相關(guān)申請

本申請要求2014年10月6日提交的美國臨時申請?zhí)?2/060,381的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，其內(nèi)容通過引用以其整體結(jié)合到本文中。

發(fā)明領(lǐng)域

本申請總的來說涉及具有igg4fc結(jié)構(gòu)域的抗ccr4單克隆抗體及其使用方法。

政府權(quán)益

本發(fā)明在國立衛(wèi)生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予的p50ca93683的政府支持下完成。政府在本發(fā)明中享有一定權(quán)利。

通過序列表的引入結(jié)合

名為“dfci-094_001wo_st25.txt”的文本文件的內(nèi)容通過引用以其整體結(jié)合到本文中，該文件于2015年10月5日創(chuàng)建，大小為32千字節(jié)。

發(fā)明背景

皮膚t細(xì)胞淋巴瘤(ctcl)是成人中第二最常見的結(jié)外非霍奇金t細(xì)胞淋巴瘤。最近的who-eortc一致分類(willemzer.等,blood2005,105:3768-3785)表明有13種臨床上和組織學(xué)上不同類型的ctcl；然而，90%的ctcl落入3個類別；霉菌肉芽腫病(mf)、原發(fā)性皮膚間變性大細(xì)胞淋巴瘤(alcl)和塞扎里綜合征(sezarysyndrome)。最常見的ctcl類型，霉菌肉芽腫病的特征在于最常含有顯示表皮親和力或親表皮現(xiàn)象的cd4⁺t細(xì)胞的紅斑和斑塊(willemzer.等,blood2005,105:3768-3785)。分期基于tnm分類；患有1a期疾病的患者具有正常的預(yù)期壽命，而患有1b期或更高期的患者的預(yù)期壽命縮短(kim,y.h.等,archdermatol2003,139:857-866)?；加衖i-iv期疾病的患者有少于5年的中位生存期，其大細(xì)胞轉(zhuǎn)化常常導(dǎo)致惡化加劇(kim,y.h.等,archdermatol2003,139:857-866)。塞扎里綜合征是ctcl的白血病變體，其中克隆cd4⁺t細(xì)胞在血液和淋巴結(jié)以及皮膚內(nèi)蓄積；5年生存期小于25%。原發(fā)性皮膚alcl具有很少的侵略性進程，其5年生存期為95%；然而，具有并存的結(jié)受累的皮膚alcl是更侵略性的(willemzer.等,blood2005,105:3768-3785；kadinme,carpenterc.seminhematol2003,40:244-256)。

在具有未知病因?qū)W的t細(xì)胞庫的整體調(diào)節(jié)異常的ctcl患者中有明顯的免疫功能障礙(yamanakak.等,clincancerres2005,11:5748-5755；yawalkarn.等,blood2003,102:4059-4066)。大多數(shù)患者中的終末事件是細(xì)菌膿毒癥。晚期mf和塞扎里綜合征的現(xiàn)有療法是治標(biāo)的，可持久的長期緩解極少(querfeldc.等,curropinhematol2005,12:273-278)。因此，迫切需要更有效的療法。

現(xiàn)有假設(shè)表明異常t細(xì)胞活性是ctcl的病理生理學(xué)的可能的驅(qū)動力。最重要的是惡性t細(xì)胞可在ctcl中起類似于調(diào)節(jié)t細(xì)胞的作用并因此抑制抗腫瘤活性的觀察。cc趨化因子受體4(ccr4)在存在于ctcl中的惡性皮膚歸巢t細(xì)胞以及在調(diào)節(jié)t細(xì)胞(treg)上以高水平表達。腫瘤細(xì)胞分泌作為ccr4的配體的趨化因子ccl17和ccl22。接著，這些配體的分泌將調(diào)節(jié)t細(xì)胞和惡性t細(xì)胞吸引至腫瘤的部位，這導(dǎo)致癌細(xì)胞環(huán)境中的效應(yīng)t細(xì)胞的抑制。效應(yīng)t細(xì)胞的這種抑制為持續(xù)的癌細(xì)胞生長產(chǎn)生有利的環(huán)境。

之前的研究表明，使用人源化抗ccr4單克隆抗體mab2-3igg1減少調(diào)節(jié)t細(xì)胞朝向ccr4配體的遷移，并最終導(dǎo)致體內(nèi)腫瘤模型中腫瘤大小的縮小。調(diào)節(jié)性和惡性t細(xì)胞朝向腫瘤細(xì)胞的遷移能力以及惡性細(xì)胞的直接細(xì)胞毒性兩者的調(diào)節(jié)在癌癥的進程中起關(guān)鍵作用。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供與人cc趨化因子受體4(ccr4)結(jié)合并具有igg4重鏈恒定區(qū)的分離的人源化單克隆抗體。

本發(fā)明進一步提供含有以下的抗體：具有seqidno:2的vh氨基酸序列和具有seqidno:4的vl氨基酸序列；具有seqidno:16的vh氨基酸序列和具有seqidno:18的vl氨基酸序列；具有seqidno:20的vh氨基酸序列和具有seqidno:22的vl氨基酸序列；具有seqidno:24的vh氨基酸序列和具有seqidno:26的vl氨基酸序列；具有seqidno:28的vh氨基酸序列和具有seqidno:30的vl氨基酸序列或具有seqidno:44的vh氨基酸序列和具有seqidno:46的vl氨基酸序列和具有seqidno:6或seqid:8的重鏈恒定區(qū)。

本發(fā)明的抗體具有約1.5nm^-1或更小的結(jié)合親和力。

本發(fā)明還提供是雙特異性抗體的抗體，其含有本發(fā)明的抗體和識別第二抗原的抗體的重鏈-輕鏈。例如，第二抗原是腫瘤相關(guān)抗原或t細(xì)胞功能調(diào)節(jié)分子。腫瘤相關(guān)抗原是例如ca-ix、erbb2或hvem。t細(xì)胞功能調(diào)節(jié)分子是pd-l1、gitr、il21、il21r、cd160、tim3、lag3或gal9。

另一方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生本發(fā)明抗體的細(xì)胞。

再一方面，抗體與治療劑連接。治療劑是例如毒素、放射性標(biāo)記、sirna、小分子或細(xì)胞因子。細(xì)胞因子是例如il-2或tgf-β。

本發(fā)明進一步提供含有本發(fā)明抗體的融合蛋白。融合蛋白是例如與細(xì)胞因子或生長因子(例如il-2或tgf-β多肽)有效連接的抗ccr4抗體或其功能片段。

本發(fā)明進一步提供通過使t細(xì)胞與含有與細(xì)胞因子有效連接的抗ccr4抗體的融合蛋白接觸來增加t細(xì)胞增殖的方法。

在某些方面，本發(fā)明提供通過給予受試者本發(fā)明的抗體抑制受試者的調(diào)節(jié)t細(xì)胞(treg)遷移的方法。淋巴細(xì)胞、效應(yīng)t細(xì)胞或treg不被耗減。

本發(fā)明還包括通過使抗原與本發(fā)明的抗體接觸提高對抗原的免疫應(yīng)答的方法。再一方面，在暴露于抗原之前或之后給予抗體。給予本發(fā)明的抗體使抗原特異性t細(xì)胞活性提高。另一方面，給予本發(fā)明的抗體使t細(xì)胞增殖增加。例如，t細(xì)胞是效應(yīng)t細(xì)胞。例如，抗原是病毒抗原、細(xì)菌抗原或腫瘤相關(guān)抗原。一方面，病毒抗原是例如hiv。

本發(fā)明還提供逆轉(zhuǎn)效應(yīng)t細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)t細(xì)胞介導(dǎo)的抑制的方法，所述方法包括使t細(xì)胞與本發(fā)明的抗體接觸。

另一方面，本發(fā)明提供通過給予有需要的受試者包括本發(fā)明的抗體的組合物以治療或減輕癌癥的癥狀的方法。癌癥為例如實體癌或血癌。示例性血癌包括但不限于：皮膚t細(xì)胞淋巴瘤(ctcl)、霉菌肉芽腫病(mf)、原發(fā)性皮膚間變性大細(xì)胞淋巴瘤(皮膚alcl)、塞扎里綜合征(sezarysyndrome)或成人t細(xì)胞白血病/淋巴瘤(atll)。示例性實體癌包括但不限于：腎細(xì)胞癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、腦癌、肝癌、胰腺癌、腎癌或胃癌。癌癥是過量表達caix、pd-l1或hvem的實體癌或癌癥。

本公開內(nèi)容的任何方法中的給藥途徑包括但不限于胃腸外(例如靜脈內(nèi))、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、口服(例如口用)、經(jīng)皮(即局部)、跨黏膜和直腸給藥。

本公開內(nèi)容的任何方法中的受試者是例如哺乳動物。哺乳動物是例如人。

除非另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然類似或等同于本文描述的方法與材料可用于實施本發(fā)明，但以下描述了合適的方法與材料。本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考資料均通過引用以其整體明確予以結(jié)合。如有抵觸，則應(yīng)以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。另外，本文所述材料、方法和實例只是說明性的，無意是限制性的。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢從隨附發(fā)明詳述和權(quán)利要求來看將是顯而易見的并由其所包括。

附圖簡述

圖1.mab2-3介導(dǎo)treg遷移的抑制。(a)顯示了卵巢癌細(xì)胞系的ccl22表達。將癌細(xì)胞用或不用布雷菲德菌素-a處理。在4小時處理后，收獲細(xì)胞，用抗ccr4抗體染色，然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析。(b)由表達ccl22的卵巢癌細(xì)胞上清液誘導(dǎo)的cd4+cd25+t細(xì)胞的體外趨化性被mab2-3抑制，但不被對照抗體抑制。(c)人淋巴細(xì)胞受100nmccl22的化學(xué)吸引被mab2-3以劑量依賴性方式抑制。結(jié)果表示為均值±sd和斯氏t檢驗。這些數(shù)據(jù)表明卵巢癌細(xì)胞系igrov-1和ovcar-5能夠ccl22分泌，并可顯著促進treg上ccl22化學(xué)吸引的增加。另外，mab2-3igg1和igg4兩者還能夠抑制treg上的ccl22化學(xué)吸引。

圖2.由分泌ccl22的igrov-1異種移植物引起的人淋巴細(xì)胞的體內(nèi)化學(xué)吸引被mab2-3抑制。(a)給荷有卵巢腫瘤細(xì)胞的小鼠注射螢光素化cd4+cd25+cd127dim/-treg細(xì)胞，并用3mg/kgmab2-3igg1或igg4或等量的pbs治療。螢光素化cd4+cd25+cd127dim/-t細(xì)胞注射后18小時卵巢癌異種移植物小鼠模型的體內(nèi)生物發(fā)光圖像(成像)。(b)腫瘤區(qū)域的生物發(fā)光強度通過ivis成像系統(tǒng)和軟件測量。(c)收獲腫瘤，用膠原酶處理，用抗cd4和抗cd25抗體染色，然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析。顯示了cd4+cd25+treg的百分比。統(tǒng)計值以斯氏t檢驗計算。*和**分別表示p值<0.5和0.01。

圖3.體內(nèi)人pbmc分布的驗證。(a)和(b)中的facs圖和圖表表示在體內(nèi)用抗ccr4抗體治療后cd4+t細(xì)胞群的測量。首先，小鼠通過尾靜脈接受1x10⁷個人pbmc，然后給小鼠靜脈內(nèi)注射3mg/kg抗體。在體內(nèi)24小時循環(huán)期后，收集小鼠血液，人pbmc用pacificblue綴合的抗cd3、brilliantviolet綴合的抗cd4、apc綴合的抗cd25、pe-cy7綴合的抗cd127、pe-cy5綴合的抗cd45ra和percp-cy5綴合的抗ccr7抗體染色，進行選通以區(qū)分treg、tcm、tem、teff和tnaive。顯示了來自3個獨立實驗平均值的cd3+cd4+t細(xì)胞中(c)cd25+cd127-treg，(d)cd45ra+ccr7-teff，(e)cd45ra+ccr7+tnaive，(f)cd45ra-ccr7-tem和(g)cd45ra-ccr7+tcm群的百分比。*，p值<0.05。(h)在抗體治療后體內(nèi)t細(xì)胞群的定量測定。*，p值<0.05。在這個實驗中，mab2-3igg1介導(dǎo)treg耗減，并減少幼稚t細(xì)胞群。相比之下，mab2-3的igg4形式對t細(xì)胞失去耗減活性，并保持體內(nèi)正常的t細(xì)胞亞群。

圖4.igrov-1卵巢癌細(xì)胞的腫瘤致敏t細(xì)胞的產(chǎn)生和證實。(a)單核細(xì)胞來源的樹突細(xì)胞(dc)的證實。(b)使人腫瘤致敏t細(xì)胞與腫瘤脈沖的dc或未脈沖的dc一起孵育。在48小時孵育后，收獲上清液，并通過msd測量ifn-γ。(c)使人腫瘤致敏t細(xì)胞與igrov-1或treg一起孵育。收獲上清液，通過msd測量ifn-γ，(d)通過elisa測量ldh以檢測細(xì)胞死亡百分比。結(jié)果表示為均值±s.d.和斯氏t檢驗。

圖5.荷有igrov-1致敏t細(xì)胞的igrov-1異種移植物小鼠中mab2-3的免疫調(diào)節(jié)療法。(a)用5x10⁶個igrov-1腫瘤細(xì)胞給小鼠接種。當(dāng)腫瘤達到50mm³的大小時，通過尾靜脈注射1x10⁷個igrov-1致敏t細(xì)胞、1x10⁶個treg和1mg/kg抗體。每周兩次對小鼠進行治療。腫瘤大小通過測徑器計算，并測量為長x(寬)2x0.52。灰色*，p<0.05，與mab2-3igg1相比；黑色*和**，p<0.05和p<0.01，與mab2-3igg4相比。(b)收獲腫瘤，稱重。比例尺，1cm。(c)在整個實驗中監(jiān)測小鼠體重。(d)在抗體治療后，通過流式細(xì)胞術(shù)測量人t細(xì)胞中的t細(xì)胞亞群。在荷有腫瘤致敏t細(xì)胞的這些nsg小鼠中顯示了在用mab2-3igg1或igg4治療后殺滅活性提高。這些結(jié)果顯示treg耗減和由mab2-3引起的treg募集的抑制兩者對腫瘤治療是有益的。

