本發(fā)明涉及(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)，也稱作經(jīng)改良的MAT(iMAT)分子，其包含至少一個(gè)移位模塊、至少一個(gè)靶向模塊及至少一個(gè)抗原模塊，其中至少一個(gè)半胱胺酸殘基經(jīng)不同的氨基酸殘基取代。此類iMAT分子可以通過(guò)大大的減少的制造努力來(lái)生產(chǎn)，并且具有物種特異性、更安全以及在免疫上非常有效。此類(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)特別適于作為一秒，例如用于治療和/或預(yù)防馬科動(dòng)物的變態(tài)反應(yīng)和/或感染和/或防止感染傳播。

發(fā)明背景

通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞(APC)加工抗原是經(jīng)由兩種不同的途徑發(fā)生。細(xì)胞內(nèi)所產(chǎn)生的抗原經(jīng)細(xì)胞表面上的MHC I(I類主要組織相容性復(fù)合體，I類MHC)分子來(lái)呈遞，而細(xì)胞外抗原是經(jīng)由細(xì)胞表面上的MHC II(II類主要組織相容性復(fù)合體，II類MHC)分子來(lái)呈遞。這兩種機(jī)制都由宿主引發(fā)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答?？乖瓘奈者M(jìn)入細(xì)胞中直至以MHC II-抗原復(fù)合體形式呈遞于細(xì)胞表面上所采用的途徑是通過(guò)各種細(xì)胞器，尤其通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體(Golgi apparatus)、反面高爾基體管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(trans-Golgi network)、溶酶體、內(nèi)涵體及通過(guò)II類MHC隔室(MIIC)繼續(xù)進(jìn)行。MIIC在MHC II介導(dǎo)的抗原呈遞中發(fā)揮重要作用。在細(xì)胞的這些細(xì)胞器中，II類MHC分子負(fù)載了低分子量抗原或蛋白質(zhì)的蛋白水解片段。在此過(guò)程中，在一開(kāi)始時(shí)結(jié)合至MHC II分子的不變鏈(也稱作MHC IIγ鏈或Ii)經(jīng)歷蛋白水解降解，并且抗原在直接或間接結(jié)合MHC II的各種蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)下結(jié)合至MHC II分子。人體中的這些調(diào)節(jié)分具體包括HLA-DM、HLA-DO、LAMP-1、LAMP-2、CD63、CD83等這些蛋白質(zhì)的確切功能部分仍原因不明，但其中有許多具有可促使將其轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體、轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)涵體、轉(zhuǎn)運(yùn)至反面高爾基體管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)運(yùn)至MIIC等的信號(hào)序列。許多蛋白酶為參與蛋白水解處理時(shí)所必需，使得抗原可呈遞于MHC II分子上。存在于MIIC中的蛋白酶具體包括組織蛋白酶家族的各個(gè)成員，諸如(例如)組織蛋白酶S及組織蛋白酶L。在除人之外的物種中，同源的II類MHC分子具有不同的氨基酸序列。在馬科動(dòng)物中，MHC系統(tǒng)的組織類似于具有鄰接I類、III類、及II類區(qū)域的人類(Kelley J等人，Immunogenetics 2005,56:683–695)。

