhuǎn)移至Spin柱中,10000rpm離心1分鐘,倒掉洗出液;
⑷用500μl PB溶液洗Spin柱,10000rpm離心1分鐘,倒掉洗出,加入750μl PE溶液,10000rpm離心1分鐘,倒掉洗出液;
⑸再次以10000rpm離心1分鐘,去掉Spin柱上殘留的溶液,加入20μl無(wú)菌水至Spin柱中央,靜置5分鐘;
⑹10000rpm離心1分鐘,收集洗出液,測(cè)OD值。以T7、SP6通用引物為測(cè)序引物,對(duì)所提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序,部分患者CAG/CAA重復(fù)次數(shù)通過(guò)8%含7m/L尿素的聚丙烯酰胺凝膠電泳后與分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及已知重復(fù)次數(shù)的片段對(duì)比后估算獲得。
7、正常對(duì)照者CAG/CAA重復(fù)次數(shù)測(cè)定
PCR反應(yīng)條件以及體系同上,各SCA亞型基因CAG/CAA重復(fù)序列的PCR產(chǎn)物在ABIPRISM3100型遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳及片段長(zhǎng)度自動(dòng)分析,分子量標(biāo)準(zhǔn)為GS-400,同時(shí)取已知CAG/CAA重復(fù)次數(shù)的樣品作為內(nèi)對(duì)照。用Genotyper 2.5進(jìn)行分析。CAG/CAA重復(fù)次數(shù)=(片段長(zhǎng)度-內(nèi)對(duì)照長(zhǎng)度)/3+內(nèi)對(duì)照重復(fù)次數(shù)。
結(jié)果
該樣本共檢測(cè)臨床常見(jiàn)的SCA1、2、3、6、7、8、12、17、DRPLA等常見(jiàn)常染色體顯性遺傳共濟(jì)失調(diào)的亞型,所有樣本CAG重復(fù)次數(shù)均處于正常范圍(見(jiàn)表1),建議結(jié)合臨床進(jìn)一步分析。
表1
最后所應(yīng)說(shuō)明的是,以上具體實(shí)施方式僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制,盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明,本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解,可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換,而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍,其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。