圖6.被人源化抗ccr4抗體抑制的信號傳導(dǎo)。(a)將人pbmc在對照抗體、mab2-3igg1或mab2-3igg4存在和不存在時與或不與treg一起孵育。通過[3h]胸苷摻入檢測pbmc增殖(cpm)。(b)cd4+t細(xì)胞自人pbmc中分離，并在對照抗體、mab2-3igg1或mab2-3igg4存在和不存在時與treg一起孵育。定量測定老化相關(guān)β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)陽性細(xì)胞。(c)用抗p-erk1/2、erk1/2、p-p38和p38抗體進行的蛋白質(zhì)印跡法和蛋白質(zhì)印跡分析；測定了p-erk1/2和p-p38表達與對照igg處理的cd4+t細(xì)胞相比的倍數(shù)。(d)在用對照igg、mab2-3igg1或mab2-3igg4處理后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測cd4+t細(xì)胞上cd27和cd28的表達。所有值為均值±s.d.。這些數(shù)據(jù)表明，通過降低sa-β-gal和p-p38的表達并恢復(fù)cd27和cd28的表達，mab2-3抑制treg活性的其它功能，這提供共刺激信號并且是淋巴細(xì)胞活化所必需的。

發(fā)明詳述

趨化因子是主要因其在白細(xì)胞活化和趨化性中的作用而著名的分泌蛋白質(zhì)的家族。它們與靶細(xì)胞上的趨化因子受體的特異性相互作用引發(fā)導(dǎo)致炎性介質(zhì)釋放、細(xì)胞形狀改變和細(xì)胞遷移的信號傳導(dǎo)級聯(lián)。cc趨化因子受體4(ccr4)是cc趨化因子ccl17和ccl22的關(guān)聯(lián)受體（cognatereceptor），并在功能上不同的t細(xì)胞亞型上表達，所述t細(xì)胞亞型包括t輔助2型細(xì)胞(th2)和大多數(shù)的調(diào)節(jié)t細(xì)胞(treg)(iellem等，2001；和imai等，1999)。越來越多的證據(jù)表明ccl17/22分泌促進由例如結(jié)腸直腸、卵巢、霍奇金淋巴瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤等惡性實體引起的腫瘤浸潤性treg的數(shù)目增加(curiel等，2004；wagsater等，2008；niens等，2008；jacobs等，2010；hiraoka等，2006)。腫瘤中treg水平的提高阻礙有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答(wood等，2003和levings等，2001)，并且常常與臨床結(jié)果差和腫瘤進展有關(guān)(hiraoka等，2006和woo等，2001)。因此，成功癌癥療法的一個主要障礙可能由treg遷移進入腫瘤及其在腫瘤微環(huán)境中抗腫瘤免疫應(yīng)答的抑制引起(zou等，2006和yu等，2005)。近年來，在消除treg抑制功能并因此提高抗腫瘤免疫的努力中，在臨床前和臨床研究中評價了作為針對treg的免疫治療劑的單克隆抗體(mab)(mahnke等，2007；roncarolo等，2007)。然而，用mab免疫療法對全身treg耗減的產(chǎn)生與自身免疫有極大的預(yù)期相關(guān)性(sakaguchi等，2008和kohm等，2006)。避免treg誘導(dǎo)的癌癥免疫逃避的一個備選策略是研發(fā)直接阻礙腫瘤組織中的treg吸引和蓄積的腫瘤相關(guān)treg靶向療法。

mab在癌癥免疫療法中的一個潛力在于其阻斷或調(diào)節(jié)因腫瘤所致免疫逃避的免疫軸的能力。趨化因子受體ccr4在大部分foxp3⁺treg(被視為抗腫瘤免疫最有效的抑制劑和成功免疫療法的最大障礙的免疫細(xì)胞)上高表達(baatar等，2007)。此外，在患有不同癌癥類型的患者中檢出ccr4的腫瘤相關(guān)趨化因子(mizukami等，2008；gobert等，2009和faget等，2011)。因此，本文所述人抗ccr4mab免疫療法的靶向方法在提高癌癥免疫治療功效同時降低其副作用中提供重大優(yōu)勢。

本發(fā)明提供針對趨化因子(c-c基序)受體4(ccr4)有特異性的人源化igg4單克隆抗體。抗ccr4抗體的最初人源化描述于wo2009/086514，其內(nèi)容通過引用以其整體結(jié)合到本文中。人源化抗ccr抗體的優(yōu)化變體ab2-3igg1的說明描述于wo2013/166500，其內(nèi)容通過引用以其整體結(jié)合。通過使識別ccr4的n端和胞外結(jié)構(gòu)域的小鼠抗ccr4單克隆抗體mab1567人源化產(chǎn)生抗體。與抗體對針對純的蛋白質(zhì)容易獲得的抗原的親和力成熟不同，抗ccr4抗體的親和力成熟由于蛋白質(zhì)的7跨膜結(jié)構(gòu)所致特別富有挑戰(zhàn)性。ccr4的這種復(fù)雜結(jié)構(gòu)使得篩選和選擇親和力成熟的抗體不太有效且不太可預(yù)測。

本文描述了針對ccr的人源化igg4同種型單克隆抗體，下文稱為ccr4-igg4。與ccr4-3igg1相比，ccr4igg4具有不同的fc結(jié)構(gòu)域氨基酸序列。ccr4-3igg4抗體具有至少等于最初描述的ccr4-igg1的親和力或是其1倍、1.5倍、2倍的親和力。

本發(fā)明的ccr4-igg4抗體還有效地抑制cd4⁺cd25^高treg的趨化性。本發(fā)明的ccr4-igg4抗體還通過抑制來自腫瘤組織的treg募集，介導(dǎo)腫瘤致敏t細(xì)胞的活化。重要的是，ccr4-igg4抗體是非免疫耗減的。

因此，ccr4-igg4抗體可用于治療表達ccr4的腫瘤，例如皮膚t細(xì)胞淋巴瘤。此外，親和力優(yōu)化抗ccr4抗體還可通過提高抗腫瘤免疫應(yīng)答，通過抑制treg運輸，而用于治療其它腫瘤。

皮膚t細(xì)胞淋巴瘤(ctcl)是通過克隆來源的皮膚歸巢t細(xì)胞引起的一類異源的淋巴增殖性病癥。ctcl細(xì)胞一律表達ccr4。具體地說，ccr4是mf、皮膚alcl和大致50%的結(jié)節(jié)alcl中惡性t細(xì)胞的重要特征。與cla不同，它確實在塞扎里綜合征中和mf的大細(xì)胞轉(zhuǎn)化期間表達，并且還由可累及皮膚的其它t淋巴樣細(xì)胞惡性腫瘤(例如成人t細(xì)胞白血病/淋巴瘤(atll))表達。ccr4的表達限于非惡性細(xì)胞中并且不存在于嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞或b細(xì)胞中。重要的是，ccr4不存在于幼稚t細(xì)胞中，并存在于少于所有記憶t細(xì)胞的一半中。ctcl細(xì)胞上ccr4確實表達及其在其它免疫細(xì)胞上的有限表達，使得ccr4的靶向療法成為針對這些惡性腫瘤的有吸引力的目標(biāo)。

雖然在對ccr4有相對選擇性的小分子抑制劑的鑒定中取得一些進展，但針對ccr4的特異性單克隆抗體由于其微妙的結(jié)合特異性是針對ctcl的免疫療法的有吸引力的靶標(biāo)。另外，通過fc與fcγ受體結(jié)合介導(dǎo)的體內(nèi)效應(yīng)子功能可用來殺滅腫瘤細(xì)胞。不知道最佳體內(nèi)免疫耗減活性所需要的mab的精確性質(zhì)，但可選擇抗體以作為受體激動劑或拮抗劑起作用，和/或促進或抑制受體二聚化和/或內(nèi)化。還鑒定了抗體介導(dǎo)的腫瘤清除的不同免疫機制。例如，天然殺傷細(xì)胞被mab介導(dǎo)募集至腫瘤可通過這些免疫效應(yīng)細(xì)胞上受體的fc-γ活化(一種稱為依賴抗體的細(xì)胞毒性(adcc)的過程)發(fā)生。其它免疫機制包括依賴補體的細(xì)胞毒性(cdc)和依賴抗體的細(xì)胞吞噬作用(adcp)。與固有mab活性有關(guān)的其它機制包括：阻斷配體結(jié)合或異源二聚化、抑制akt的下游信號傳導(dǎo)和加快受體內(nèi)化。后一機制特別有效，因為配體誘導(dǎo)的胞吞和活性受體酪氨酸激酶(rtk)的降解被視為構(gòu)成促生長信號減弱基礎(chǔ)的主要生理過程。

受趨化因子及其受體嚴(yán)格調(diào)節(jié)的白細(xì)胞運輸具有腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移的許多特征。雖然因腫瘤細(xì)胞所致趨化因子受體ccr4的表達與皮膚受累有關(guān)，但ccr4還在正常和腫瘤免疫兩者中具有重要作用。在患有htlv-1相關(guān)成人t細(xì)胞白血病/淋巴瘤(atll)的一組ctcl患者中，腫瘤細(xì)胞本身起調(diào)節(jié)t(treg)細(xì)胞的作用，其有助于在面臨宿主抗腫瘤免疫應(yīng)答時的腫瘤存活。在其它的癌癥類型中，由腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生的趨化因子tarc/ccl17和mdc/ccl22(ccr4的特異性配體)，將ccr4⁺treg細(xì)胞吸引至腫瘤，在其中它們創(chuàng)造腫瘤逃避宿主免疫應(yīng)答的有利環(huán)境。因此，治療性抗ccr4mab是許多不同癌癥的理想的治療形式，不僅僅直接殺滅ccr4⁺腫瘤細(xì)胞，而且還克服ccr4treg細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的宿主免疫應(yīng)答的抑制作用。

一方面，本發(fā)明提供特異性結(jié)合調(diào)節(jié)t細(xì)胞募集而不誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞耗減的ccr4蛋白的高親和力人源化單克隆抗體。這種抗體與ccr4受體的結(jié)合中斷ccr4的配體或激動劑結(jié)合。競爭與ccr4結(jié)合并且在本發(fā)明的抗體存在下被阻斷的示例性配體或激動劑包括但不限于ccl17、ccl22和vmip-iii。通過各種機制，抗體可降低表達ccr4的細(xì)胞(例如皮膚t細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞(ctcl細(xì)胞)或卵巢癌細(xì)胞)的配體誘導(dǎo)的趨化性。ccr4-igg4抗體是單價的或二價的，并包含單鏈或雙鏈。ccr4-igg4抗體還可以是雙特異性抗體，其中重鏈-輕鏈異二聚體的至少一個識別ccr4。在功能上，ccr4-igg4抗體的結(jié)合親和力為約1.5nm^-1或更小?？贵wfc區(qū)的糖基化被修飾以改變ccr4結(jié)合或ccr4配體阻斷性質(zhì)。例如，fc區(qū)的巖藻糖含量與野生型相比降低。此外，抗體包括治療劑，其包括但不限于毒素、放射性標(biāo)記、sirna或細(xì)胞因子。

ccr4-igg4調(diào)節(jié)t細(xì)胞遷移和活性。具體地說，ccr4-igg4可阻斷、抑制或降低treg朝向ccl配體的遷移，并因此降低treg的抑制劑活性，例如，調(diào)節(jié)t細(xì)胞介導(dǎo)的t細(xì)胞活性的抑制。另一方面，ccr4-igg4可提高對抗原的免疫應(yīng)答。例如，ccr4-igg4提高抗原特異性t細(xì)胞活性。在其它方面，ccr4-igg4恢復(fù)或增加t細(xì)胞增殖，例如效應(yīng)t細(xì)胞增殖。再一方面，ccr4-igg4激活t細(xì)胞以分泌細(xì)胞因子，例如ifn-γ。ccr4-igg4還對調(diào)節(jié)t細(xì)胞和效應(yīng)t細(xì)胞具有有效的免疫調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致抑制treg募集至腫瘤組織和隨之發(fā)生的針對腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)t細(xì)胞的活化。

與前述ccr4-igg1不同，本文所述ccr4-igg4不通過依賴補體的細(xì)胞毒性(cdc)、依賴抗體的細(xì)胞毒性(adcc)、依賴抗體的細(xì)胞吞噬作用(adpc)或任何其它已知機制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

下表1a-2b中提供工程改造的ccr4-igg4抗體的核酸和氨基酸序列。

本發(fā)明的另一個方面，包括ccr4-igg4單克隆抗體的穩(wěn)定形式，其中鉸鏈區(qū)中的氨基酸取代允許抗體不進行體內(nèi)fab臂交換，這導(dǎo)致更有效的抗體結(jié)合。

所選抗體的重鏈和輕鏈互補決定區(qū)的氨基酸序列見下表9。

表9.重鏈和輕鏈的氨基酸序列.

如上所述，本發(fā)明的ccr4-igg4調(diào)節(jié)t細(xì)胞活性。在某些方面，給予ccr4-igg4逆轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)效應(yīng)t細(xì)胞增殖的t細(xì)胞介導(dǎo)的抑制。具體地說，用ccr4-igg4處理刺激或增加效應(yīng)t細(xì)胞(teff)的增殖，而不刺激調(diào)節(jié)t細(xì)胞(treg)的增殖。效應(yīng)t細(xì)胞由通過cd45ra和ccr7表達譜分類的4個不同的群組成：t-不同類型(tdiff)、幼稚t細(xì)胞(tnaive)、中樞記憶性t細(xì)胞(tcm)和效應(yīng)記憶性t細(xì)胞(tem)。本發(fā)明的ccr4-igg4可刺激或增加teff群的任一種的增殖。在某些方面，增加效應(yīng)t細(xì)胞增殖提高抗原特異性t細(xì)胞活性以提高對抗原的免疫應(yīng)答。在某些方面，提高效應(yīng)t細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答可有助于抑制腫瘤發(fā)生或縮小腫瘤大小。

在其它方面，ccr4-igg4調(diào)節(jié)t細(xì)胞細(xì)胞因子產(chǎn)生和分泌。例如，給予ccr4-igg4特別增加ifn-γ(ifnγ)產(chǎn)生并從t細(xì)胞中釋放。在其它方面，給予ccr4-igg4可能不影響il-10或il-4釋放。另一方面，給予ccr4-igg4可能不影響或可略微降低gf-β釋放。細(xì)胞因子釋放概況可表示通過ccr4-igg4處理激活的特殊t細(xì)胞群，因為ifnγ分泌是th1細(xì)胞(t-輔助1型細(xì)胞)特有的，而tgf-β和il-10分泌是調(diào)節(jié)t細(xì)胞特有的，且il-4由th2(t輔助2型細(xì)胞)釋放。在某些方面，ccr4-igg4刺激t細(xì)胞活性，其中t細(xì)胞是th1細(xì)胞。在一些實施方案中，ccr4-igg4刺激ifnγ的分泌，并降低或不改變tgf-β、il-10或il-4的分泌。

抗體

本文所用術(shù)語“抗體”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(ig)分子的免疫活性部分，即含有與抗原特異性結(jié)合(免疫反應(yīng))的抗原結(jié)合部位的分子。所謂“特異性結(jié)合”或“與……免疫反應(yīng)”意指與所需抗原的一個或多個抗原決定簇反應(yīng)而不與其它多肽反應(yīng)的抗體?？贵w包括但不限于多克隆、單克隆、嵌合、dab(結(jié)構(gòu)域抗體)、單鏈、fab、fab’和f(ab')2片段、scfvs和fab表達文庫。