提供用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的模塊化抗原轉(zhuǎn)運(yùn)(MAT)分子、相關(guān)構(gòu)建物、方法及其用途的概念公開(kāi)于WO 2004/035793(美國(guó)等同申請(qǐng)US 2005/0281816)中。此文獻(xiàn)描述了一種三部分分子的有用性，該MAT分子用于引入抗原的表位至細(xì)胞中從而確定要經(jīng)過(guò)該MAT分子調(diào)節(jié)的免疫應(yīng)答。其中，描述了各種移位模塊、標(biāo)靶模塊及抗原模塊。該技術(shù)及其方法使得以下成為可能：首先，可有效地從細(xì)胞外空間將抗原傳送進(jìn)入標(biāo)靶細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)空間中，以及其次使得此類抗原可在到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部中之后有效地到達(dá)細(xì)胞器以便隨后處理用于抗原呈遞。一般而言，兩步法可用于靶向地、有效地調(diào)節(jié)個(gè)體的免疫應(yīng)答。MAT分子的用途公開(kāi)于(例如)Martínez-Gómez JM等人[Allergy 2009,64(1):172-178]；Rose H(Arb Paul Ehrlich Inst Bundesinstitut Impfstoffe Biomed Arzneim Langen Hess,2009,96,319-327)及最近Senti G等人[J Allergy Clin Immunol.,2012,129(5):1290-1296]中?；贛AT技術(shù)，主要貓變應(yīng)原Fel d1被融合至TAT衍生的蛋白質(zhì)移位結(jié)構(gòu)域以及被融合至人截短的不變鏈以靶向II類MHC路徑。在小鼠中評(píng)估了免疫原性，而可能的安全性問(wèn)題則是通過(guò)基于貓毛變態(tài)反應(yīng)患者的嗜鹼細(xì)胞反應(yīng)性的適宜測(cè)試來(lái)進(jìn)行評(píng)估。已證實(shí)此模型化合物的可能用途。其中描述了，預(yù)期MAT分子相較于重組變應(yīng)原或變應(yīng)原萃取物在常規(guī)變應(yīng)原特異性免疫療法(SIT)中可更安全且更有效地誘導(dǎo)期望的免疫應(yīng)答(也即，脫敏作用(hyposensitization))。在Senti G.等人最新公開(kāi)的申請(qǐng)中，描述了針對(duì)人的貓毛變態(tài)反應(yīng)的淋巴內(nèi)免疫療法于三次注射后誘導(dǎo)耐受性。在其中描述使用MAT-Fel d1的人類首次(first-in-human)臨床研究，證實(shí)僅在淋巴內(nèi)注射的三次注射后的安全性及誘導(dǎo)變應(yīng)原耐受性。

其他現(xiàn)有技術(shù)如下：

Gadermaier G等人(Molecular Immunology 2010,47:1292-1298)描述將經(jīng)半胱氨酸穩(wěn)定的Art v1折疊靶向用于艾屬(Artemisia)花粉變態(tài)反應(yīng)的免疫治療。作者使用靶向Art v1翻譯后修飾作用的遺傳工程方法，旨在產(chǎn)生出低致敏性分子：(i)通過(guò)定點(diǎn)誘變破壞防衛(wèi)素結(jié)構(gòu)域的二硫鍵及(ii)在大腸桿菌中表達(dá)的突變體構(gòu)建物以產(chǎn)生出非糖基化蛋白。然而，明顯地，該目標(biāo)僅操縱Art v1防衛(wèi)素結(jié)構(gòu)域的三維折疊以通過(guò)用絲氨酸交換單一半胱氨酸殘基，同時(shí)保持完整(即，未修飾)所識(shí)別的T-細(xì)胞表位(即使其包含半胱氨酸殘基)，來(lái)消除IgE-結(jié)合(換言之，產(chǎn)生出低致敏性分子)。

第3屆Havemeyer馬變應(yīng)性疾病研討會(huì)(3rd Havemeyer workshop on allergenic diseases of the Horse)報(bào)告(Hólar,Iceland,2007年6月，Veterinary Immunology and Immunotherapy 2008,126:351-361)聚焦于昆蟲(chóng)叮咬過(guò)敏(IBH)及復(fù)發(fā)性氣管阻塞(RAO)的免疫學(xué)及遺傳方面。在此研討會(huì)上，討論了新穎的對(duì)抗IBH的SIT方法，尤其論述具有偶合至模塊化抗原移位(MAT)分子的變應(yīng)原的病毒載體或蛋白質(zhì)疫苗接種的用途。

在2010年及2011年SIAF年度報(bào)告中，Crameri R報(bào)告了MAT技術(shù)在感染IBH的馬的疫苗接種中的用途。

然而，當(dāng)生產(chǎn)及制造現(xiàn)有技術(shù)中所述的MAT分子時(shí)出現(xiàn)了主要問(wèn)題。具體而言，在開(kāi)發(fā)用于根據(jù)優(yōu)良制造規(guī)范(GMP)制造的MAT分子的下游方法(DSP)中所使用的標(biāo)準(zhǔn)方法可能不適用。無(wú)法純化MAT分子的均質(zhì)分子種類，這明顯由于MAT分子的異常物理化學(xué)性質(zhì)。

