本發(fā)明屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種化合物及其作為低遷移率核酸染料的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

瓊脂糖（核酸）凝膠電泳普遍應(yīng)用用分子生物學(xué)，為基因重組、分子雜交以及DNA序列研究等提供了強(qiáng)大有力的手段。近十年來熒光染料作為核酸探針得到了廣泛的應(yīng)用。這些熒光核酸染料不僅可以應(yīng)用在電泳核酸凝膠染色，也可以用來定量檢測(cè)實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（即qPCR）的DNA。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上來說，這些核酸熒光染料主要可以分為吖啶、菲啶、菁類、熒光素和羅丹明類等。EB（Ethidium bromide，溴化乙錠）是一種高度靈敏的核酸熒光染料，用于觀察瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中的DNA。在瓊脂糖（核酸）凝膠電泳過程中，最常用的核酸染色劑是溴化乙錠（EB），染色效果好，操作方便，但是穩(wěn)定性差，具有非常大的毒性（致癌性），EB是強(qiáng)誘變劑,具有高致癌性?；贓B的分子結(jié)構(gòu)，在充分利用了EB分子的熒光基團(tuán)（即菲啶鎓）基礎(chǔ)上，對(duì)于EB進(jìn)行了結(jié)構(gòu)上的改變，但是保留甚至達(dá)到了比EB更好的核酸染色效果。同EB相比，這些新型核酸染料還具備毒性較低的優(yōu)勢(shì)。核酸染色劑又被稱之為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的“食用鹽”。作為能夠取代EB的核酸染料，主要有兩款產(chǎn)品，分別為美國(guó)拜奧蒂烏母股份有限公司（Biotium. Inc.）用一個(gè)小分子把兩個(gè)EB發(fā)光基團(tuán)（phenyl-phenanthridine）連接而成所制備的化合物以及美國(guó)Molecular Probes,Inc.所生產(chǎn)的SYBR Green 系列染料。SYBR 系列染料有靈敏度不夠強(qiáng)且具備低毒等缺陷。美國(guó)拜奧蒂烏母股份有限公司的產(chǎn)品無毒且靈敏性高，但是對(duì)DNA的遷移率影響比較大，即不能保證DNA遷移的真實(shí)水平，從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差。這種對(duì)遷移率的影響，相同條帶位移會(huì)出現(xiàn)明顯偏差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是公開一種化合物及其作為低遷移率核酸染料的應(yīng)用；在同等的條件下，與現(xiàn)有技術(shù)，比如美國(guó)拜奧蒂烏母股份有限公司的產(chǎn)品相比，本發(fā)明的化合物作為低遷移率核酸染料不僅保持了無毒靈敏性高的特點(diǎn)，而且對(duì)DNA的遷移率影響很低。

為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種化合物，含有如下化學(xué)結(jié)構(gòu)式：

其中B的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

其中a、b、c、d、e、f獨(dú)立的選自0～12之間的整數(shù)。

本發(fā)明的化合物中，橋含有合適數(shù)量的非氫原子，其中a、b、c、d、e、f獨(dú)立的選自0～12之間的整數(shù)，R為-SO₃H、-SO₃^-或者H。

本發(fā)明的化合物還可以呈化合物鹽的形式，具有如下化學(xué)結(jié)構(gòu)式：

其中R＇為陰離子，一般為氯、溴、碘等負(fù)離子；橋可以為含有酰胺鍵連接或者非酰胺鍵連接，或者含有X，X為O、N、NHCH₃、NCH₃CH₃、S原子的支鏈烷烴。陰離子不會(huì)對(duì)本發(fā)明化合物的性質(zhì)產(chǎn)生影響，尤其不會(huì)影響本發(fā)明化合物作為核酸染料時(shí)，保持了特有的高度靈敏性，而且更加安全無毒的效果。