單鏈fv(“scfv”)多肽分子是共價連接的vh：:vl異二聚體，其可自包括通過肽編碼接頭連接的vh-和vl-編碼基因的基因融合物表達。(參見huston等(1988)procnatacadsciusa85(16):5879-5883)。描述了辨別用于將來自抗體v區(qū)的天然聚集的而非化學(xué)分離的多肽輕鏈和重鏈轉(zhuǎn)化至scfv分子的多種方法，所述scfv分子可折疊成與抗原結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)大致相似的三維結(jié)構(gòu)。參見例如美國專利號5,091,513、5,132,405和4,946,778。

非常大的幼稚人scfv文庫已提供且可創(chuàng)建以提供針對大量靶分子的重排抗體基因極大的來源。可從患有感染性疾病的個體構(gòu)建較小的文庫以分離疾病特異性抗體。(參見barbas等,proc.natl.acad.sci.usa89:9339-43(1992)；zebedee等,proc.natl.acad.sci.usa89:3175-79(1992))。

一般來說，獲自人的抗體分子與igg、igm、iga、ige和igd類別的任一種有關(guān)，所述類別因存在于分子中的重鏈的性質(zhì)而彼此不同。某些類別還具有亞類，例如igg1、igg2等。此外，在人中，輕鏈可為κ鏈或λ鏈。術(shù)語“抗原結(jié)合部位”或“結(jié)合部分”是指參與抗原結(jié)合的免疫球蛋白分子的一部分?？乖Y(jié)合部位由(“h”)和輕(“l(fā)”)鏈的n端可變(“v”)區(qū)的氨基酸殘基形成。在重鏈和輕鏈v區(qū)內(nèi)有3個高度趨異的序列段(稱為“超變區(qū)”)插入在更保守的側(cè)翼序列段(稱為“構(gòu)架區(qū)”或“fr”)之間。因此，術(shù)語“fr”是指天然存在于免疫球蛋白的超變區(qū)之間并與之相鄰的氨基酸序列。在抗體分子中，輕鏈的3個超變區(qū)和重鏈的3個超變區(qū)彼此相對配置在三維空間中形成抗原結(jié)合表面?？乖Y(jié)合表面與被結(jié)合的抗原的三維表面互補，重鏈和輕鏈每個的3個超變區(qū)稱為“互補決定區(qū)”或“cdr”。

本文所用術(shù)語“表位”包括能夠與免疫球蛋白、scfv或t細(xì)胞受體特異性結(jié)合的任何蛋白質(zhì)決定簇。表位決定簇通常由分子(例如氨基酸或糖側(cè)鏈)的化學(xué)活性表面群聚組成，并通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。例如，抗體可針對多肽的n端或c端肽產(chǎn)生。

本文所用術(shù)語“免疫結(jié)合”和“免疫結(jié)合性質(zhì)”是指免疫球蛋白分子與免疫球蛋白對其有特異性的抗原之間產(chǎn)生的非共價相互作用類型。免疫結(jié)合相互作用的強度或親和力可用相互作用的解離常數(shù)(kd)表示，其中較小的kd表示較大的親和力。所選多肽的免疫結(jié)合性質(zhì)可采用本領(lǐng)域眾所周知的方法量化。一種這樣的方法需要測量抗原結(jié)合部位/抗原復(fù)合物形成和解離的速率，其中這類速率取決于復(fù)合的配偶體的濃度、相互作用的親和力和同等影響兩個方向的速率的幾何參數(shù)。因此，“結(jié)合速率常數(shù)”(kon)和“解離速率常數(shù)”(koff)兩者可通過計算濃度及結(jié)合和解離的實際速率確定。(參見nature361:186-87(1993))。koff/kon之比使得能夠消除與親和力無關(guān)的所有參數(shù)，并等于解離常數(shù)kd。(一般參見davies等(1990)annualrevbiochem59:439-473)。當(dāng)平衡結(jié)合常數(shù)(kd)≤1μm、優(yōu)選≤100nm、更優(yōu)選≤10nm、最優(yōu)選≤100pm-約1pm時，本發(fā)明的抗體被稱為與ccr4表位特異性結(jié)合，通過測定法例如放射性配體結(jié)合測定法或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的類似測定法測量。

本發(fā)明的ccr4蛋白或其衍生物、片段、類似物、同系物或直向同源物(ortholog)，可在產(chǎn)生免疫特異性結(jié)合這些蛋白質(zhì)組分的抗體時用作免疫原。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，有可能無需過度實驗只是通過確定人單克隆抗體是否防止本發(fā)明的人單克隆抗體與ccr4結(jié)合，便確定前者是否與后者具有相同的特異性。如果受測試的人單克隆抗體與本發(fā)明的人單克隆抗體競爭，正如通過本發(fā)明的人單克隆抗體的結(jié)合降低所示，則很可能2種單克隆抗體與相同的表位或與極相關(guān)的表位結(jié)合。

測定人單克隆抗體是否具有本發(fā)明的人單克隆抗體的特異性的另一方法是使本發(fā)明的人單克隆抗體與其通常與之有反應(yīng)的ccr4蛋白一起預(yù)孵育，然后加入要測試的人單克隆抗體以確定受測試的人單克隆抗體是否在其結(jié)合ccr4的能力上受抑制。如果受測試的人單克隆抗體被抑制，則很可能具有與本發(fā)明的單克隆抗體相同的或在功能上等同的表位特異性。還可通過使用ccr4并確定試驗單克隆抗體是否能夠中和ccr4，來進行本發(fā)明的人單克隆抗體的篩選。

本領(lǐng)域已知的各種方法可用于產(chǎn)生針對本發(fā)明的蛋白質(zhì)或針對其衍生物、片段、類似物、同系物或直向同源物的多克隆或單克隆抗體。(參見例如antibodies:alaboratorymanual,harlowe和laned,1988,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny，通過引用并入本文)。

抗體可通過眾所周知的技術(shù)純化，例如使用a蛋白或g蛋白(其主要提供免疫血清的igg部分)的親和層析法。隨后或備選，可將作為所尋找的免疫球蛋白的靶標(biāo)的特異性抗原或其表位固定在柱上以通過免疫親和層析法純化免疫特異性抗體。例如d.wilkinson論述了免疫球蛋白的純化(由thescientist,inc.,philadelphiapa出版的thescientist,第14卷,第8期(2000年4月17日),第25-28頁)。

術(shù)語“單克隆抗體”或“mab”或“單克隆抗體組合物”本文所用是指只含有由獨特的輕鏈基因產(chǎn)物和獨特的重鏈基因產(chǎn)物組成的抗體分子的一種分子物類的一群抗體分子。具體地說，單克隆抗體的互補決定區(qū)(cdr)在該群的所有分子中相同。mab含有能夠與特征在于對其有獨特結(jié)合親和力的抗原的特定表位免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合部位。

可采用雜交瘤方法，例如kohler和milstein，nature，256:495(1975)描述的那些方法，制備單克隆抗體。在雜交瘤方法中，小鼠、倉鼠或其它合適的宿主動物通常用免疫劑免疫以誘導(dǎo)產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生可與免疫劑特異性結(jié)合的抗體的淋巴細(xì)胞。或者，淋巴細(xì)胞可體外免疫。

免疫劑通常可包括蛋白質(zhì)抗原、其片段或其融合蛋白。一般而言，如果需要人源的細(xì)胞，則使用外周血淋巴細(xì)胞，或如果需要非人哺乳動物源，則使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。然后使用合適的融合劑(例如聚乙二醇)使淋巴細(xì)胞與永生化細(xì)胞系融合，形成雜交瘤細(xì)胞(goding,monoclonalantibodies:principlesandpractice,academicpress,(1986)第59-103頁)。永生化細(xì)胞系通常是轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞，特別是嚙齒動物、牛和人源的骨髓瘤細(xì)胞。通常使用大鼠或小鼠骨髓瘤細(xì)胞系?？墒闺s交瘤細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有抑制未融合的永生化細(xì)胞的生長或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，如果親代細(xì)胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(hgprt或hprt)，用于雜交瘤的培養(yǎng)基通常可包括次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“hat培養(yǎng)基”)，所述物質(zhì)防止hgprt缺陷型細(xì)胞的生長。

優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是這樣的細(xì)胞系，其有效融合、支持所選的產(chǎn)抗體細(xì)胞產(chǎn)生穩(wěn)定的高水平抗體表達且對培養(yǎng)基(例如hat培養(yǎng)基)敏感。更優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，其可獲自例如salkinstitutecelldistributioncenter,sandiego,california和americantypeculturecollection,manassas,virginia。還描述了用于產(chǎn)生人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系。(參見kozbor,j.immunol.,133:3001(1984)；brodeur等,monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications,marceldekker,inc.,newyork,(1987)第51-63頁))。

然后可就針對抗原的單克隆抗體的存在對雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)在其中的培養(yǎng)基進行測定。優(yōu)選通過免疫沉淀法或通過體外結(jié)合測定法，例如放射免疫測定法(ria)或酶聯(lián)免疫吸附測定法(elisa)，測定由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性。這類技術(shù)和測定法是本領(lǐng)域已知的。例如，可通過munson和pollard,anal.biochem.,107:220(1980)的scatchard分析測定單克隆抗體的結(jié)合親和力。此外，在單克隆抗體的治療應(yīng)用中，重要的是鑒定對靶抗原具有高特異性程度和高結(jié)合親和力的抗體。

在鑒定出所需的雜交瘤細(xì)胞后，克隆可通過有限稀釋方法亞克隆，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法生長。(參見goding,monoclonalantibodies:principlesandpractice,academicpress,(1986),第59-103頁)。用于此目的的合適的培養(yǎng)基包括例如dulbecco改進的eagle培養(yǎng)基和rpmi-1640培養(yǎng)基?；蛘?，雜交瘤細(xì)胞可在哺乳動物中作為腹水體內(nèi)生長。

可通過常規(guī)免疫球蛋白純化方法，例如a蛋白-瓊脂糖凝膠、羥磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或親和層析法，從培養(yǎng)基或腹水流體中分離并純化由亞克隆分泌的單克隆抗體。

還可通過例如描述于美國專利號4,816,567的重組dna方法制備單克隆抗體。可采用常規(guī)方法(例如通過使用能夠與編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)，容易地分離編碼本發(fā)明的單克隆抗體的dna并測序。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞用作這類dna的優(yōu)選來源。一旦分離，可將dna置于表達載體中，然后將表達載體轉(zhuǎn)染至不再另產(chǎn)生免疫球蛋白蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞(例如猿猴cos細(xì)胞、中華倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞)中，以在重組宿主細(xì)胞中實現(xiàn)單克隆抗體的合成。還可通過例如置換人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列代替同源鼠序列(參見美國專利號4,816,567；morrison，nature368，812-13(1994))或通過共價連接免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的編碼序列的全部或部分，來修飾dna。這類非免疫球蛋白多肽可取代本發(fā)明抗體的恒定結(jié)構(gòu)域，或可取代本發(fā)明抗體的一個抗原結(jié)合部位的可變結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生嵌合二價抗體。

完全人抗體是其中輕鏈和重鏈兩者的完整序列(包括cdr)產(chǎn)生于人基因的抗體分子。這類抗體在本文被稱為“人源化抗體”、“人抗體”或“完全人抗體”?？赏ㄟ^采用trioma技術(shù)；人b細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(參見kozbor等,1983immunoltoday4:72))和產(chǎn)生人單克隆抗體的ebv雜交瘤技術(shù)(參見cole等,1985,載于:monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,inc.,第77-96頁)，來制備人單克隆抗體。可使用人單克隆抗體，且可通過使用人雜交瘤(參見cote等,1983.procnatlacadsciusa80:2026-2030)或通過體外用eb病毒轉(zhuǎn)染人b細(xì)胞(參見cole等,1985,載于:monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,inc.,第77-96頁)，來產(chǎn)生人單克隆抗體。

另外，還可采用其它技術(shù)，包括噬菌體展示文庫，產(chǎn)生人抗體。(參見hoogenboom和winter,j.mol.biol.,227:381(1991)；marks等,j.mol.biol.,222:581(1991))。同樣，可通過將人免疫球蛋白基因座導(dǎo)入其中內(nèi)源免疫球蛋白基因部分或完全失活的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)中，來制備人抗體。在攻擊時，觀察到人抗體產(chǎn)生，這在所有方面都極類似于在人中所觀察到的，包括基因重排、裝配和抗體庫。該方法描述于例如美國專利號5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016及marks等,bio/technology10,779-783(1992)；lonberg等,nature368856-859(1994)；morrison,nature368,812-13(1994)；fishwild等,naturebiotechnology14,845-51(1996)；neuberger,naturebiotechnology14,826(1996)；以及l(fā)onberg和huszar,intern.rev.immunol.1365-93(1995)。

另外可采用經(jīng)修飾使得在響應(yīng)抗原攻擊時產(chǎn)生完全人抗體而非動物的內(nèi)源抗體的轉(zhuǎn)基因非人動物，來產(chǎn)生人抗體。(參見pct公開文本wo94/02602)。使編碼免疫球蛋白重鏈和輕鏈的內(nèi)源基因在非人宿主中失能，并將編碼人重鏈和輕鏈免疫球蛋白的活性基因座插入宿主的基因組中。例如，使用含有必要人dna區(qū)段的酵母人工染色體，摻入人基因中。然后通過使含有少于修飾的完全互補序列的中間轉(zhuǎn)基因動物雜交，獲得提供所有所需修飾的動物作為子代。這類非人動物的優(yōu)選實施方案是小鼠，稱為xenomouse^tm，正如pct公開文本wo96/33735和wo96/34096所公開的。該動物產(chǎn)生分泌完全人免疫球蛋白的b細(xì)胞?？贵w可直接獲自用目標(biāo)免疫原免疫的動物，例如多克隆抗體的制備物，或備選獲自來源于動物的永生化b細(xì)胞，例如產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。此外，編碼具有人可變區(qū)的免疫球蛋白的基因可恢復(fù)或表達以直接獲得抗體，或可進一步修飾以獲得抗體例如單鏈fv(scfv)分子的類似物。

產(chǎn)生缺乏內(nèi)源免疫球蛋白重鏈表達的非人宿主(以小鼠為例)的方法的實例公開于美國專利號5,939,598。還可通過這樣的方法獲得，所述方法包括自胚胎干細(xì)胞中的至少一個內(nèi)源重鏈基因座缺失j區(qū)段基因以防止基因座的重排并防止重排免疫球蛋白重鏈基因座的轉(zhuǎn)錄物的形成，所述缺失通過含有編碼選擇標(biāo)記的基因的打靶載體實現(xiàn)；并從胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生其體細(xì)胞和生殖細(xì)胞含有編碼選擇標(biāo)記的基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。