對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中所述的MAT分子而言，雖然測(cè)試了不同分離原理(例如，大小排阻層析、RP-HPLC)，但是若干純化方法可能不適用(參見(jiàn)本文實(shí)施例5)。用于測(cè)定重組蛋白質(zhì)純度的方法一般包括層析分離(例如，RP-HPLC)及電泳分離(例如，毛細(xì)管區(qū)帶電泳、等電聚焦、還原或非還原條件下的SDS-PAGE)。另外，這些分析方法不能應(yīng)用于未有分子特異性調(diào)適的MAT分子。為了評(píng)估純度，必須開(kāi)發(fā)一種經(jīng)調(diào)適的特異性SDS-PAGE測(cè)試程序。此測(cè)試程序包括利用還原劑及十二烷基硫酸鋰(LDS)并加熱至75℃的樣品生產(chǎn)，在電泳分離后獲得多個(gè)可再現(xiàn)明顯譜帶。以考馬斯藍(lán)(Coomassie blue)染料染色導(dǎo)致凝膠的線性定量行為(密度測(cè)定法)。使用容許檢測(cè)MAT分子中之變應(yīng)原模塊的單株抗體，展現(xiàn)一條主要譜帶及若干次要譜帶。所有譜帶也在使第二凝膠重新負(fù)載第一凝膠的切除譜帶后可再現(xiàn)地遷移至原始凝膠的相同位置。出乎意料地，在所有這些具有較低及較高表觀分子量的譜帶中，通過(guò)從凝膠中切除譜帶，胰蛋白酶消化并隨后通過(guò)質(zhì)譜(nanoLC/ESI-MS-MS)對(duì)其進(jìn)行分析，來(lái)識(shí)別全長(zhǎng)MAT分子?？蓮拇祟悓?shí)驗(yàn)得出在SDS-PAGE中MAT分子的不同折疊變化的異常行為(“凝膠遷移”)的結(jié)論。另外，在所有批次的MAT分子中，可檢測(cè)到蛋白質(zhì)的多聚體形式，其難以與單體形式分離。

就例如經(jīng)濟(jì)觀點(diǎn)以及就監(jiān)管要求而言，必需改良(i)MAT分子的制造方法及(ii)其用于純度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)分析方法的適合性。另外，就調(diào)適MAT分子適于特異性標(biāo)靶物種(如馬)而言，需要調(diào)適在MAT技術(shù)中的免疫學(xué)靶向。

另外，MAT分子可輕易地用于由已知主要變應(yīng)原誘導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)(例如，由Fel d1引發(fā)的對(duì)貓毛的變態(tài)反應(yīng))中。然而，現(xiàn)有技術(shù)的MAT分子似乎很難用于臨床設(shè)定如變態(tài)反應(yīng)中，其中，例如，已知涉及各種非交叉反應(yīng)性變應(yīng)原，但尚不知曉這些變應(yīng)原在誘導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)時(shí)的重要性(換言之，尚不知曉主要變應(yīng)原)。

本發(fā)明的基本目標(biāo)是提供經(jīng)改良的MAT分子，其可用作醫(yī)藥組合物如疫苗中的活性劑，可克服現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題。

發(fā)明的公開(kāi)

發(fā)明概述

在一個(gè)方面中，本發(fā)明基本目標(biāo)已出乎意料地通過(guò)提供(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)、優(yōu)選經(jīng)改良的MAT(iMAT)分子而得以解決，所述經(jīng)分離重組蛋白質(zhì)包含：

(i)至少一個(gè)第一模塊，其為使得iMAT分子自細(xì)胞外空間移位進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部中的氨基酸序列，