本發(fā)明的化合物作為核酸染料時(shí)，同現(xiàn)有的產(chǎn)品相比較，不僅保持了特有的高度靈敏性，而且更加安全無毒，尤其解決了原來在做核酸電泳時(shí)的拖尾現(xiàn)象。因此本發(fā)明進(jìn)一步公開了上述化合物作為核酸染料的應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的記載，本發(fā)明公開的化合物與現(xiàn)有產(chǎn)品相比，不僅具有相當(dāng)甚至更高的染料亮度，而且又能獲得更高的染色效果；由電泳圖可知，現(xiàn)有產(chǎn)品電泳后，對(duì)不同上樣量的核酸電泳遷移率存在明顯影響，本發(fā)明的化合物在同樣條件下獲得的凝膠電泳測(cè)試結(jié)果顯示，其作為核酸染料對(duì)核酸遷移率的影響微乎其微，可以保證電泳測(cè)試的準(zhǔn)確性與靈敏度。因此本發(fā)明進(jìn)一步公開了上述化合物在核酸凝膠電泳測(cè)試中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，本發(fā)明公開了一種核酸染料，所述核酸染料包括上述的化合物或其鹽，比如氯化鹽、溴化鹽或者碘化鹽。

本發(fā)明還公開了利用上述核酸染料進(jìn)行核酸凝膠電泳測(cè)試的方法，包括以下步驟，首先配置瓊脂凝膠，然后加入核酸染料，接著進(jìn)行電泳測(cè)試，得到電泳圖。優(yōu)選的，核酸染料的添加量為每50 mL瓊脂凝膠中加入0.01～0.015微摩爾核酸染料；利用本發(fā)明的化合物作為核酸染料，用量較少，但是靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

本發(fā)明公開了一種新型化合物，其分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，制備方法簡(jiǎn)易可控，作為核酸染料應(yīng)用時(shí)，具有高的靈敏度，對(duì)DNA的遷移率幾乎沒有影響，從而能保證DNA遷移的真實(shí)水平，可以體現(xiàn)真實(shí)測(cè)試結(jié)果；用于凝膠測(cè)試時(shí)避免了現(xiàn)有熒光染料在濃度大的水溶液中會(huì)形成二聚體從而導(dǎo)致明顯的熒光猝滅問題，而且本發(fā)明化合物由于攜帶電荷多、分子量大從而不會(huì)透過細(xì)胞膜進(jìn)入人體產(chǎn)生傷害即無毒。因此本發(fā)明的化合物是一種高度靈敏性、安全無毒的核酸染料。

附圖說明

圖1是化合物1的分子量測(cè)試圖；

圖2是化合物8的分子量測(cè)試圖；

圖3是現(xiàn)有產(chǎn)品凝膠電泳測(cè)試圖；

圖4是本發(fā)明化合物凝膠電泳測(cè)試圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一

1000ml三口圓底燒瓶中放入60.0g 3,8-二氨基-6-苯基菲啶，360ml DMF和37.2ml Pyridine，機(jī)械攪拌，冰水浴降溫至0-5℃；逐滴滴加42ml II，滴加過程保溫0-5℃；滴加完畢后繼續(xù)反應(yīng)十小時(shí)直到反應(yīng)完成；抽濾，濾餅加入到約2L純水中，機(jī)械攪拌30min，抽濾；濾餅用2L純水再洗滌一次，抽濾至干；減壓干燥至恒重，得黃色固體48克；稱取6-碘己酸乙酯347g，置2000ml三頸燒瓶中，機(jī)械攪拌下加入39.4g中間體I，油浴加熱至100-110℃，反應(yīng)3天直到反應(yīng)完成；降溫至80℃，加入1500mlEA，回流1h，停止加熱，自然降至室溫；抽濾，濾餅用乙酸乙酯洗滌3次；減壓抽干至恒重，得到產(chǎn)品中間體II 36克；125毫升發(fā)煙硫酸冷卻至零度，12克中間體III 加入冷卻的發(fā)煙硫酸中；上述混合液在攪拌的情況下慢慢升溫至室溫，繼續(xù)攪拌12個(gè)小時(shí)直到反應(yīng)結(jié)束；上述混合液被冷卻至零下20度，然后被傾倒進(jìn)零下10度的碘化鈉溶液（250克碘化鈉溶解在250毫升水中）；上述混合液在零度左右攪拌1個(gè)小時(shí)，大量沉淀析出，過濾上述混合液，沉淀固體被干燥至恒重，得到4.6克；稱取12.5g I 中間體IV，置200ml三頸燒瓶中，加入DMF65ml，機(jī)械攪拌，降溫至0-10℃；滴加12 ml二異丙基乙胺，保溫0-10℃；分批加入TSTU，直至原料完全反應(yīng)；根據(jù)TSTU用量，計(jì)算2,2'-氧代雙(乙胺)二鹽酸鹽的用量，先加入計(jì)算量的70%-80%，每次加2,2'-氧代雙(乙胺)二鹽酸鹽之前，加入10ml左右二異丙基乙胺, 直至反應(yīng)完全；常溫下，減壓抽干DMF和過量的二異丙基乙胺；完全抽干后，加入1000ml乙腈，攪拌析晶過夜；抽濾，濾餅加入1000ml乙腈，攪拌過夜，再洗滌一次；抽濾，濾餅減壓干燥至恒重，得到8.3g紅黑色固體。