用于產(chǎn)生目標(biāo)抗體(例如人抗體)的一種方法公開于美國專利號5,916,771。該方法包括將含有編碼重鏈的核苷酸序列的表達載體導(dǎo)入培養(yǎng)中的哺乳動物宿主細(xì)胞中，將含有編碼輕鏈的核苷酸序列的表達載體導(dǎo)入另一種哺乳動物宿主細(xì)胞中，并將兩種細(xì)胞融合形成雜交細(xì)胞。雜交細(xì)胞表達含有重鏈和輕鏈的抗體。

在對該方法的進一步改進中，鑒定免疫原上的臨床相關(guān)表位的方法和選擇以高親和力與相關(guān)表位免疫特異性結(jié)合的抗體的相關(guān)方法公開于pct公開文本wo99/53049。

可通過含有編碼上述單鏈抗體的dna區(qū)段的載體表達抗體。

這些可包括載體、脂質(zhì)體、裸dna、佐劑輔助dna(adjuvant-assisteddna)、基因槍、導(dǎo)管等。載體包括化學(xué)綴合物(描述于wo93/64701，其具有打靶部分(例如細(xì)胞表面受體的配體)和核酸結(jié)合部分(例如聚賴氨酸))；病毒載體(例如dna或rna病毒載體)；融合蛋白(例如描述于pct/us95/02140(wo95/22618)，其是含有靶向部分(例如對靶細(xì)胞有特異性的抗體)和核酸結(jié)合部分(例如魚精蛋白)的融合蛋白)；質(zhì)粒；噬菌體等。載體可為染色體的、非染色體的或合成的。

優(yōu)選的載體包括病毒載體、融合蛋白和化學(xué)綴合物。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括莫洛尼鼠白血病毒。優(yōu)選dna病毒載體。這些載體包括痘病毒載體(poxvector)例如正痘病毒或禽痘病毒載體(orthopox或avipoxvector)；皰疹病毒載體例如單純皰疹i病毒(hsv)載體(參見geller,a.i.等,j.neurochem,64:487(1995)；lim,f.等,載于dnacloning:mammaliansystems,d.glover編輯(oxforduniv.press,oxfordengland)(1995)；geller,a.i.等,procnatl.acad.sci.:u.s.a.90:7603(1993)；geller,a.i.等,procnatl.acad.sciusa87:1149(1990))；腺病毒載體(參見legallasalle等,science,259:988(1993)；davidson等,nat.genet3:219(1993)；yang等,j.virol.69:2004(1995))和腺伴隨病毒載體(參見kaplitt,m.g.等,nat.genet.8:148(1994))。

痘病毒載體將基因?qū)爰?xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。禽痘病毒載體只引起核酸的短期表達。優(yōu)選腺病毒載體、腺伴隨病毒載體和單純皰疹病毒(hsv)載體以將核酸導(dǎo)入神經(jīng)細(xì)胞中。腺病毒載體導(dǎo)致比腺伴隨病毒(約4個月)短的表達(約2個月)，這進而比hsv載體短。所選的具體載體將取決于靶細(xì)胞和待治療的病況。導(dǎo)入可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行，例如感染、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化?；蜣D(zhuǎn)移方式的實例包括例如裸dna、capo4沉淀、deae葡聚糖、電穿孔、原生質(zhì)體融合、脂轉(zhuǎn)染、細(xì)胞顯微注射和病毒載體。

載體可用來實質(zhì)上靶向任何所需的靶細(xì)胞。例如，可采用立體定位注射以將載體(例如腺病毒、hsv)引導(dǎo)至所需位置。此外，可使用小型泵輸注系統(tǒng)，例如synchromed輸注系統(tǒng)，通過腦室內(nèi)(icv)輸注遞送顆粒。也已證實基于稱為對流的總體流動的方法在將大分子遞送至腦的延伸區(qū)域是有效的，并可用于將載體遞送至靶細(xì)胞。(參見bobo等,proc.natl.acad.sci.usa91:2076-2080(1994)；morrison等,am.j.physiol.266:292-305(1994))?？刹捎玫钠渌椒ò▽?dǎo)管、靜脈內(nèi)、胃腸外、腹膜內(nèi)和皮下注射及口服或其它已知的給藥途徑。

可使用這些載體以表達可以多種方式使用的大量抗體。例如檢測樣品ccr4的存在。還可用來嘗試與ccr4結(jié)合并破壞ccr4活性?？贵w。

可改編用于產(chǎn)生對本發(fā)明的抗原蛋白有特異性的單鏈抗體的技術(shù)(參見例如美國專利號4,946,778)。另外，可改編用于構(gòu)建fab表達文庫的方法(參見例如huse等,1989science246:1275-1281)，以允許快速有效地鑒定具有對蛋白質(zhì)或其衍生物、片段、類似物或同系物有特異性的單克隆fab片段。含有蛋白質(zhì)抗原的個體遺傳型的抗體片段可通過本領(lǐng)域已知技術(shù)產(chǎn)生，包括但不限于：(i)通過抗體分子的胃蛋白酶消化產(chǎn)生的f(ab')2片段；(ii)通過還原f(ab')2片段的二硫橋產(chǎn)生的fab片段；(iii)通過抗體分子用木瓜蛋白酶和還原劑處理產(chǎn)生的fab片段和(iv)fv片段。

雜綴合物抗體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。雜綴合物抗體由2種共價連接的抗體組合。這類抗體被提議為例如使免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不需要的細(xì)胞(參見美國專利號4,676,980)和用于治療hiv感染(參見wo91/00360、wo92/200373、ep03089)。預(yù)期可采用合成蛋白質(zhì)化學(xué)的已知方法，包括涉及交聯(lián)劑的方法，體外制備抗體。例如，免疫毒素可使用二硫化物交換反應(yīng)或通過形成硫醚鍵構(gòu)建。用于該目的的合適的試劑的實例包括亞氨基硫醇鹽和甲基-4-mercaptobutyrimidate和公開于例如美國專利號4,676,980中的那些。雜綴合物抗體也可指雙特異性抗體，其中雙特異性抗體由例如2個共價連接的單鏈抗體或scfv，或2個共價連接的來自識別不同抗原的兩種抗體的可變重鏈-可變輕鏈二聚體組成。

對于效應(yīng)子功能，可能需要修飾本發(fā)明的抗體，以提高例如抗體在治療癌癥中的療效。例如，可將半胱氨酸殘基引入fc區(qū)，因此允許這個區(qū)中的鏈間二硫鍵形成。由此產(chǎn)生的同二聚體抗體可具有改進的內(nèi)化能力和/或升高的補體介導(dǎo)的細(xì)胞殺死和依賴抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc)。(參見caron等,j.expmed.,176:1191-1195(1992)和shopes,j.immunol.,148:2918-2922(1992))?；蛘撸贵w可經(jīng)工程改造以具有雙重fc區(qū)，因此可具有提高的補體溶解和adcc能力。(參見stevenson等,anti-cancerdrugdesign,3:219-230(1989))。

本發(fā)明還涉及包含與細(xì)胞毒性劑例如毒素(例如細(xì)菌、真菌、植物或動物來源的酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性綴合物)綴合的抗體的免疫綴合物。

可使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉毒素a鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素a鏈(來自銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白a鏈、相思豆毒蛋白a鏈、塑蓮根毒蛋白a鏈、α-帚曲霉素、油桐(aleuritesfordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(phytolacaamericana)蛋白(papi、papii和pap-s)、苦瓜(momordicacharantia)抑制劑、麻風(fēng)樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制劑、多花白樹毒蛋白、絲林霉素、局限曲菌素、酚霉素、伊諾霉素和單端孢菌霉素?？色@得用于產(chǎn)生放射性綴合的抗體的各種放射性核素。實例包括²¹²bi、¹³¹i、¹³¹in、⁹⁰y和¹⁸⁶re。

使用各種雙官能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑例如n-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(spdp)、亞氨基噻烷(it)、亞氨基酯的雙官能衍生物(例如己二酰亞胺二甲酯hcl)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亞胺)、醛(例如戊二醛)、雙疊氮基化合物(例如雙(對疊氮基苯甲?；?己烷二胺)、雙-重氮衍生物(例如雙-(對重氮苯甲?；?-乙二胺)、二異氰酸酯類(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)和雙-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)，制備抗體和細(xì)胞毒性劑的綴合物。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可按vitetta,science238:1098(1987)所述制備。碳-14標(biāo)記的1-異硫氰酸基芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(mx-dtpa)是用于放射性核苷酸(radionucleotide)與抗體綴合的示例性螯合劑(參見wo94/11026)。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，各種各樣可能的部分可與所得抗體或本發(fā)明的其它分子偶聯(lián)。(參見例如"conjugatevaccines",contributionstomicrobiologyandimmunology,j.m.cruse和r.e.lewis,jr(編輯),cargerpress,newyork,(1989)，其全部內(nèi)容通過引用并入本文)。

偶聯(lián)可通過使兩種分子結(jié)合的任何化學(xué)反應(yīng)實現(xiàn)，只要抗體和另一部分保留其各自的活性。這種連接可包括許多化學(xué)機制，例如共價結(jié)合、親和力結(jié)合、插入、配位結(jié)合和絡(luò)合。然而優(yōu)選的結(jié)合是共價結(jié)合。共價結(jié)合可通過現(xiàn)有側(cè)鏈的直接縮合或通過外部橋接分子的摻入實現(xiàn)。許多二價或多價連接劑可用于將蛋白質(zhì)分子(例如本發(fā)明的抗體)與其它分子偶聯(lián)。例如，代表性偶聯(lián)劑可包括有機化合物例如硫酯、碳二亞胺、琥珀酰亞胺、二異氰酸酯、戊二醛、重氮基苯和己二胺。該列表無意窮盡本領(lǐng)域已知的各種類別的偶聯(lián)劑，而相反只是典型的更常見的偶聯(lián)劑。(參見killen和lindstrom,jour.immun.133:1335-2549(1984)；jansen等,immunologicalreviews62:185-216(1982)；以及vitetta等,science238:1098(1987))。優(yōu)選的接頭描述于文獻中。(參見例如描述mbs(m-馬來酰亞胺苯甲?；?n-羥基琥珀酰亞胺酯的使用的ramakrishnan,s.等,cancerres.44:201-208(1984))。另參見美國專利號5,030,719，其描述了通過寡肽接頭與抗體偶聯(lián)的鹵化乙酰基酰肼衍生物的使用。特別優(yōu)選的接頭包括：(i)edc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亞胺鹽酸鹽；(ii)smpt(4-琥珀酰亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基(pridyl)-聯(lián)硫基)-甲苯((piercechem.co.，目錄(21558g)；(iii)spdp(琥珀酰亞胺基-6-[3-(2-吡啶基聯(lián)硫基)丙酰胺基]己酸酯(piercechem.co.，目錄號21651g)；(iv)磺基-lc-spdp己酸(磺基琥珀酰亞胺基-6-[3-(2-吡啶基聯(lián)硫基)-丙酰胺]酯(piercechem.co.目錄號2165-g)；和(v)與edc綴合的磺基-nhs(n-羥基磺基-琥珀酰亞胺：piercechem.co.，目錄號24510)。

上述接頭含有具有不同屬性的組分，因此產(chǎn)生具有不同生理化學(xué)性質(zhì)的綴合物。例如，烷基羧酸酯的磺基-nhs酯比芳族羧酸酯的磺基-nhs酯穩(wěn)定。與磺基-nhs酯相比，含nhs-酯的接頭較不溶解。此外，接頭smpt含有位阻二硫鍵，并可形成穩(wěn)定性提高的綴合物。二硫鍵與其它健相比一般較不穩(wěn)定，因為二硫鍵體外被切割，導(dǎo)致可獲得較少的綴合物。具體地說，磺基-nhs可提高碳二亞胺偶聯(lián)物的穩(wěn)定性。碳二亞胺偶聯(lián)物(例如edc)當(dāng)與磺基-nhs聯(lián)用時，形成比僅碳二亞胺偶聯(lián)反應(yīng)更耐水解的酯。

在一些實施方案中，將突變引入mab的恒定區(qū)，使得mab的依賴抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc)活性改變。例如，突變是ch2結(jié)構(gòu)域中的lala突變，其中fc區(qū)第234和235位的亮氨酸突變成丙氨酸，并消除被特異性fc受體結(jié)合。一方面，mab在異二聚體mab的一個scfv分子上含有突變，這降低adcc活性。另一方面，mab在異二聚體mab的兩條鏈上含有突變，這完全消除adcc活性。例如，引入mab的一個或兩個scfv分子的突變是ch2結(jié)構(gòu)域中的lala突變?？蓛?yōu)化具有adcc活性的這些mab，使得mab對表達被mab識別的一種抗原的細(xì)胞顯示最大選擇性殺滅，然而對被mab識別的第二種抗原顯示最小殺滅。

本文公開的抗體還可作為免疫脂質(zhì)體配制。含有抗體的脂質(zhì)體通過描述于例如以下的本領(lǐng)域已知方法制備：epstein等,proc.natl.acad.sci.usa,82:3688(1985)；hwang等,proc.natlacad.sci.usa,77:4030(1980)以及美國專利號4,485,045和4,544,545。循環(huán)時間延長的脂質(zhì)體公開于美國專利號5,013,556。

特別有用的脂質(zhì)體可用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和peg衍生化磷脂酰乙醇胺(peg-pe)的脂質(zhì)組合物通過反相蒸發(fā)方法產(chǎn)生。使脂質(zhì)體通過規(guī)定孔徑的過濾器流出，得到具有所需直徑的脂質(zhì)體?？砂磎artin等,j.biol.chem.257:286-288(1982)所述通過二硫化物交換反應(yīng)使本發(fā)明抗體的fab’片段與脂質(zhì)體綴合。

針對ccr4的抗體的用途

用于篩選具有所需特異性的抗體的方法包括但不限于酶聯(lián)免疫吸附測定法(elisa)和本領(lǐng)域已知的其它免疫介導(dǎo)的技術(shù)。

可將針對ccr4蛋白(或其片段)的抗體用于本領(lǐng)域內(nèi)已知的涉及ccr4蛋白的定位和/或定量的方法中(例如用于測量合適生理樣品內(nèi)的ccr4蛋白的水平、用于診斷方法、用于使蛋白質(zhì)成像等)。在規(guī)定的實施方案中，含有抗體來源的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、對ccr4蛋白或其衍生物、片段、類似物或同系物有特異性的抗體用作藥理學(xué)活性化合物(下文稱為“治療劑”)。