(ii)至少一個(gè)第二模塊，其為使得iMAT分子在細(xì)胞內(nèi)物種特異性地靶向至細(xì)胞器的氨基酸序列，其中所述細(xì)胞器參與加工抗原和/或使MHC分子加載抗原(優(yōu)選系經(jīng)加工的抗原)，及

(iii)至少一個(gè)第三模塊作為抗原模塊，其為衍生自至少一種抗原、優(yōu)選至少一種變應(yīng)原的至少一個(gè)完全或部分表位的氨基酸序列，從而確定由該iMAT分子調(diào)節(jié)的免疫應(yīng)答的特異性，

其特征在于，至少在所述抗原模塊中，至少一個(gè)半胱氨酸殘基經(jīng)不同的氨基酸殘基，優(yōu)選絲氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和/或天冬氨酸取代。

優(yōu)選地，在所述至少一個(gè)抗原模塊中，所有半胱氨酸殘基經(jīng)不同的氨基酸殘基，優(yōu)選絲氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和/或天冬氨酸取代。更優(yōu)選地，在整個(gè)iMAT分子中，所有半胱氨酸殘基經(jīng)不同的氨基酸殘基，優(yōu)選絲氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和/或天冬氨酸取代。

優(yōu)選地，如果不是全部半胱氨酸殘基經(jīng)不同的氨基酸殘基，優(yōu)選絲氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和/或天冬氨酸取代，則在整個(gè)iMAT分子中會(huì)留下偶數(shù)個(gè)半胱氨酸。

優(yōu)選地，所有此類模塊彼此共價(jià)連接，任選通過(guò)所述第一、第二和/或第三模中的兩個(gè)或更多個(gè)(任選所有的)相鄰模塊之間的額外間隔模塊共價(jià)連接。

更優(yōu)選地，所有此類模塊彼此共價(jià)連接，且該第一、第二和/或第三模塊中的兩個(gè)或更多個(gè)相鄰模塊之間根本不存在額外間隔模塊。

在另一方面中，本發(fā)明基本目標(biāo)已出乎意料地通過(guò)提供包含如本文中所公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)的疫苗或免疫原性組合物或醫(yī)藥組合物而得以解決。

在另一方面中，本發(fā)明基本目標(biāo)已出乎意料地通過(guò)提供如本文中所公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)或如本文中所公開(kāi)并要求保護(hù)的疫苗或免疫原性組合物或醫(yī)藥組合物而得以解決，其用于預(yù)防和/或治療馬科動(dòng)物的一或多種變態(tài)反應(yīng)，優(yōu)選昆蟲(chóng)叮咬過(guò)敏(IBH)、蕁麻疹和/或復(fù)發(fā)性氣管阻塞(RAO)的方法中。預(yù)防和/或治療有此需要的馬科動(dòng)物的相應(yīng)方法以及制備用于預(yù)防和/或治療馬科動(dòng)物的醫(yī)藥組合物/藥物的用途也會(huì)屬于本發(fā)明的范疇內(nèi)。

在另一方面中，本發(fā)明基本目標(biāo)已出乎意料地通過(guò)提供如本文中所公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)或如本文中所公開(kāi)并要求保護(hù)的疫苗或免疫原性組合物或醫(yī)藥組合物而得以解決，其用于預(yù)防和/或治療馬科動(dòng)物的一或多種傳染性疾病和/或防止馬科動(dòng)物的一或多種傳染性疾病傳播和/或防止馬科動(dòng)物的一或多種傳染性疾病通過(guò)載體傳播的方法，其中所述通過(guò)載體優(yōu)選是通過(guò)食血蒼蠅、蠓(midge)、壁虱(tick)和/或蚊，更優(yōu)選紅球菌肺炎、腺疫、非洲馬疫、西尼羅河病毒感染、皮癬菌病和/或消化道和/或其他器官的寄生蟲(chóng)和/或隱孢子蟲(chóng)病、蠕蟲(chóng)和/或其潛隱期。預(yù)防和/或治療有此需要的馬科動(dòng)物的相應(yīng)方法以及制備用于預(yù)防和/或治療馬科動(dòng)物的醫(yī)藥組合物/藥物的用途也會(huì)屬于本發(fā)明的范疇內(nèi)。