實(shí)施例二

在裝有回流冷凝管的100 mL三口燒瓶中，加入40 mL 氯苯，將SM（10克）加入其中，同時(shí)攪拌。加入硫酸二甲酯（4 mL），三者混合，升溫到回流狀態(tài)，TLC跟蹤，展開劑：甲醇（5%）乙酸乙酯（95%）并加少量乙酸，到反應(yīng)結(jié)束（大約2-3小時(shí)）。加入10 mL乙醇繼續(xù)回流15 min，停止加熱并冷卻至室溫，直接過濾除去溶劑，濾餅用乙醚洗滌2-3次，固體進(jìn)行真空干燥即得產(chǎn)品中間體I (8 g)。

在裝有機(jī)械攪拌和回流冷凝器的250 mL三口燒瓶中加入中間體I (7 g)、100 mL乙腈、20 mL水，逐步加熱至回流狀態(tài)，隨后還原鐵粉 (15 g)和三氯化鐵 (200 mg)加入到反應(yīng)體系中，繼續(xù)回流反應(yīng)2個(gè)小時(shí)。在砂芯漏斗中放入濾紙和硅藻土，熱過濾除去鐵粉和鐵鹽，所得濾液冷卻至室溫，固體析出。 固體用過濾的方法得到，進(jìn)行真空干燥即為產(chǎn)品中間體II (5 g)。

在裝有機(jī)械攪拌和回流冷凝管的1 L三口燒瓶中，加入6-碘己酸乙酯 (30 g)，然后將中間體II(4.67 g)加入其中，同時(shí)攪拌。逐步升溫至110 ℃反應(yīng)，TLC跟蹤，展開劑：氯仿：甲醇：乙酸乙酯：乙酸 = 15:2:2:1，到反應(yīng)結(jié)束（大約需要3-4天）。降溫至80℃，加入150 mL乙酸乙酯回流反應(yīng)1小時(shí)。冷卻至室溫，攪拌過夜。直接進(jìn)行過濾除去乙酸乙酯及6-碘己酸乙酯，濾餅用乙酸乙酯洗滌2-3次，所得固體真空干燥即是產(chǎn)品中間體III (4.2 g)。

在帶有回流冷凝管和機(jī)械攪拌的100 mL三口燒瓶中，加入24 mL 48%的溴化氫水溶液，緩慢將原料中間體III (2.4 g)加入到燒瓶中。加入后，室溫?cái)嚢枰恍r(shí)。加熱到110^oC，直到TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束（大約反應(yīng)需要3-4小時(shí)）。展開劑：10%水90%乙腈。反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)物降至室溫，放4℃冰箱過夜。有固體析出，過濾除去溴化氫水溶液, 濾餅用少量冰水洗滌。固體進(jìn)行凍干即得產(chǎn)品中間體IV (1.3 g)。

25 mL單口瓶中加入中間體IV (430 mg)、DMF (15 mL)、Et₃N (1 mL)，放入冰水浴中攪拌30 分鐘。然后加入TSTU (330 mg)，繼續(xù)攪拌反應(yīng)。直到TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束（大約反應(yīng)需要0.5-1小時(shí)），展開劑：甲醇：二氯甲烷=2:8。反應(yīng)結(jié)束，加入乙二胺 (30 μL)、三乙胺 (1 mL)，逐步回到室溫反應(yīng)。TLC檢測(cè)，展開劑：水:乙腈=1:9（Al₂O₃板）。反應(yīng)結(jié)束后減壓抽去DMF、Et₃N，剩余物用甲醇溶解，制備過Al₂O₃柱的樣品，淋洗劑：3%-8% H₂O/CH₃CN。收集各管的產(chǎn)物，旋除溶劑，所得固體進(jìn)行真空干燥即得最終產(chǎn)品 (300 mg)。