可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如免疫親和層析法或免疫沉淀法，使用對本發(fā)明的ccr4蛋白有特異性的抗體分離ccr4多肽。在診斷上可使用針對ccr4蛋白(或其片段)的抗體以監(jiān)測組織中的蛋白質(zhì)水平作臨床試驗程序的一部分，例如以確定規(guī)定治療方案的功效?？赏ㄟ^使抗體與可檢測物質(zhì)偶聯(lián)(即物理連接)促進檢測?？蓹z測物質(zhì)的實例包括各種酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)和放射性物質(zhì)。合適酶的實例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適輔基復(fù)合物的實例包括鏈霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適熒光物質(zhì)的實例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的實例包括魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)的實例包括螢光素酶，螢光素和水母發(fā)光蛋白；而合適的放射性物質(zhì)的實例包括¹²⁵i、¹³¹i、³⁵s或³h。

本發(fā)明的抗體，包括多克隆、單克隆、人源化和完全人抗體可用作治療劑。所述治療劑一般可用來治療或預(yù)防受試者的癌癥，提高疫苗效力或提高天然免疫應(yīng)答。將抗體制備物、優(yōu)選對于靶抗原具有高特異性和高親和力的抗體制備物給予受試者，并且由于其與靶標(biāo)結(jié)合通常會發(fā)揮作用。給予抗體可破壞或抑制或干擾ccr4蛋白的活性。

治療有效量的本發(fā)明的抗體一般涉及實現(xiàn)治療目的所需的量。如上所述，這可以是抗體及其靶抗原之間的結(jié)合相互作用，這在某些情況下干擾靶標(biāo)的功能。需要給予的量此外將取決于抗體對其特異性抗原的結(jié)合親和力，并且還將取決于從其所給予的其它受試者的自由體積中耗減所給予的抗體的速率。以非限制性實例來說，治療有效劑量的本發(fā)明的抗體或抗體片段的常見范圍可為約0.1mg/kg體重-約50mg/kg體重。常見的給藥頻率的范圍可為例如每天兩次至一周一次。

可以藥物組合物的形式給予特異性結(jié)合本發(fā)明的ccr4蛋白或其片段的抗體以及通過本文公開的篩選測定法鑒定的其它分子以治療癌癥或其它增殖性病癥。在remington:thescienceandpracticeofpharmacy第19版.(alfonsor.gennaro等編輯)mackpub.co.,easton,pa.,1995；drugabsorptionenhancement:concepts,possibilities,limitations,andtrends,harwoodacademicpublishers,langhorne,pa.,1994；以及peptideandproteindrugdelivery(advancesinparenteralsciences,第4卷),1991,m.dekker,newyork中提供了涉及制備這類組合物的原理和考慮事項以及選擇組分的指導(dǎo)。

當(dāng)使用抗體片段時，優(yōu)選與靶蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的最小抑制片段。例如，根據(jù)抗體的可變區(qū)序列，可設(shè)計肽分子以保持結(jié)合靶蛋白序列的能力。這類肽可化學(xué)合成和/或通過重組dna技術(shù)產(chǎn)生。(參見例如marasco等,proc.natl.acad.sci.usa,90:7889-7893(1993))。制劑還可含有待治療的具體適應(yīng)癥所需的一種以上的活性化合物，優(yōu)選不會彼此不利影響的具有補充活性的活性化合物。備選或另外，組合物可包含提高其功能的作用劑，例如細(xì)胞毒性劑、細(xì)胞因子、化療劑或生長抑制劑。這類分子適宜以對預(yù)期目的是有效的量組合存在。

還可將活性成分包封在例如分別通過凝聚技術(shù)或界面聚合制備的微膠囊(例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚甲基丙烯酸甲酯微膠囊)；膠態(tài)藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳、納米粒和納米膠囊)或粗乳狀液中。

待用于體內(nèi)給藥的制劑必須是無菌的。這容易通過經(jīng)無菌濾過膜過濾實現(xiàn)。

可制備緩釋制劑。緩釋制劑的合適實例包括含有抗體的固體疏水聚合物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)為成型制品的形式，例如膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)的實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥基乙基甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚丙交酯(美國專利號3,773,919)、l-谷氨酸和γ乙基-l-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如luprondepot^tm(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的注射用微球體)和聚-d-(-)-3-羥基丁酸。雖然聚合物(例如乙烯乙酸乙酯和乳酸-乙醇酸)使得能夠釋放分子超過100天，但某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)較短的時間。

本發(fā)明的抗體可用作檢測樣品中ccr4(或其蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段)存在的作用劑。優(yōu)選抗體含有可檢測標(biāo)記?？贵w可為多克隆，或更優(yōu)選為單克隆?？墒褂猛暾贵w或其片段(例如fab、scfv或f(ab)2)。關(guān)于探針或抗體，術(shù)語“標(biāo)記的”旨在包括通過使可檢測物質(zhì)與探針或抗體偶聯(lián)(即物理連接)直接標(biāo)記探針或抗體，以及通過與直接標(biāo)記的另一種試劑反應(yīng)間接標(biāo)記探針或抗體。間接標(biāo)記的實例包括如下檢測第一抗體：使用熒光標(biāo)記的第二抗體和用生物素末端標(biāo)記dna探針使得它可用熒光標(biāo)記的鏈霉抗生物素檢出。術(shù)語“生物樣品”旨在包括自受試者分離的組織、細(xì)胞和生物流體，以及存在于受試者內(nèi)的組織、細(xì)胞和流體。因此，術(shù)語“生物樣品”用法范圍內(nèi)包括血液和血液的部分或組分(包括血清、血漿)或淋巴。也就是說，本發(fā)明的檢測方法可用來體外以及體內(nèi)檢測生物樣品中的分析物mrna、蛋白質(zhì)或基因組dna。例如，用于檢測分析物mrna的體外技術(shù)包括rna雜交和原位雜交。用于檢測分析物蛋白質(zhì)的體外技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測定法(elisa)、蛋白質(zhì)印跡法、免疫沉淀法和免疫熒光法。用于檢測分析物基因組dna的體外技術(shù)包括dna雜交。用于進行免疫測定法的程序描述于例如“elisa:theoryandpractice:methodsinmolecularbiology”,第42卷,j.r.crowther(編輯)humanpress,totowa,nj,1995；“immunoassay”,e.diamandis和t.christopoulus,academicpress,inc.,sandiego,ca,1996；以及“practiceandtheoryofenzymeimmunoassays”,p.tijssen,elseviersciencepublishers,amsterdam,1985。此外，用于檢測分析物蛋白質(zhì)的體內(nèi)技術(shù)包括將標(biāo)記的抗分析物蛋白質(zhì)抗體引入受試者中。例如，抗體可用放射性標(biāo)記進行標(biāo)記，所述放射性標(biāo)記在受試者中的存在和位置可通過標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)檢測。

藥物組合物

可將本發(fā)明抗體或作用劑(本文亦稱為“活性化合物”)及其衍生物、片段、類似物和同系物摻入適于給藥的藥物組合物中。這類組合物通常包含抗體或作用劑和藥學(xué)上可接受的載體。本文所用術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”旨在包括與藥物給予相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣材料、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。合適的載體描述于本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)參考教材remington’spharmaceuticalsciences的最近版本，其通過引用并入本文。這類載體或稀釋劑的優(yōu)選實例包括但不限于水、鹽水、林格氏液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。還可使用脂質(zhì)體和非水性載體例如固定油。用于藥用活性物質(zhì)的這類介質(zhì)和作用劑的使用是本領(lǐng)域眾所周知的。除了任何常規(guī)介質(zhì)或作用劑與活性化合物相容以外，還考慮了其在組合物中的使用。還可將補充活性化合物摻入組合物中。

配制本發(fā)明的藥物組合物與其既定給藥途徑相容。給藥途徑的實例包括胃腸外，例如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、口服(例如口用)、經(jīng)皮(即局部)、跨黏膜和直腸給藥。用于胃腸外、皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液劑或混懸劑可包括下列組分：無菌稀釋劑例如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細(xì)菌劑例如芐醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑例如乙二胺四乙酸(edta)；緩沖劑例如乙酸酯、檸檬酯或磷酸酯；和調(diào)節(jié)張度的物質(zhì)例如氯化鈉或葡萄糖。可用酸或堿(例如鹽酸或氫氧化鈉)調(diào)節(jié)ph?？蓪⑽改c外制劑裝入安瓿、一次性注射器或用玻璃或塑料制造的多劑量小瓶中。

適于注射用的藥物組合物包括無菌水性溶液劑(其中是水溶性的)或用于無菌注射用溶液劑或分散劑的臨用時制備的分散劑和無菌粉劑。對于靜脈內(nèi)給藥，合適的載體包括生理鹽水、注射用抑菌水、cremophorel?(basf，parsippany，n.j.)或磷酸緩沖鹽水(pbs)。在所有情況下，組合物必須是無菌的，并且就存在流暢注射性而言應(yīng)是流體。在制造和儲存條件下必須是穩(wěn)定的，并且必須針對微生物(例如細(xì)菌和真菌)的污染作用進行防腐。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適的混合物。例如，可通過使用包衣材料例如卵磷脂、在分散體的情況下通過保持所需粒徑和通過使用表面活性劑，保持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。可通過各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等，實現(xiàn)微生物作用的防止。在許多情況下，優(yōu)選可在組合物中包括等滲劑例如糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇、氯化鈉。可在組合物中包括延遲吸收的物質(zhì)(例如單硬脂酸鋁和明膠)，來引起注射用組合物的吸收延長。

可通過將所需量的活性化合物與按需要與上列成分的一種或組合一起摻入合適的溶劑中，接著過濾除菌，來制備無菌注射用溶液劑。一般而言，分散劑通過將活性化合物摻入含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和上列所需的其它成分的無菌溶媒中來制備。在用于制備無菌注射用溶液劑的無菌粉劑的情況下，制備方法是真空干燥和冷凍干燥，得到來自其前述除菌過濾溶液的活性成分加任何其它所需成分的粉劑。

口服組合物一般包括惰性稀釋劑或可食用載體。可將它們包封在明膠膠囊中或壓制成片劑。對于口服治療性給藥的目的，活性化合物可與賦形劑一起摻入，并以片劑、含片或膠囊劑的形式使用?？诜M合物還可以使用流體載體制備以用作漱口劑，其中流體載體中的化合物口內(nèi)使用、漱口并吐出或吞咽。可包括藥物上相容的粘合劑和/或輔料作為組合物的部分。片劑、片劑、膠囊劑、含片等可含有下列成分的任一種或類似性質(zhì)的化合物：粘合劑例如微晶纖維素、西黃蓍膠或明膠；賦形劑例如淀粉或乳糖、崩解劑例如藻酸、primogel或玉米淀粉；潤滑劑例如硬脂酸鎂或sterotes；助流劑例如膠態(tài)二氧化硅；甜味劑例如蔗糖或糖精；或矯味劑例如歐薄荷、水楊酸甲酯或橙味調(diào)味料。

對于吸入給藥，從含有合適拋射劑(例如二氧化碳等氣體)的加壓容器或分配器中以噴霧劑的形式遞送化合物。

全身給藥還可通過跨黏膜或經(jīng)皮手段。對于跨黏膜或經(jīng)皮給藥，在制劑中使用適于通過待滲透的屏障的滲透劑。這類滲透劑通常是本領(lǐng)域已知的，且對于跨黏膜給藥包括洗滌劑、膽鹽和梭鏈孢酸衍生物?？琊つそo藥可通過使用鼻腔噴霧劑或栓劑完成。對于經(jīng)皮給藥，按本領(lǐng)域普遍已知的，將活性化合物配制成軟膏劑、油膏劑、凝膠劑或乳膏劑。

還可以栓劑(例如用常規(guī)栓劑基料例如可可脂和其它甘油酯)或滯留型灌腸劑的形式制備化合物用于直腸遞送。

在一個實施方案中，活性化合物用保護化合物免于從身體快速清除的載體制備，例如控釋制劑，包括植入劑和微囊化遞送系統(tǒng)?？墒褂蒙锟山到獾纳锵嗳莸木酆衔?，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制備這類制劑的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。原料還可市購獲自alzacorporation和novapharmaceuticals，inc。脂質(zhì)體混懸液(包括靶向用抗病毒抗原的單克隆抗體感染的細(xì)胞的脂質(zhì)體)也可用作藥學(xué)上可接受的載體。這些可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法例如美國專利號4,522,811中的描述制備。

尤其有利的是將口服或胃腸外組合物配制在劑量單位形式中以易于給藥劑量均勻性。本文所用劑量單位形式是指適于作為待治療的受試者的單位劑量的物理離散單位；各單位含有經(jīng)計算產(chǎn)生所需治療作用的預(yù)定量的活性化合物以及所需要的藥用載體。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格受制于并直接取決于活性化合物的獨特性質(zhì)和要達到的具體治療作用及配混用于治療個體的這類活性化合物領(lǐng)域中的固有限制。

藥物組合物可與給藥說明一起包括在容器、藥包或分配器中。

篩選方法

本發(fā)明提供用于鑒定調(diào)節(jié)或以別的方式干擾ccr4活性的調(diào)節(jié)劑，即候選或試驗化合物或物質(zhì)(例如肽、肽模擬物、小分子或其它藥物)的方法(本文亦稱為“篩選測定法”)。還提供鑒定可用于治療癌癥的化合物的方法。本發(fā)明還包括采用本文所述篩選測定法鑒定的化合物。

例如，本發(fā)明提供用于篩選調(diào)節(jié)ccr4碳酸酐酶活性的候選或試驗化合物的測定法。本發(fā)明的試驗化合物可采用本領(lǐng)域已知的組合文庫方法中的多種方法獲得，包括：生物文庫；空間可尋址平行固相或溶液相文庫；需要去卷積的合成文庫方法；“一珠粒一化合物(one-beadone-compound)”文庫方法；和采用親和層析選擇的合成文庫方法。生物文庫方法限于肽文庫，而其它4種方法適用于肽、非肽寡聚體或化合物的小分子文庫。(參見例如lam,1997.anticancerdrugdesign12:145)。

本文所用“小分子”意指分子量小于約5kd、最優(yōu)選小于約4kd的組合物。小分子可為例如核酸、肽、多肽、肽模擬物、糖、脂質(zhì)或其它有機或無機分子?；瘜W(xué)和/或生物學(xué)混合物(例如真菌、細(xì)菌或藻類提取物)的文庫是本領(lǐng)域已知的，并可采用本發(fā)明的任何測定法篩選。

用于分子文庫合成的方法的實例可見于例如：dewitt等,1993.proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:6909；erb等,1994.proc.natl.acad.sci.u.s.a.91:11422；zuckermann等,1994.j.med.chem.37:2678；cho等,1993.science261:1303；carrell等,1994.angew.chem.int.ed.engl.33:2059；carell等,1994.angew.chem.int.ed.engl.33:2061；以及gallop等,1994.j.med.chem.37:1233。

化合物的文庫可如下提供：在溶液中(參見例如houghten,1992.biotechniques13:412-421)或珠粒上(參見lam,1991.nature354:82-84)、芯片上(參見fodor,1993.nature364:555-556)、細(xì)菌(參見美國專利號5,223,409)、孢子(參見美國專利5,233,409)、質(zhì)粒(參見cull等,1992.proc.natl.acad.sci.usa89:1865-1869)或噬菌體上(參見scott和smith,1990.science249:386-390；devlin,1990.science249:404-406；cwirla等,1990.proc.natl.acad.sci.u.s.a.87:6378-6382；felici,1991.j.mol.biol.222:301-310和美國專利號5,233,409)。

