本發(fā)明涉及一種新的小鼠骨髓細(xì)胞系、構(gòu)建方法及其應(yīng)用，屬于生物學(xué)中細(xì)胞系構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

小鼠骨髓細(xì)胞包括造血干細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等，其中造血干細(xì)胞具有高度的分裂能力，能生成各種血細(xì)胞和原始細(xì)胞，而骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是存于骨髓中一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞群，在一定條件下能夠體外或體內(nèi)分化成為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞和神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞。小鼠骨髓細(xì)胞系的建立為體外成血管模型的構(gòu)建提供了保障。

血管生成即新生血管從潛在血管生長點長出，包括在許多生理和病理過程，目前抗血管生成藥物已成為抗腫瘤治療的新手段，體外血管生成模型作為一種研究工具，在探討血管形成機制、發(fā)現(xiàn)血管活性分子等方面將發(fā)揮十分積極的作用，還可以被用作藥物篩選的工具。

盡管骨髓細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，但其很難實現(xiàn)體外連續(xù)傳代和大量擴增，這就限制了對其進行體外誘導(dǎo)分化，雖然目前已有一些關(guān)于小鼠骨髓細(xì)胞系建立方面的研究，但構(gòu)建的細(xì)胞系性狀不穩(wěn)定，不能穩(wěn)定多次傳代，遺傳特性也不明確。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是一種性狀穩(wěn)定且可多次穩(wěn)定傳代的小鼠骨髓細(xì)胞系MBMCL2、構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案之一：

小鼠骨髓細(xì)胞系MBMCL2，保藏編號為CCTCC NO ：C201621，保藏日期為2016年1月25日，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏中心地址為湖北省武漢市武漢大學(xué)。

本發(fā)明的小鼠骨髓細(xì)胞系MBMCL2及其子代細(xì)胞具有以下特性：（1）99%細(xì)胞表達骨髓干細(xì)胞標(biāo)志物CD90，約96.7%的細(xì)胞表達CD29，96.5%的細(xì)胞表達CD34，約92.7%的細(xì)胞表達CD31；（2）具有體外誘導(dǎo)成骨分化和成血管能力。

本發(fā)明的技術(shù)方案之二：小鼠骨髓細(xì)胞系MBMCL2的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

（1）按常規(guī)方法配制Gibco L-DMEM培養(yǎng)基：

（2）原代培養(yǎng)的建立：取健康8周齡昆明小鼠1只無痛致死，無菌取出左右兩側(cè)大腿骨，去除周圍肌肉組織后放入35mm塑料培養(yǎng)皿中，切除兩側(cè)骨的端部，用吸有L-DMEM培養(yǎng)液的注射器沖壓出骨髓于5毫升無菌試劑瓶中，用帶有7號針頭的注射器將細(xì)胞打散后制成細(xì)胞懸液，取細(xì)胞懸液置于步驟（1）制得的培養(yǎng)基中，加20%的Gibco胎牛血清，用25毫升的Corning培養(yǎng)瓶37℃條件下在含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)小鼠骨髓細(xì)胞，60小時后將懸浮細(xì)胞移至新的25毫升培養(yǎng)瓶，36小時后移除新瓶中的懸浮細(xì)胞，換上含5% 胎牛血清的EGM-2培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；

（3）傳代培養(yǎng)：將細(xì)胞融合率達80%的25-48小時貼壁的原代細(xì)胞用0.25%的胰酶37℃消化約2-2.5分鐘，然后加含5%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基，吹打收集細(xì)胞，再在1000rpm的轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，最后用5% FBS的EGM-2培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1:2比例接種至含5% FBS的EGM-2培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞系形成；

（4）建立成血管模型：將步驟（3）獲得的細(xì)胞接種于60微升matrigel上，培養(yǎng)20-24小時，獲得成血管模型，小鼠骨髓細(xì)胞或其子代細(xì)胞的接種量為1×10⁴-1×10⁵個；

（5）成骨誘導(dǎo)：將步驟（3）獲得的細(xì)胞或其子代細(xì)胞接種于6孔板進行成骨誘導(dǎo)，約10-15天后，出現(xiàn)明顯的陽性結(jié)果，小鼠骨髓細(xì)胞或其子代細(xì)胞的接種量為1×10³-1×10⁴個。

本發(fā)明的技術(shù)方案之三：小鼠骨髓細(xì)胞系MBMCL2在成血管模型的建立和體外成骨分化中的應(yīng)用。

本發(fā)明具有的有益效果如下：

（1）本發(fā)明的小鼠骨髓細(xì)胞系MBMCL2形狀穩(wěn)定，可穩(wěn)定多次傳代，實驗中已穩(wěn)定傳代126代；

（2）本發(fā)明的骨髓細(xì)胞系MBMCL2的成血管和成骨誘導(dǎo)分化能力強，遺傳特性明確，是骨髓干細(xì)胞的基礎(chǔ)和臨床前期應(yīng)用研究的理想細(xì)胞系；

