本發(fā)明涉及術(shù)語(yǔ)中藥材來(lái)源品種鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用核糖體DNA ITS2片段快速鑒別鐵皮石斛干藥材的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo(《中國(guó)植物志》英文版eflora中拉丁名為Dendrobium catenatum Lindley)為蘭科珍稀名貴藥用植物，有“中華九大仙草之首”之盛名。鐵皮石斛對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境條件要求苛刻，其自然繁殖能力低，生長(zhǎng)緩慢，又經(jīng)長(zhǎng)期采挖，自然資源瀕臨枯竭，被列為國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的藥材品種。2010年版《中國(guó)藥典》中關(guān)于鐵皮石斛的描述為“本品為蘭科植物鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo的干燥莖。11月至翌年3月采收，除去雜質(zhì)，剪去部分須根，邊加熱邊扭成螺旋形或彈簧狀，烘干；或截切成段，干燥或低溫烘焙，前者習(xí)稱鐵皮楓斗(耳環(huán)石斛)；后者習(xí)稱鐵皮石斛?！蹦壳?，我國(guó)藥用石斛約有50余種，然而市場(chǎng)上把石斛屬其他植物或蘭科某些植物也作為鐵皮楓斗混入商品流通和臨床應(yīng)用，對(duì)鐵皮石斛的臨床療效和用藥安全產(chǎn)生了很多不良影響。中藥材DNA條形碼分子鑒定技術(shù)依賴樣品自身的基因分子信息，能夠?qū)崿F(xiàn)物種的準(zhǔn)確鑒定。目前該技術(shù)在鐵皮石斛干藥材的鑒定中有以下問(wèn)題：(1)鐵皮楓斗加工過(guò)程中，多有80℃～100℃的加熱過(guò)程，且時(shí)間較長(zhǎng)，會(huì)造成樣品DNA的嚴(yán)重降解，影響DNA的提取效率；(2)鐵皮石斛多糖含量高，嚴(yán)重影響DNA的提取純化；(3)通用引物ITS2F/3R在鐵皮石斛干藥材ITS2序列擴(kuò)增中，擴(kuò)增成功率低。針對(duì)以上問(wèn)題，急需尋找一種穩(wěn)定、可靠的方法用于快速鑒定名貴中藥鐵皮石斛干藥材。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明第一個(gè)目的是提供鐵皮石斛干藥材rDNA ITS2序列的獲取方法。

本發(fā)明第二個(gè)目的是提供利用rDNA ITS2序列鑒別鐵皮石斛干藥材的方法。

本發(fā)明提供的鐵皮石斛干藥材DNA快速提取技術(shù)，針對(duì)多糖含量高、加工過(guò)程造成DNA嚴(yán)重降解的特點(diǎn)，采取以下改進(jìn)：取鐵皮石斛干燥藥材20-30mg，切碎后使用MM400球磨儀粉碎，加入核分離液500-1000μL，充分混勻，7000r/min離心5min，棄上清，加入核分離液500-1000μL，重復(fù)此步驟3-5遍至上清不粘稠。其余步驟參照植物基因組DNA提取試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作方法進(jìn)行。核分離液的配比為：Tris-HCl(pH8.0)終濃度100mmol·L^-1，EDTA(pH8.0)終濃度20mmol·L^-1，NaCl終濃度0.7mol·L^-1，2％PVP-40(W/V)，以上各物質(zhì)配成溶液后滅菌，使用之前加入β-巰基乙醇0.4％(V/V)。

本發(fā)明提供的鐵皮石斛藥材核糖體DNA ITS2片段制備方法主要包括如下步驟：

(1)提取待測(cè)樣品的DNA。

(2)PCR擴(kuò)增ITS2序列，按25μL擴(kuò)增體系進(jìn)行：2×Taq PCR Mix 12.5μL，正反向特異引物DO-F和DO-R各1.0μL(2.5μmol·L^-1)，DNA模板溶液10.5μL。

(3)用于擴(kuò)增ITS2序列的引物為：

正向DO-F：5’-GGCGTCAAGCATTTTATCTCTCC-3’；

反向DO-R：5’-AATCCTCGTAAGTTTCTTTTCCTCC-3’。

按以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，40個(gè)循環(huán)；72℃10min。

本發(fā)明提供的利用rDNA ITS2序列鑒別鐵皮石斛干藥材，是應(yīng)用MEGA6.0軟件，基于K2P模型構(gòu)建待測(cè)樣品的NJ樹(shù)，通過(guò)NJ樹(shù)可以直觀鑒別出鐵皮石斛。

本發(fā)明提供了鐵皮石斛干藥材DNA快速提取技術(shù)，改良了PCR擴(kuò)增體系，針對(duì)鐵皮石斛干藥材設(shè)計(jì)了ITS2序列PCR擴(kuò)增引物，建立了PCR反應(yīng)條件，為鐵皮石斛干藥材的鑒別提供了分子鑒定依據(jù)，可從多種藥材中快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出鐵皮石斛。