在一個實施方案中，將候選化合物引入抗體-抗原復(fù)合物中，并測定候選化合物是否破壞抗體-抗原復(fù)合物，其中這種復(fù)合物的破壞表明候選化合物調(diào)節(jié)ccr4活性。

在另一個實施方案中，提供至少一種ccr4蛋白，其暴露于至少一種中和單克隆抗體中。檢測抗體-抗原復(fù)合物的形成，將一種或多種候選化合物引入復(fù)合物中。如果在引入一種或多種候選化合物后抗體-抗原復(fù)合物遭破壞，則候選化合物可用于治療癌癥或增殖性疾病或病癥，特別是腎增殖性病癥。

可如下實現(xiàn)試驗化合物干擾或破壞抗體-抗原復(fù)合物的能力的測定：通過例如使試驗化合物與放射性同位素或酶促標(biāo)記偶聯(lián)，使得可通過檢測復(fù)合物中標(biāo)記的化合物，測定試驗化合物與抗原或其生物活性部分的結(jié)合。例如，試驗化合物可用¹²⁵i、³⁵s、¹⁴c或³h直接或間接標(biāo)記，且通過放射性發(fā)射的直接計數(shù)或通過閃爍計數(shù)來檢測放射性同位素。或者，試驗化合物可用例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或螢光素酶進行酶促標(biāo)記，且通過測定合適底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，來檢測酶促標(biāo)記。

在一個實施方案中，所述測定法包括使抗體-抗原復(fù)合物與試驗化合物接觸，并測定試驗化合物與抗原相互作用或以別的方式破壞現(xiàn)有抗體-抗原復(fù)合物的能力。在這個實施方案中，測定試驗化合物與抗原相互作用和/或破壞抗體-抗原復(fù)合物的能力包括試驗化合物與抗體相比與抗原或其生物活性部分優(yōu)先結(jié)合的能力。

在另一個實施方案中，所述測定法包括使抗體-抗原復(fù)合物與試驗化合物接觸，并測定試驗化合物調(diào)節(jié)抗體-抗原復(fù)合物的能力。可通過例如測定在試驗化合物存在下抗原與抗體結(jié)合或相互作用的能力，實現(xiàn)試驗化合物調(diào)節(jié)抗體-抗原復(fù)合物的能力的測定。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，在本文公開的任何篩選方法中，抗體可以是ccr4中和抗體。此外，抗原可以是ccr4蛋白或其部分(例如ca結(jié)構(gòu)域)。

本文公開的篩選方法可以基于細(xì)胞的測定法或不含細(xì)胞的測定法進行。在不含細(xì)胞的測定法包括ccr4蛋白的膜結(jié)合形式的情況下，可能需要使用增溶劑使得蛋白質(zhì)的膜結(jié)合形式保持在溶液中。這類增溶劑的實例包括非離子洗滌劑例如n-辛基葡糖苷、n-十二烷基葡糖苷、n-十二烷基麥芽糖苷、辛?；?n-甲基葡糖酰胺、癸?；?n-甲基葡糖酰胺、triton^?x-100、triton^?x-114、thesit^?、異十三烷基聚(乙二醇醚)n、n-十二烷基-n,n-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸酯、3-(3-膽酰胺丙基)二甲基amminiol-1-丙磺酸酯(chaps)或3-(3-膽酰胺丙基)二甲基amminiol-2-羥基-1-丙磺酸酯(chapso)。

在不止一個實施方案中，可能需要固定抗體或抗原以利于在引入候選化合物后從一種或兩種非復(fù)合形式中分離復(fù)合形式，以及適應(yīng)測定的自動化。在選化合物存在和不存在時抗體-抗原復(fù)合物的觀察可在適于裝有反應(yīng)物的任何容器中完成。這類容器的實例包括微量滴定板、試管和微量離心管。在一個實施方案中，可提供添加允許蛋白質(zhì)的一種或兩種與基質(zhì)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。例如，gst-抗體融合蛋白或gst-抗原融合蛋白可吸附到谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠粒(sigmachemical,st.louis,mo)或谷胱甘肽衍生化微量滴定板上，然后與試驗化合物混合，并在有助于復(fù)合物形成的條件下(例如在鹽和ph的生理條件下)孵育混合物。在孵育后，洗滌珠粒或微量滴定板孔以除去任何未結(jié)合的組分，在珠粒的情況下為固定的基質(zhì)，直接或間接測定復(fù)合物?；蛘撸瑥?fù)合物可從基質(zhì)上解離，抗體-抗原復(fù)合物形成的水平可采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定。

用于將蛋白質(zhì)固定在基質(zhì)上的其它技術(shù)也可用于本發(fā)明的篩選測定法。例如，可利用生物素和鏈霉抗生物素的綴合使抗體或抗原(例如ccr4蛋白或其ca結(jié)構(gòu)域)固定?？刹捎帽绢I(lǐng)域眾所周知的技術(shù)(例如生物素化試劑盒，piercechemicals，rockford，ill.)，從生物素-nhs(n-羥基-琥珀酰亞胺)制備生物素化抗體或抗原分子，并固定在鏈霉抗生物素包被的96孔板(piercechemical)的孔中?；蛘?，與抗體或目標(biāo)抗原起反應(yīng)但不干擾目標(biāo)抗體-抗原復(fù)合物的形成的其它抗體可被衍生化至板的孔中，且未結(jié)合的抗體或抗原通過抗體綴合被捕獲在孔中。除本文所述用于gst固定化復(fù)合物的方法以外，用于檢測這類復(fù)合物的方法包括使用與抗體或抗原起反應(yīng)的這類其它抗體的復(fù)合物的免疫檢測。

本發(fā)明另涉及通過前述篩選測定法的任一種鑒定的新的作用劑及其如上文所述用于治療的用途。

診斷測定

可通過合適的測定法，例如常規(guī)的免疫測定法類型，檢測本發(fā)明的抗體。例如，可進行其中將ccr4蛋白或其片段(例如ca結(jié)構(gòu)域)在固相中固定的夾心測定法。保持孵育持續(xù)足夠的一段時間以允許樣品中的抗體與固相上的固定化多肽結(jié)合。在這最初的孵育之后，將固相從樣品中分離。洗滌固相以除去未結(jié)合的物質(zhì)和干擾物質(zhì)例如也可存在于樣品中的非特異性蛋白質(zhì)。隨后使含有與固定化多肽結(jié)合的目標(biāo)抗體的固相與第二標(biāo)記的抗體或與偶聯(lián)劑(例如生物素或抗生物素蛋白)結(jié)合的抗體一起孵育。該第二抗體可以是另一種抗ccr4抗體或另一種抗體?？贵w的標(biāo)記是本領(lǐng)域眾所周知的，包括放射性核素、酶(例如馬來酸脫氫酶、辣根過氧化物酶、葡糖氧化酶、過氧化氫酶)、熒光素(fluors)(異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻藍(lán)蛋白、熒光胺)、生物素等。使標(biāo)記的抗體與固體一起孵育，并測量與固相結(jié)合的標(biāo)記。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可容易地進行這些和其它免疫測定法。

本發(fā)明的抗ccr4抗體和scfv抗體，當(dāng)與可檢測部分連接時，提供用于檢測“癌性組織”或傾向于異常細(xì)胞增殖因此有癌癥風(fēng)險的組織的手段。例如，除由原位瘤變所致變成癌性的組織以外，抗體-可檢測部分綴合物還提供檢測存在于遠(yuǎn)端器官和/或組織中的癌性轉(zhuǎn)移組織的方法。因此這類組織可如下檢測：通過在促使檢出癌性組織中的可檢測部分的合適條件下使疑似癌性組織與抗體-可檢測部分接觸，從而檢測癌性組織的存在。

可檢測部分可與抗體或片段直接綴合或通過使用例如熒光第二抗體間接綴合。直接綴合可通過例如熒光團與抗體或抗體片段的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)偶聯(lián)或通過基因工程完成?？蓸?gòu)建含有與熒光或生物發(fā)光蛋白質(zhì)偶聯(lián)的抗體或抗體片段的嵌合體或融合蛋白。例如，casadei等人描述了制備能夠在哺乳動物細(xì)胞中表達水母發(fā)光蛋白和抗體基因的融合蛋白的載體構(gòu)建體的方法。

關(guān)于探針或抗體的本文所用術(shù)語“標(biāo)記的”旨在包括通過使可檢測物質(zhì)與探針或抗體偶聯(lián)(即物理連接)直接標(biāo)記探針或抗體，以及通過與直接標(biāo)記的另一種試劑反應(yīng)間接標(biāo)記探針或抗體。間接標(biāo)記的實例包括如下檢測第一抗體：使用熒光標(biāo)記的第二抗體和用生物素末端標(biāo)記dna探針使得它可用熒光標(biāo)記的鏈霉抗生物素檢出。術(shù)語“生物樣品”旨在包括自受試者分離的組織、細(xì)胞和生物流體(例如活檢樣品)，以及存在于受試者內(nèi)的組織、細(xì)胞和流體。也就是說，本發(fā)明的檢測方法可用來體外以及體內(nèi)檢測生物樣品的癌癥、癌細(xì)胞或癌癥相關(guān)細(xì)胞(例如與腫瘤或癌細(xì)胞有關(guān)的基質(zhì)細(xì)胞)。例如，用于檢測ccr4的體外技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測定法(elisa)、蛋白質(zhì)印跡法、免疫沉淀法和免疫熒光法。此外，用于檢測ccr4的體內(nèi)技術(shù)包括將標(biāo)記的抗ccr4抗體引入受試者中。例如，抗體可用放射性標(biāo)記進行標(biāo)記，所述放射性標(biāo)記在受試者中的存在和位置可通過標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)檢測。在實施方案中，本發(fā)明提供檢測受試者的腫瘤或癌細(xì)胞的非侵入性方法。給予受試者本發(fā)明的抗體或scfv抗體，其中抗體與可檢測部分(即通過例如熒光、化學(xué)、化學(xué)發(fā)光、放射性或本領(lǐng)域已知的其它手段能夠檢出的任何部分)連接，允許抗體定位于腫瘤，然后通過觀察可檢測部分檢出。

在“靶向”綴合物的情況下，也就是說含有打靶部分(經(jīng)設(shè)計使綴合物定位于受試者或動物內(nèi)的一個或多個具體部位的分子或特征)的綴合物的情況下，定位是指當(dāng)在受試者內(nèi)在結(jié)合的“被定位”實體和未結(jié)合的“游離”實體之間基本上達到平衡時的狀態(tài)。達到所述平衡時的速率取決于給藥途徑。例如，通過靜脈內(nèi)注射給予以定位于血栓的綴合物可在注射的幾分鐘內(nèi)在血栓處定位或蓄積。另一方面，通過口服給予以定位于腸中的感染的綴合物可能花幾小時達到定位?；蛘撸ㄎ豢赡苤皇侵冈诮o予實體后的選定時間受試者或動物內(nèi)該實體的位置。再舉例來說，在給予后當(dāng)某一部分得以分布時，定位得以實現(xiàn)。

在所有上述情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對實現(xiàn)定位的時間進行合理估計。此外，可按照本發(fā)明的方法，例如用光電探測器，通過使可檢測部分(例如發(fā)光綴合物)成像，跟蹤隨時間變化的定位的狀態(tài)。所用的“光電探測器”應(yīng)具有足夠高靈敏度使得能夠在合理的時間內(nèi)使哺乳動物內(nèi)的微光成像，并利用來自該儀器的信號繪制圖像。

在其中可能使用極明亮的發(fā)光部分和/或檢測定位于待成像的受試者或動物表面附近的發(fā)光融合蛋白的情況下，可使用一副“夜視”鏡或標(biāo)準(zhǔn)高靈敏度攝影機，例如siliconintensifiedtube(sit)攝影機(例如來自hammamatsuphotonicsystems,bridgewater,n.j.)。然而，更通常需要更靈敏的光檢測方法。

在極低的光水平下，每單位面積的光子通量變得如此低，使得待成像的景物不再顯得連續(xù)。相反地，使得它由在時間和空間兩者上彼此不同的光子所代表。在臨檢器上觀察時，這類圖像似乎是光閃爍點，每個代表了單個檢出的光子。通過累計數(shù)字圖像處理器中隨時間推移的這些檢出光子，可獲取并繪制圖像。與其中給每個圖像點指派強度值的常規(guī)攝影機形成對比，在光子計數(shù)成像中信號的振幅沒有意義。目的只是檢測信號(光子)的存在并圣信號隨時間推移相對于其位置的出現(xiàn)計數(shù)。

下述至少兩種類型的光電探測器可檢測各個光子并產(chǎn)生可通過圖像處理器分析的信號。與放大光子信號不同，減噪光檢測器(reduced-noisephotodetectiondevice)通過降低光子檢測器的本底噪聲達到靈敏度。噪聲主要通過使檢測器陣列冷卻來降低。器件包括稱為“薄背式(backthinned)”冷卻ccd攝影機的電荷耦合器件(ccd)攝影機。在更靈敏的儀器中，冷卻通過例如液氮(其使ccd陣列的溫度達到約-120℃)實現(xiàn)?！氨”呈健笔侵缚s短待檢測的光子跟蹤、從而提高量子效率的光程長度的超薄背板。特別靈敏的薄背式低溫ccd攝影機是可獲自photometrics,ltd.(tucson,ariz.)的“tech512”，系列200攝影機。

“光子放大器”在它們擊中檢測屏前放大光子。這個類別包括帶有增強器(例如微通道增強器(microchannelintensifier))的ccd攝影機。微通道增強器通常含有與攝影機的檢測屏垂直和同延伸的金屬通道陣列。微通道陣列置于待成像的樣品、受試者或動物和攝影機之間。進入陣列的通道中的大多數(shù)光子在離開前接觸通道側(cè)面。施加在陣列上的電壓導(dǎo)致從各光子碰撞中釋放許多電子。來自這類碰撞的電子以“散彈”方式離開其起始通道，并由攝影機檢測。

可通過連續(xù)引入增強性微通道陣列，使得在第一階段產(chǎn)生的電子進而引起第二階段的電子的放大信號，達到甚至更大的靈敏度。然而，靈敏度的增加在損失空間分辨率的情況下達到，所述空間分辨率隨每個額外的放大階段而降低。示例性基于微通道增強器的單光子檢測器是可獲自hamamatsu的c2400系列。