實(shí)施例三

在裝有回流冷凝管的250 mL 三口燒瓶中加入2-氨基-4,4’-二硝基聯(lián)苯 (17.2 g)和3-氰基苯甲酰氯 (11 g)，隨后加入60 mL氯苯，磁力攪拌并逐漸升溫至回流狀態(tài)，反應(yīng)4個(gè)小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫，直接進(jìn)行過濾除去氯苯，得到的濾餅用乙酸進(jìn)行重結(jié)晶提純，所得固體進(jìn)行真空干燥烘干即是產(chǎn)品中間體I (24.1 g)。

在裝有回流冷凝管的250 mL單口燒瓶中加入中間體I (18 g) 和60 mL硝基苯，磁力攪拌下加入6 mL POCl₃,逐步加熱至200℃反應(yīng)3個(gè)小時(shí)，然后冷卻至室溫，減壓蒸餾除去硝基苯和POCl₃，剩余的固體用乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，得到的固體進(jìn)行真空干燥即為產(chǎn)品中間體II (13.2 g)。

在裝有機(jī)械攪拌和回流冷凝器的500 mL三口燒瓶中加入中間體II (14 g)、200 mL乙腈、40 mL水，逐步加熱至回流狀態(tài)，隨后還原鐵粉 (30 g) 和三氯化鐵 (400 mg) 加入到反應(yīng)體系中，繼續(xù)回流反應(yīng)2個(gè)小時(shí)。在砂芯漏斗中放入濾紙和硅藻土，熱過濾除去鐵粉和鐵鹽，所得濾液冷卻至室溫，固體析出。 固體用過濾的方法得到，進(jìn)行真空干燥即為產(chǎn)品中間體III (8.5 g)。

在裝有機(jī)械攪拌的1 L三口燒瓶中，加入25 mL DMF，將中間體III (6.2 g)加入其中，同時(shí)攪拌，（注意：不能先加入固體再加入DMF，會(huì)出現(xiàn)結(jié)塊無法攪拌）。加入吡啶 (3.67 mL)，三者混合，冰浴降溫到0℃-5℃，開始滴加氯甲酸乙酯 (6.14 mL)，滴加過程中溫度不能超過15℃，TLC跟蹤，展開劑：石油醚:乙酸乙酯=1：1，到反應(yīng)結(jié)束。在室溫下繼續(xù)攪拌30分鐘以利于充分反應(yīng)。得到的粘稠狀固體，直接先進(jìn)行過濾除去吡啶及DMF，過濾得到的溶劑倒入廢液桶或者倒入水中回收產(chǎn)物（注意：回收的產(chǎn)物稍微不純，需分開放置），濾餅倒入水中，洗滌2-3次到無吡啶氣味為止，先放于室溫下干燥1-2星期后放入真空干燥，得到產(chǎn)品中間體IV (8.2 g)。

在裝有回流冷凝管的100 mL三口燒瓶中，加入40 mL 氯苯，將中間體IV (5 g)加入其中，同時(shí)攪拌。加入硫酸二甲酯 (2.1 mL)，三者混合，升溫到回流狀態(tài)，TLC跟蹤，展開劑：甲醇（5%）乙酸乙酯（95%）并加少量乙酸，到反應(yīng)結(jié)束（大約2-3小時(shí)）。加入10 mL乙醇繼續(xù)回流15 min，停止加熱并冷卻至室溫，直接過濾除去溶劑，濾餅用乙醚洗滌2-3次，固體進(jìn)行真空干燥即得產(chǎn)品中間體V (4.3 g)。

在帶有回流冷凝管和機(jī)械攪拌的100 mL三口燒瓶中，加入24 mL 48%的溴化氫水溶液，緩慢將原料中間體V (2.4 g)加入到燒瓶中。加入后，室溫?cái)嚢枰恍r(shí)。加熱到110℃，直到TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束（大約反應(yīng)需要3-4小時(shí)）。展開劑：10%水90%乙腈。反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)物降至室溫，放4℃冰箱過夜。有固體析出，過濾除去溴化氫水溶液, 濾餅用少量冰水洗滌。固體進(jìn)行凍干即得產(chǎn)品中間體VI (1.23 g)。