（3）體外誘導(dǎo)分化和流式檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞具有MSC和EPC雙重特性，可用于骨髓干細(xì)胞相關(guān)基因的體外功能研究和敏感性藥物的體外篩。

附圖說明

圖1 顯示了細(xì)胞系MBMCL2 的培養(yǎng)情況：圖A 顯示了細(xì)胞培養(yǎng)至第126 代時的生長形態(tài)(100×)；圖B 為MBMCL2 形成集落后懸浮細(xì)胞再次貼壁的細(xì)胞形態(tài)（如箭頭所示）；圖C 為MBMCL2 原代細(xì)胞形態(tài)。

圖2 顯示了本發(fā)明細(xì)胞系MBMCL2 的體外成血管性。

圖3顯示了本發(fā)明細(xì)胞系MBMCL2的誘導(dǎo)成骨陽性結(jié)果：圖A為陰性對照組，圖B為MBMCL2-120^th誘導(dǎo)成骨結(jié)果。

圖4顯示了流式細(xì)胞術(shù)檢測MBMCL2細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物的表達結(jié)果：為流式分析MBMCL2 細(xì)胞CD34、CD31、CD29、CD90 的分子表達結(jié)果。

圖5 顯示了細(xì)胞系MBMCL2 的細(xì)胞染色體形態(tài)。

圖6顯示了細(xì)胞系MBMCL2-35^th的生長曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步描述。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而非限制本發(fā)明的范圍。

實施例一

（一）小鼠骨髓細(xì)胞系MBMCL2的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

（1）按常規(guī)方法配制Gibco L-DMEM培養(yǎng)基；

（2）原代培養(yǎng)的建立：取健康8周齡左右昆明小鼠1只，無痛致死，無菌取出左右兩側(cè)股骨，去除周圍肌肉組織后放入35mm塑料培養(yǎng)皿中，切除兩側(cè)骨的端部，用吸有L-DMEM培養(yǎng)液的注射器沖壓出骨髓于5毫升無菌試劑瓶中，用帶有7號針頭的注射器將細(xì)胞打散后制成細(xì)胞懸液，取細(xì)胞懸液置于步驟（1）制得的細(xì)胞培養(yǎng)基中，加20%的Gibco胎牛血清，用25毫升的Corning培養(yǎng)瓶37℃條件下在含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)小鼠骨髓細(xì)胞，60小時后將懸浮細(xì)胞移至新的25毫升培養(yǎng)瓶，36小時后移除新瓶中的懸浮細(xì)胞，換上含5% FBS的EGM-2培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；

（3）傳代培養(yǎng)：將細(xì)胞融合率達80%的25-48小時貼壁的原代細(xì)胞用0.25%的胰酶37℃消化約2分鐘，加含5%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基吹打收集細(xì)胞，1000rpm離心5分鐘，5% FBS的EGM-2培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1:2比例（指的是1瓶細(xì)胞傳代成2瓶）接種至含5% FBS的EGM-2培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞系形成；

（4）建立成血管模型：將步驟（3）獲得的細(xì)胞接種于60微升matrigel上，培養(yǎng)20-24小時，獲得成血管模型，小鼠骨髓細(xì)胞或其子代細(xì)胞的接種量為1×10⁴-1×10⁵個；

（5）成骨誘導(dǎo)：將步驟（3）獲得的小鼠骨髓細(xì)胞或其子代細(xì)胞接種于6孔板進行成骨誘導(dǎo)，約10-15天后，出現(xiàn)明顯的陽性結(jié)果，小鼠骨髓細(xì)胞或其子代細(xì)胞的接種量為1×10³-1×10⁴個；

（6）核型分析：在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加秋水仙素，秋水仙素的終濃度為0.04μg/ml，獲得大量MBMCL2細(xì)胞中期分裂相，使用0.075M KCl低滲液低張?zhí)幚砑?xì)胞，冰醋酸及甲醇固定后，用Giemsa 染色，油鏡下觀察分散的染色體結(jié)果，表明MBMCL2 細(xì)胞系的多數(shù)細(xì)胞為異倍體細(xì)胞。

（二）小鼠骨髓細(xì)胞系MBMCL2的鑒定與應(yīng)用：

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，對取上百只昆明小鼠的骨髓干細(xì)胞，進行原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)，最后得到本發(fā)明的小鼠骨髓干細(xì)胞系MBMCL2。該細(xì)胞系細(xì)胞大多呈短梭形，體外增殖能力強（如圖6所示），生長穩(wěn)定，大多數(shù)細(xì)胞的染色體異倍化，已穩(wěn)定傳代126代，體外誘導(dǎo)分化結(jié)果顯示該細(xì)胞系的細(xì)胞可以成功進行成骨分化和成血管分化；流式檢測結(jié)果顯示，該細(xì)胞系的細(xì)胞約99.9%為CD90陽性細(xì)胞，約96.7%的細(xì)胞表達CD29，約96.5%的細(xì)胞表達CD34和約92.7%的細(xì)胞表達CD31，表明該細(xì)胞系具有MSC和EPC雙重特性。因而在成血管模型的建立和體外成骨分化中有著很好的應(yīng)用。