圖像處理器處理由光電探測器產(chǎn)生的信號，所述光電探測器對光子計數(shù)以繪制例如可在監(jiān)視器上顯示或在圖像打印機上打印的圖像。這類圖像處理器通常作為包括上述靈敏的光子計數(shù)攝影機的系統(tǒng)的一部分出售，因此可獲自相同來源。圖像處理器常常與個人計算機(例如ibm兼容性pc或applemacintosh(applecomputer,cupertino,calif.))連接，所述計算機可作為購買的成像系統(tǒng)的一部分包括或不包括在內(nèi)。一旦圖像為數(shù)字化文件的形式，它們便可通過各種圖像處理程序(例如“adobephotoshop”、adobesystems、adobesystems,mt.view,calif.)操作并打印。

在一個實施方案中，生物樣品含有來自試驗受試者的蛋白質(zhì)分子。一種優(yōu)選的生物樣品是通過常規(guī)方法從受試者中分離的外周血白細(xì)胞樣品。

本發(fā)明還包括用于檢測生物樣品中ccr4或表達ccr4的細(xì)胞的存在的試劑盒。例如，試劑盒可包含：能夠檢測生物樣品中的癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記的化合物或作用劑(例如抗ccr4scfv或單克隆抗體)；用于測定樣品中的ccr4的量的工具；和用于將樣品中的ccr4的量與標(biāo)準(zhǔn)物進行比較的工具。在一些實施方案中，標(biāo)準(zhǔn)物是非癌細(xì)胞或其細(xì)胞提取物。可將化合物或作用劑包括在合適的容器中。試劑盒另可包括使用試劑盒檢測樣品中的癌癥的使用說明。

雙特異性抗體

雙特異性抗體(bsab)是包含2個可變結(jié)構(gòu)域或scfv單元的抗體，使得所得抗體識別2種不同的抗原。本發(fā)明提供識別ccr4和第二抗原的雙特異性抗體。示例性第二抗原包括腫瘤相關(guān)抗原、細(xì)胞因子和細(xì)胞表面受體。在一些實施方案中，第二抗原可以是caix(碳酸酐酶ix或g250)、pd-l1、il21、il21r、hvem、cd160、tim3或gal9。

本發(fā)明的雙特異性抗體包括重鏈和輕鏈組合或本文公開的ccr4-igg4抗體的scfv。

本發(fā)明的雙特異性抗體可采用本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建。在一些實施方案中，雙特異性抗體是單一多肽，其中各識別不同抗原的2個不同的重鏈-輕鏈異二聚體或2個不同的scfv抗體或其片段通過足夠長度的接頭多肽連接，以允許2個scfv分子間的分子內(nèi)締合以形成具有2條重鏈和2條輕鏈的雙特異性抗體。在一個實施方案中，scfv分子之一識別ccr4，例如本文所述scfv抗體的任一種。在其它實施方案中，雙特異性抗體由通過共價或非共價鍵連接的一個以上多肽(例如2個單獨的scfv抗體或其片段)組成，其中scfv抗體之一識別ccr4。

在一個實施方案中，雙特異性抗體采用“孔中結(jié)(knobintohole)”方法構(gòu)建(ridgway等,proteineng7:617-621(1996))。在該方法中，使2個不同的可變結(jié)構(gòu)域的ig重鏈還原以選擇性的斷開重鏈配對同時保留重鏈-輕鏈配對。將識別2個不同的抗原的2個重鏈-輕鏈異二聚體混合以促進異質(zhì)連接配對，這通過工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域的“孔中結(jié)”介導(dǎo)。

在另一個實施方案中，可通過來自兩個或更多個不同抗體的重鏈-輕鏈異二聚體交換產(chǎn)生其中第一重鏈-輕鏈異二聚體識別ccr4和第二重鏈-輕鏈異二聚體識別第二抗原的雜合抗體，來構(gòu)建雙特異性抗體。用于產(chǎn)生由2個來自2種不同抗體的重鏈-輕鏈異二聚體組成的雙特異性抗體的機制類似于人igg4的形成，其還起雙特異性分子的作用。igg重鏈的二聚化受分子內(nèi)力的驅(qū)動，例如使各重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域和二硫橋配對。ch3結(jié)構(gòu)域中特定氨基酸的存在(r409)顯示促進二聚體交換和igg4分子的構(gòu)建。抗體鉸鏈區(qū)中的重鏈間二硫橋還進一步穩(wěn)定重鏈配對。具體地說，在igg4中，鉸鏈區(qū)在氨基酸226-230含有氨基酸序列cys-pro-ser-cys(與含有序列cys-pro-pro-cys的穩(wěn)定的igg1鉸鏈區(qū)相比)。229位處絲氨酸的這種序列差異與igg4在鉸鏈區(qū)中形成新的鏈內(nèi)二硫鍵的趨勢有關(guān)(vanderneutkolfschoten,m.等,2007,science317:1554-1557和labrijn,a.f.等,2011,journalofimmunol187:3238-3246)。

在另一個實施方案中，谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫化物的使用可用于從2種截然不同的完全抗體產(chǎn)生雙特異性抗體。例如，使其各識別不同抗原的完全抗體與還原谷胱甘肽一起孵育以將抗體分成重鏈-輕鏈異二聚體或分子?？蓪⒅劓?輕鏈異二聚體與氧化谷胱甘肽(gssg)混合，這允許重新裝配和再次氧化以形成高純的雙特異性抗體。

因此，本發(fā)明的雙特異性抗體可如下產(chǎn)生：通過將r409殘基引入ch3結(jié)構(gòu)域并將cys-pro-ser-cys序列引入識別ccr4或第二抗原的抗體的鉸鏈區(qū)，使得重鏈-輕鏈二聚體交換以產(chǎn)生識別ccr4的1個重鏈-輕鏈二聚體和識別第二抗原的第二重鏈-輕鏈二聚體的抗體分子，其中第二抗原是本文公開的任何抗原。還可加入還原劑(例如還原谷胱甘肽)促進交換，來提高重鏈-輕鏈異二聚體交換。如本文所公開的，還可改變已知的igg4分子，使得重鏈和輕鏈識別ccr4或第二抗原。由于其中fc區(qū)不同于其它igg亞型的igg4分子的固有特征所致(因為它與例如由某些白細(xì)胞表達的補體和fc受體等免疫應(yīng)答的效應(yīng)器系統(tǒng)相互作用不佳)，構(gòu)建本發(fā)明的雙特異性抗體的該方法的應(yīng)用可能是有益的。這種特殊性質(zhì)使這些基于igg4的雙特異性抗體對治療應(yīng)用有吸引力，其中需要抗體結(jié)合靶標(biāo)，并且在功能上改變與靶標(biāo)有關(guān)的信號傳導(dǎo)途徑，但不引發(fā)效應(yīng)子活性。

在一些實施方案中，將突變引入bsab的恒定區(qū)，使得bsab的依賴抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc)活性改變。例如，突變是ch2結(jié)構(gòu)域中的lala突變，其中fc區(qū)第234和235位的亮氨酸突變成丙氨酸，且通過fc受體消除結(jié)合。一方面，bsab在異二聚體bsab的一個scfv分子上含有突變，這降低adcc活性。另一方面，bsab在異二聚體bsab的兩條鏈上含有突變，這完全消除adcc活性。例如，bsab的一個或兩個scfv分子引入的突變是ch2結(jié)構(gòu)域的lala突變?？墒咕哂锌勺兊腶dcc活性的這些bsab優(yōu)化，使得bsab顯示針對表達被bsab識別的一種抗原的細(xì)胞的最大選擇性殺滅，然而顯示針對被bsab識別的第二抗原的最小殺滅。

本發(fā)明提供識別ccr和第二抗原的雙特異性抗體。在一個實施方案中，第二抗原是pd-l1。在另一個實施方案中，第二抗原是caix。在其它實施方案中，第二抗原是ca-ix、pd-l1、il21、il21r、hvem、cd160、tim3、gitr、lag3或gal9。

本文公開的雙特異性抗體可用于治療疾病或醫(yī)學(xué)病況，例如癌癥。癌癥是例如實體癌，例如腎細(xì)胞癌、乳腺癌或前列腺癌。在其它實施方案中，癌癥是其中當(dāng)與未患癌癥的組織或受試者相比時caix、pd-l1或hvem過量表達的癌癥。本發(fā)明的雙特異性抗體可用于治療、預(yù)防或減輕癌癥的癥狀。

本發(fā)明的雙特異性抗體可用于增加t細(xì)胞增殖，其中t細(xì)胞是調(diào)節(jié)t細(xì)胞。本發(fā)明的雙特異性抗體對于提高或加強t細(xì)胞應(yīng)答(例如抗原特異性t細(xì)胞應(yīng)答)可能是特別有用的。本發(fā)明的雙特異性抗體還可用于逆轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)效應(yīng)t細(xì)胞增殖的t細(xì)胞介導(dǎo)的抑制。

融合蛋白

本發(fā)明提供含有與第二蛋白質(zhì)有效連接的本文公開的ccr4-igg4抗體或其功能片段的融合蛋白。第二蛋白質(zhì)可為例如細(xì)胞因子或生長因子。在特別優(yōu)選的實施方案中，細(xì)胞因子是il-2或tgf-β。在一些其它實施方案中，第二蛋白質(zhì)可以是治療劑，例如毒素或可檢測部分，例如用于檢測的熒光蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，本發(fā)明的ccr4-igg4抗體可與一種以上其它的蛋白質(zhì)或肽(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10種其它的蛋白質(zhì)或肽序列)有效連接。

在一些實施方案中，本文公開的ccr4-igg4抗體或其功能片段與第二蛋白質(zhì)直接連接。在其它實施方案中，ccr4-igg4抗體或其功能片段通過接頭(例如柔性多肽鏈)與第二蛋白質(zhì)連接。接頭可以是任何長度的任何合適的接頭，但長度可為至少1、2、3、4、5、10、15、20、25或30個氨基酸。在一個實施方案中，接頭是天然存在于宿主的免疫球蛋白分子中的氨基酸序列，使得接頭的存在不導(dǎo)致哺乳動物針對接頭序列的免疫應(yīng)答。包括一種以上的其它蛋白質(zhì)與ccr4-igg4抗體的本發(fā)明融合蛋白可具有連接各個其它蛋白質(zhì)或肽序列的多個接頭序列。

本發(fā)明的融合蛋白可通過技術(shù)人員已知的重組方法構(gòu)建。例如，可使含有編碼本發(fā)明的ccr4-igg4抗體的核酸序列的表達載體與編碼第二蛋白質(zhì)的核酸序列有效連接，并可引入表達系統(tǒng)中以翻譯和產(chǎn)生融合蛋白?；蛘撸绢I(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)容易地利用從頭蛋白質(zhì)合成技術(shù)以產(chǎn)生本文所述融合蛋白。

治療方法

本發(fā)明提供治療有癌癥風(fēng)險(或易患癌癥)的受試者或其它細(xì)胞增殖相關(guān)疾病或病癥的預(yù)防性和治療性方法兩者。這類疾病或病癥包括但不限于例如與ccr4異常表達有關(guān)的那些疾病或病癥。例如，所述方法用于治療、預(yù)防或減輕例如以下血癌的癥狀：皮膚t細(xì)胞淋巴瘤(ctcl)、霉菌肉芽腫病(mf)、原發(fā)性皮膚間變性大細(xì)胞淋巴瘤(皮膚alcl)、塞扎里綜合征(sezarysyndrome)或成人t細(xì)胞白血病/淋巴瘤(atll)?；蛘?，所述方法用于治療、預(yù)防或減輕例如腎細(xì)胞癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、腦癌、肝癌、胰腺癌或胃癌等實體瘤的癥狀。在其它實施方案中，本發(fā)明的抗體，例如本發(fā)明的雙特異性抗體可用于治療特征在于過量表達caix、pd-l1、hvem的腫瘤的癌癥。例如，識別caix和ccr4的雙特異性抗體可用于治療具有過量表達caix的腫瘤的癌癥。例如，識別pd-l1和ccr4的雙特異性抗體可用于治療具有過量表達pd-l1的腫瘤的癌癥。例如，識別hvem和ccr4的雙特異性抗體可用于治療具有過量表達hvem的腫瘤的癌癥。

因此，一方面，本發(fā)明提供通過給予受試者本發(fā)明的單克隆抗體或scfv抗體預(yù)防、治療或減輕受試者癌癥癥狀或細(xì)胞增殖性疾病或病癥的方法。例如，ccr4-igg4抗體可以治療有效量給予。

有癌癥或細(xì)胞增殖相關(guān)疾病或病癥風(fēng)險的受試者包括有癌癥家族史的患者或暴露于已知或疑似致癌物的受試者。預(yù)防藥的給藥可發(fā)生在癌癥顯現(xiàn)之前，使得預(yù)防疾病或延遲其進展。

另一方面，通過使細(xì)胞與本發(fā)明的ccr4抗體接觸抑制腫瘤細(xì)胞生長或降低抑制性t細(xì)胞活性。細(xì)胞是表達ccr4的任何細(xì)胞。例如細(xì)胞是t-細(xì)胞。

本發(fā)明還包括提高或增強對抗原的免疫應(yīng)答的方法。通過給予受試者本發(fā)明的單克隆抗體或scfv抗體，提高或增強免疫應(yīng)答?？乖遣《?例如hiv)、細(xì)菌、真菌或腫瘤抗原。免疫應(yīng)答是天然免疫應(yīng)答。所謂天然免疫應(yīng)答意指是感染的結(jié)果的免疫應(yīng)答。感染是慢性感染。

或者，免疫應(yīng)答是由于接種誘導(dǎo)的應(yīng)答。因此，另一方面，本發(fā)明提供通過給予受試者本發(fā)明的單克隆抗體或scfv抗體和疫苗來提高疫苗效力的方法?？贵w和疫苗序貫或同時給予。疫苗是腫瘤疫苗、細(xì)菌疫苗或病毒疫苗。

例如通過提高抗原特異性t效應(yīng)子功能，加強免疫應(yīng)答。

組合方法

本發(fā)明提供通過給予與ccr4蛋白的相同表位或備選ccr4蛋白的2個不同表位結(jié)合的2種抗體來治療患者的癌癥。此外，通過給予與ccr4結(jié)合的第一抗體和與ccr4以外的蛋白質(zhì)結(jié)合的第二抗體治療癌癥。

此外，本發(fā)明提供與ccr4蛋白結(jié)合的抗體和抗腫瘤劑例如小分子、生長因子、細(xì)胞因子或包括例如肽、肽模擬物、擬肽、多核苷酸、脂質(zhì)衍生的介質(zhì)、小的生物胺、激素、神經(jīng)肽和蛋白酶等生物分子在內(nèi)的其它治療劑的給藥。小分子包括但不限于無機分子和有機小分子。合適的生長因子或細(xì)胞因子包括il-2、gm-csf、il-12和tnf-α。小分子文庫是本領(lǐng)域已知的。(參見lam,anticancerdrugdes.,12:145,1997)。