25 mL單口瓶中加入中間體VI (86 mg)、DMF ( 5 mL)、Et₃N (0.2 mL)，放入冰水浴中攪拌30 分鐘。然后加入TSTU (66 mg) ，繼續(xù)攪拌反應(yīng)。直到TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束（大約反應(yīng)需要0.5-1小時(shí)），展開劑：甲醇：二氯甲烷=2:8。反應(yīng)結(jié)束，加入己二胺 (6 μL)、三乙胺 (0.2 mL)，逐步回到室溫反應(yīng)。TLC檢測(cè)，展開劑：水:乙腈=1:9（Al₂O₃板）。反應(yīng)結(jié)束后減壓抽去DMF、Et₃N，剩余物用甲醇溶解，制備過Al₂O₃柱的樣品，淋洗劑：2%-6% H₂O/CH₃CN。收集各管的產(chǎn)物，旋除溶劑，所得固體進(jìn)行真空干燥即得最終產(chǎn)品 (54 mg)。

更換一些原料依據(jù)上述的制備方法可以制備其他的染料化合物，具體結(jié)構(gòu)式如下：

化合物1：

化合物2：

化合物3：

化合物4：

化合物5：

化合物6：

化合物7：

化合物8：

化合物9：

化合物10：

其中化合物編號(hào)為7和 9兩種化合物是依據(jù)實(shí)施例一中的最后一步中分別用乙二胺和DAPEE（H₂NCH₂CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂CH₂NH₂）作為橋進(jìn)行連接，而化合物8則是起始物3,8-二氨基-6-苯基菲啶直接進(jìn)行磺化后用TDIEEA進(jìn)行連接而成；化合物4、5和6則是依據(jù)實(shí)施例二，最后一步分別用2,2'-氧代雙乙胺二鹽酸鹽 （2,2-oxybis (ethylamine) dihydrochloride）、己二胺和DAPEE作為橋進(jìn)行連接而成；化合物1、2和10則是依據(jù)實(shí)施例三中的最后一步分別用DAPMA、DAPEE與乙二胺作為橋連接而成。

TDIEEA的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

DAPMA的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

附圖1、附圖2分別是化合物1、化合物8的分子量測(cè)試圖，顯示分子量正確，說明本發(fā)明的產(chǎn)物符合理論設(shè)計(jì)?；衔?至化合物10 分子量依次為1051.79、1126387、1022.76、1181.01、1193.06、1297.17、969.14、1072.14、1143.38、966.8。

本發(fā)明的化合物作為核酸染料，同現(xiàn)有的同類產(chǎn)品相比較，不僅保持了其特有的高度靈敏性，更加安全無毒，而且解決了現(xiàn)有技術(shù)在做核酸電泳時(shí)的拖尾現(xiàn)象。

以如下結(jié)構(gòu)式的化合物（化合物1）、美國(guó)Biotium公司的同類產(chǎn)品為例進(jìn)行凝膠電泳成像，見附圖3、附圖4，對(duì)比結(jié)果說明本發(fā)明的產(chǎn)品與現(xiàn)有同類產(chǎn)品相比，不僅具有相當(dāng)?shù)娜玖狭炼龋夷塬@更高的染色效果；由附圖3可知，使用現(xiàn)有產(chǎn)品電泳后，其對(duì)不同上樣量的核酸電泳遷移率存在明顯影響；而從附圖4來看，采用本發(fā)明的產(chǎn)品在同樣條件下獲得的凝膠電泳測(cè)試結(jié)果顯示，其作為染料對(duì)核酸遷移率的影響微乎其微。

具體實(shí)驗(yàn)條件如下：

凝膠濃度，配置1%濃度的瓊脂糖凝膠（如1%，即1 g瓊脂糖加入100 mL 1×TBE）；核酸染料濃度，瓊脂糖溶液加入10000×核酸染料，每50 mL膠中加入5 ul核酸染料（2.6微摩爾每毫升）；

電泳條件：1×TBE的電泳緩沖液中，100 V電壓下電泳60 min；

從左到右上樣順序?yàn)椋篠uper DNA Marker（5 ul，2.5 ul，1.25 ul）、100bp Ladder（5 ul，2.5 ul，1.25 ul）、1kb Ladder （5 ul，2.5 ul，1.25 ul）、DM2000（5 ul，2.5 ul，1.25 ul），所有上樣產(chǎn)品來自康為世紀(jì)；

結(jié)果觀察：通過標(biāo)準(zhǔn)的透視器（302 nm）觀察染色凝膠，400ms曝光下進(jìn)行拍照獲得電泳圖。