本發(fā)明適用于鐵皮石斛基原植物、市售藥材、種子種苗等方面的鑒定，可有效解決鐵皮石斛的鑒定、育種，以及種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用等問(wèn)題，適用性廣，操作簡(jiǎn)單，易于掌握，準(zhǔn)確性高。

附圖說(shuō)明

圖1所示為鐵皮楓斗特異引物DO-F/DO-R與通用引物ITS2F/3R擴(kuò)增對(duì)比電泳圖。

其中M為分子量標(biāo)準(zhǔn)(條帶由上到下依次誒：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1-5為通用引物ITS2F/3R擴(kuò)增結(jié)果；6-10為引物DO-F/R擴(kuò)增結(jié)果；11為陽(yáng)性對(duì)照(鐵皮石斛葉片樣品提取DNA進(jìn)行擴(kuò)增)，12為陰性對(duì)照。

圖2為基于ITS2序列構(gòu)建鐵皮楓斗與其混偽品的NJ樹(shù)。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1鐵皮石斛藥材的鑒定

1.實(shí)驗(yàn)材料

本案例共收集石斛屬40種173份樣品，混偽品密花石豆蘭和流蘇金石斛3份樣品。其中鐵皮楓斗基原植物樣品14份，藥材樣品65份，具體信息見(jiàn)表1。

表1鐵皮楓斗及其混偽品樣品信息表

2.實(shí)驗(yàn)儀器

臺(tái)式高速離心機(jī)、PTC-100基因擴(kuò)增儀、電泳儀、紫外凝膠成像分析系統(tǒng)、MM400球磨儀(德國(guó)Retsch)。

3.DNA提取

取鐵皮楓斗干燥藥材20-30mg，切碎后使用MM400球磨儀粉碎，加入核分離液500-1000μL，充分混勻，7000r/min離心5min，棄上清，加入核分離液500-1000μL，重復(fù)此步驟3-5遍至上清不粘稠。其余步驟參照植物基因組DNA提取試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作方法進(jìn)行。核分離液的配比為：Tris-HCl(pH8.0)終濃度100mmol·L^-1，EDTA(pH8.0)終濃度20mmol·L^-1，NaCl終濃度0.7mol·L^-1，2％PVP-40(W/V)，以上各物質(zhì)配成溶液后滅菌，使用之前加入β-巰基乙醇0.4％(V/V)。

4.PCR擴(kuò)增

正向引物DO-F：5’-GGCGTCAAGCATTTTATCTCTCC-3’；反向引物DO-R：5’-AATCCTCGTAAGTTTCTTTTCCTCC-3’，由生工生物工程公司有限公司(北京)合成。引物用無(wú)菌去離子溶解并稀釋至2.5μmol·L^-1。

25μL反應(yīng)PCR擴(kuò)增體系：2×Taq PCR Mix 12.5μL，特異引物DO-F和DO-R各1.0μL(2.5μmol·L^-1)，DNA模板溶液10.5μL。

PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，40個(gè)循環(huán)；72℃10min。

5.DNA測(cè)序

PCR產(chǎn)物直接送美吉公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序引物同PCR擴(kuò)增引物(DO-F和DO-R)。

6.序列拼接

本實(shí)施例采用軟件CodonCode Aligner 5.1(CodonCode Co.，USA)進(jìn)行序列拼接及校對(duì)。首先，利用該軟件去除序列兩端的引物區(qū)，然后進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量評(píng)估及預(yù)處理，即去除測(cè)序結(jié)果兩端的低質(zhì)量部分，并對(duì)剩余部分進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。具體步驟是：以20bp的窗口分別從序列5’端和3’端進(jìn)行滑動(dòng)，如果窗口內(nèi)有多于2個(gè)堿基的Q值小于20，則刪除一個(gè)堿基，窗口繼續(xù)滑動(dòng)，如果窗口內(nèi)堿基Q值小于20的數(shù)目小于或等于2個(gè)，窗口停止滑動(dòng)，即去除了低質(zhì)量的區(qū)域。進(jìn)行序列拼接后，獲得鐵皮楓斗rDNA ITS2序列。

7.序列比對(duì)

用MEGA6.0軟件，基于K2P模型對(duì)獲得的鐵皮楓斗及其同屬物種的ITS2序列構(gòu)建NJ樹(shù)，用于鑒定鐵皮石斛藥材。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例2鐵皮石斛基原植物的鑒定

基本同實(shí)施例1，所不同的是以鐵皮石斛基原植物為樣品，按上述方法提取DNA，擴(kuò)增ITS2序列，結(jié)果也能成功獲得目標(biāo)序列，完成鑒定。

實(shí)施例3鐵皮石斛種子種苗的鑒定

基本同實(shí)施例1，所不同的是鐵皮石斛種子和種苗為樣品，按上述方法提取DNA，擴(kuò)增ITS2序列，結(jié)果也能成功獲得目標(biāo)序列，完成鑒定。