在下列實施例中將進一步描述本發(fā)明，所述實施例不限制權(quán)利要求書中描述的本發(fā)明的范圍。

實施例

實施例1：通用方法

抗體和流式細(xì)胞術(shù)分析

通過將單鏈可變區(qū)(scfv)與人igg1fc區(qū)符合讀框地克隆至pcdna3.1-鉸鏈載體并且通過將重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈可變區(qū)(vl)克隆至tcae5.3載體，構(gòu)建mab2-3和km2760的igg和scfv-fc形式。對于igg4克隆，免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)γ4的cdna序列來自genbank：bc111019.1，被用來替換tcae5.3中的igg1fc區(qū)，構(gòu)建mab2-3igg4。同樣，還構(gòu)建了igg4的穩(wěn)定形式(參見其它數(shù)據(jù))(參見新的參考文獻)?？贵w在293t或293f細(xì)胞中產(chǎn)生，并通過a蛋白-瓊脂糖凝膠(amersham)親和層析法純化。

趨化性

將treg細(xì)胞接種在37℃下、含或不含mab2-3igg1或mab2-3igg4的transwell-遷移孔(5μm孔隙；corning)中3小時，并從含有來自igrov-1、ovcar-5或ovcar-8細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的底槽中收獲遷移細(xì)胞。通過將遷移treg的數(shù)目除以輸入細(xì)胞的數(shù)目，計算遷移細(xì)胞的百分比。人cd4+t細(xì)胞通過cd4+t細(xì)胞分離試劑盒(miltenyibiotech)分離，并在37℃下與mab2-3igg1或mab2-3igg4一起置于transwell-遷移測定法中3小時，如上在響應(yīng)igrov-1、ovcar-5或ovcar-8細(xì)胞的條件培養(yǎng)基時對遷移細(xì)胞(cd4+cd25高)進行計數(shù)。通過將遷移的cd4+cd25高細(xì)胞的數(shù)目除以具有相當(dāng)cd4+和cd25+水平的輸入細(xì)胞的數(shù)目，計算遷移細(xì)胞的百分比。

依賴抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性測定法

adcc測定法采用ldh釋放測定方法進行。簡單地說，scid/beige小鼠嗜中性粒細(xì)胞、人pbmc或純化的人nk細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞用作效應(yīng)細(xì)胞，mac-1、cf2th-ccr4或cf2th細(xì)胞用作靶細(xì)胞。將靶細(xì)胞以1×10⁴人細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中，然后加入合適濃度的抗體。在1小時孵育后，加入新的效應(yīng)細(xì)胞以達到合適的e/t比例。在37℃下孵育(pbmc持續(xù)4小時，nk細(xì)胞持續(xù)16小時嗜中性粒細(xì)胞持續(xù)6小時)后，通過以300×g離心5分鐘從各孔中回收上清液。上清液采用非放射性細(xì)胞毒性測定試劑盒(promega，wi)測量。使用elisa讀數(shù)器，測定板在490nm處的吸光度。對于51cr釋放測定法，將1×106個mac-1細(xì)胞用100μci(3.7mbq)的na51cr(amershaminternational)在37℃下標(biāo)記1小時，充分洗滌，并用作靶標(biāo)。將51cr標(biāo)記的靶細(xì)胞(5000個/孔)接種到96孔板中。實驗以12.5:1、25:1和50:1的不同的pbmc(效應(yīng)物)與mac-1(靶標(biāo))之比按一式三份進行，在37℃下孵育4小時，然后測定釋放到上清液中的51cr。細(xì)胞毒性通過下式進行：

%細(xì)胞毒性=100×(e–se–st)/(m–st)，其中e是來自與效應(yīng)細(xì)胞和抗體一起孵育的靶細(xì)胞的ldh的實驗釋放，se是來自效應(yīng)細(xì)胞的ldh的自發(fā)釋放，st是來自靶細(xì)胞的ldh的自發(fā)釋放，m是來自與10%triton-x一起孵育的靶細(xì)胞的ldh的最大釋放。

調(diào)節(jié)t細(xì)胞抑制測定法

使用抗cd4和抗cd25抗體(biolegend)，通過facscantoii流式細(xì)胞儀，分選cd4+cd25高和cd4+cd25-t細(xì)胞。在用結(jié)合的抗cd3(0.05μg/ml)和可溶性抗cd28(1μg/ml)抗體(biolegend，ca)包被的圓底96孔板中在含或不含cd4+cd25高treg(2500或1250個細(xì)胞)時培養(yǎng)cd4+cd25-teff(2500個細(xì)胞)。在含或不含c1567igg時將25,000個照射的(300rad)cd3耗減pbmc加入共培養(yǎng)的孔中。使用閃爍計數(shù)器，在第5天通過摻入3h-胸苷，測量t細(xì)胞的增殖。在所有分析中，使teff在treg共培養(yǎng)物中的百分比增殖歸一化至teff在單一teff培養(yǎng)物中的增殖；對于該歸一化，單一teff培養(yǎng)物的增殖被視為100%。對于活化，將板用抗cd3在37℃下包被2小時，并用pbs洗滌兩次。

荷有ccr4+ctcl腫瘤的小鼠模型

在scid/beige小鼠(charlesriver)中建立人類癌癥異種移植物。給6周小鼠背外側(cè)靜脈內(nèi)注射細(xì)胞。在注射24小時后，將小鼠隨機分配到不同的治療組，用3mg/kg的mab2-3igg1或mab2-3igg4和小鼠igg4(一周兩次持續(xù)3周)或5mg/kg的對照scfv-fc、c1567-scfv-fc、h1567-scfv-fc治療，并通過i.p.注射等體積的鹽水(一周兩次持續(xù)4周)。使用數(shù)字測徑器或xenogen成像，一周兩次測量并監(jiān)測小鼠體重和腫瘤大小。應(yīng)用方程式長×(寬)2×0.52，計算腫瘤體積。按照dana-farbercancerinstitute動物管理和使用委員會的準(zhǔn)則進行動物護理。

統(tǒng)計分析

應(yīng)用雙側(cè)未配對斯氏t檢驗分析數(shù)據(jù)。對于所有分析，我們將0.05以下的p值視為顯著。所有值表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差(s.d)。

應(yīng)用graphpadprism5(graphpadsoftware,inc.,lajolla,ca)，應(yīng)用雙因素anova與bonferroni事后檢驗和未配對雙尾t檢驗進行統(tǒng)計分析。小于0.05的p值被視為在統(tǒng)計上顯著的。

體外依賴抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性測定法

按照生產(chǎn)商規(guī)定的cytotox96非放射性細(xì)胞毒性測定程序(promega，madison，wi)，采用乳酸脫氫酶(ldh)釋放測定方法進行adcc。自scid-beige小鼠純化的小鼠嗜中性粒細(xì)胞或來自pbmc的純化的人nk細(xì)胞用作效應(yīng)細(xì)胞，ccr4+mac1腫瘤細(xì)胞用作靶細(xì)胞。簡單地說，將純化的scid-beige小鼠嗜中性粒細(xì)胞或nk細(xì)胞以1x10⁴個細(xì)胞/孔的密度接種在存在h1567或11a微型抗體(minibodies)的圓底96孔板中。在孵育1小時后，以80:1(小鼠嗜中性粒細(xì)胞)或2:1(人nk細(xì)胞)的效應(yīng)細(xì)胞-靶細(xì)胞比(e:t)加入新鮮制備的效應(yīng)細(xì)胞。在37℃下孵育2小時后，通過以300xg離心5分鐘取出各孔的上清液。通過測量490nm波長下的吸光度，測定上清液的ldh活性。按照下式計算細(xì)胞毒性(%)：

%細(xì)胞毒性=100×(e–se–st)/(m–st)，其中e是由效應(yīng)物-靶標(biāo)共培養(yǎng)物引起的ldh釋放，se是來自效應(yīng)細(xì)胞ldh的自發(fā)釋放，st是來自靶細(xì)胞ldh的自發(fā)釋放，m是來自用裂解溶液(10%triton-x)孵育的靶細(xì)胞的ldh的最大釋放。所有測量以一式三份進行。

實施例2：由cll2介導(dǎo)的體外treg化學(xué)吸引以劑量依賴性方式被mab2-3igg4抑制

通過facs針對ccr4配體ccl22的表達,測定卵巢癌細(xì)胞系igrov-1、ovcar-5和ovcar-8。所有卵巢癌細(xì)胞系具有可觀的ccl22表達水平，ovcar-8除外。將來自3個癌細(xì)胞系每個的細(xì)胞培養(yǎng)上清液用于化學(xué)吸引測定法。具體地說，進行了transwell測定法以評價cd4+/cd25+treg細(xì)胞至含有來自3個卵巢癌細(xì)胞系之一的上清液的transwell底槽的遷移。在具有卵巢癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基的transwell中孵育的treg引起細(xì)胞100%遷移至底槽。相比之下，其中底槽含有新鮮培養(yǎng)基的transwell測定引起treg小于40%遷移至底槽。當(dāng)?shù)撞酆衼碜詉grov-1細(xì)胞或ovcar-5細(xì)胞的上清液時，添加mab2-3igg1或mab2-3igg4任一個引起treg至底槽的遷移顯著減少。(參見圖1a-b)。

mab2-3igg4劑量對抑制人淋巴細(xì)胞遷移至含有ccl22豐富培養(yǎng)基transwell底槽的能力的作用表明，0.8μg/ml引起人淋巴細(xì)胞至底槽的遷移減少大于50%，而加入20μg/ml引起transwell的遷移幾乎完全抑制。(參見圖3b)。

實施例3：由cll2介導(dǎo)的體內(nèi)treg化學(xué)吸引被mab2-3igg4抑制

將ingrov-1細(xì)胞靜脈內(nèi)注射至無免疫應(yīng)答的小鼠背外側(cè)，接著生長一段時間。小鼠隨后接受用螢光素酶標(biāo)記的treg細(xì)胞(cd4+/cd25+/cd127dim/-)的尾靜脈注射。這些小鼠然后用3mg/kgmab2-3igg1、3mg/kgmab2-3igg4或等體積的pbs作為對照治療，以評價標(biāo)記的treg至腫瘤部位的遷移。體內(nèi)生物發(fā)光測定法表明，在給予mab2-3igg1或mab2-3igg4后，treg至腫瘤區(qū)域的遷移減少。(參見圖2)。

實施例4：mab2-3igg4不引起淋巴細(xì)胞耗減

人外周血單核細(xì)胞(pbmc)通過尾靜脈給無免疫應(yīng)答的小鼠注射，并允許摻入循環(huán)中。隨后給予小鼠mab2-3igg1或mab2-3igg4，接著24小時休息時間后分析pbmc。收集血液，通過facs分析評價人來源的treg的量。數(shù)據(jù)表明，與給予pbs對照后所觀察到的相比，在給予mab2-3igg1后，treg的量顯著降低。相比之下，當(dāng)與給予pbs或?qū)φ読gg后所觀察到的量相比時，在給予mab2-3igg4抗體后，treg的量沒有統(tǒng)計上的顯著差異。這些數(shù)據(jù)表明mab2-3igg4不耗減循環(huán)中總的treg量，而mab2-3igg1不引起treg耗減。

在給藥后人來源的pbmc內(nèi)的其它t細(xì)胞群的特征顯示，當(dāng)與給予mab2-3igg1后這些細(xì)胞的量相比時，在給予mab2-3igg4后存在更大量的t-效應(yīng)細(xì)胞和t-幼稚細(xì)胞。(參見圖3)。

總的來說，這些數(shù)據(jù)和實施例3提供的數(shù)據(jù)顯示，mab2-3igg4調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)t細(xì)胞募集而不誘導(dǎo)t淋巴細(xì)胞耗減。

實施例5：在treg細(xì)胞存在下腫瘤致敏t細(xì)胞介導(dǎo)igrov-1細(xì)胞死亡和分泌ifn-γ差異

為了評價腫瘤致敏t細(xì)胞引起的ifn-γ分泌的動力學(xué)，使ingrov-1腫瘤致敏的t細(xì)胞與腫瘤脈沖的樹突細(xì)胞(dc)或未脈沖的dc一起孵育，接著測量培養(yǎng)基中的ifn-γ水平。在與腫瘤脈沖的樹突細(xì)胞(dc)孵育后或與cd3/cd28珠粒共孵育后，igrov-1腫瘤致敏t細(xì)胞保持ifn-γ分泌的高水平。相比之下，與腫瘤致敏t細(xì)胞共孵育的未脈沖的dc引起腫瘤致敏t細(xì)胞較少的ifn-γ分泌。其它實驗的目的在于評價treg細(xì)胞對由腫瘤致敏t細(xì)胞引起的ifn-γ分泌的影響。這些數(shù)據(jù)顯示在與自體或同種異體treg細(xì)胞一起孵育后ifn-γ水平降低。(參見圖4b-c)。

其它體外研究的目的在于評價在自體或同種異體treg細(xì)胞存在下與腫瘤致敏t細(xì)胞一起孵育后igrov-1細(xì)胞死亡的量。數(shù)據(jù)表明，當(dāng)與在treg群不存在時孵育的腫瘤致敏t細(xì)胞相比，在與腫瘤致敏t細(xì)胞和自體或同種異體treg細(xì)胞一起孵育后，igrov-1細(xì)胞死亡的量降低。(參見圖4d)。

實施例6：在給予mab2-3igg4后體內(nèi)腫瘤大小的縮小

無免疫應(yīng)答的小鼠接受5x10⁶個igrov-1腫瘤細(xì)胞，允許腫瘤生長直到這些腫瘤達到50mm³的平均值。隨后，通過尾靜脈注射1x10⁷igrov-1致敏t細(xì)胞、1x10⁶個treg細(xì)胞和1mg/kgmab2-3igg1、1mg/kgmab2-3igg4、對照igg4或pbs。給予抗體每周兩次共35天。這些實驗的數(shù)據(jù)顯示與對照igg4和pbs相比，加入mab2-3igg1或mab2-3igg4引起腫瘤大小顯著縮小。(參見圖5a-b)。

實施例7：抗ccr4抗體對teff的增殖和treg的抑制功能的消除

使人pbmc或cd4+t細(xì)胞以與treg為10:1比例與20μg/ml對照igg1、mab2-3igg1或mab2-3igg4一起孵育。通過流式細(xì)胞術(shù)、蛋白質(zhì)印跡和染色，檢測人pbmc的增殖和來自cd4+t細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。這些數(shù)據(jù)顯示，加入mab2-3igg1或mab2-3igg4引起treg活性抑制對人pbmc的抑制，降低sa-β-gal和p-p38表達，并且恢復(fù)cd27和cd28的表達，這提供共刺激信號，且是淋巴細(xì)胞活化所需要的。

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其它實施方案

雖然結(jié)合其詳細(xì)說明描述了本發(fā)明，但上述描述只是說明，并不限制本發(fā)明的范圍，其由隨附權(quán)利要求書的范圍限定。其它方法、優(yōu)勢和改動在隨附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。