在另一方面中，本發(fā)明基本目標(biāo)已出乎意料地通過(guò)提供編碼如本文中所公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)的核酸而得以解決。

在另一方面中，本發(fā)明基本目標(biāo)已出乎意料地通過(guò)提供包含至少一種如本文中所公開(kāi)并要求保護(hù)的核酸的載體而得以解決。

在又一方面中，本發(fā)明基本目標(biāo)已出乎意料地通過(guò)提供包含至少一種如本文中所公開(kāi)并要求保護(hù)的核酸和/或至少一種如本文中所公開(kāi)并要求保護(hù)的載體的原代細(xì)胞或細(xì)胞系而得以解決。

出乎意料地，如本文中所公開(kāi)并要求保護(hù)的根據(jù)本發(fā)明的iMAT分子確實(shí)具有使其優(yōu)于相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)MAT分子的物理化學(xué)和/或免疫學(xué)特性：

(i)抗原模塊，優(yōu)選整個(gè)iMAT分子中至少一個(gè)半胱氨酸殘基，優(yōu)選所有半胱氨酸經(jīng)不同的氨基酸殘基取代，其經(jīng)計(jì)算機(jī)模擬方式選擇為不損失最終iMAT分子的穩(wěn)定性，使得根據(jù)本發(fā)明的iMAT分子出乎意料地適合應(yīng)用用于生物醫(yī)藥的標(biāo)準(zhǔn)純化程序及標(biāo)準(zhǔn)分析方法。

(ii)iMAT分子的模塊(即第一移位模塊、第二靶向模塊及第三抗原模塊)的優(yōu)選直接共價(jià)連接，而無(wú)任何額外間隔模塊介于此類模塊之間，即，根本無(wú)其他間隔模塊介于該第一、第二和/或第三模塊的兩個(gè)或更多個(gè)相鄰模塊之間，除了上述(i)外還造成根據(jù)本發(fā)明的iMAT分子的優(yōu)異特性：這些被認(rèn)為是三維結(jié)構(gòu)更剛性且因此無(wú)法形成構(gòu)象IgE表位的iMAT分子甚至更具低致敏性，如本文實(shí)施例2所顯示，實(shí)質(zhì)上沒(méi)有檢測(cè)到變態(tài)反應(yīng)性。

(iii)(準(zhǔn))N-端His-標(biāo)簽的優(yōu)選存在導(dǎo)致，根據(jù)本發(fā)明的iMAT分子可用作用于監(jiān)測(cè)免疫性和/或免疫性持續(xù)時(shí)間的替代物標(biāo)記，這是因?yàn)樵摌?biāo)簽?zāi)K任選連同一或多個(gè)來(lái)自移位模塊的相鄰氨基酸殘基一起可用于誘導(dǎo)目標(biāo)個(gè)體的對(duì)iMAT分子一般結(jié)構(gòu)具特異性的特異性免疫上可檢測(cè)信號(hào)(例如抗體)(參見(jiàn)本文實(shí)施例1)。另外，該標(biāo)簽?zāi)K的存在可用于分離包含根據(jù)本發(fā)明的iMAT分子的樣品中的蛋白質(zhì)，例如，使用載鋅或載鈷的固體支持物，且因此進(jìn)一步增加制造本發(fā)明的iMAT分子而在純化制程期間無(wú)聚積的可能性。

(iv)根據(jù)本發(fā)明的iMAT分子中的至少一個(gè)靶向模塊優(yōu)選具物種特異性，即，就此類iMAT分子對(duì)馬科動(dòng)物的預(yù)期應(yīng)用而言，選擇馬科動(dòng)物靶向模塊，例如，馬科動(dòng)物不變鏈。通過(guò)該物種特異性靶向，可成功地達(dá)成本發(fā)明iMAT分子對(duì)II類MHC分子的最佳化結(jié)合特性。

(v)根據(jù)本發(fā)明的iMAT分子中的至少一個(gè)抗原模塊優(yōu)選為變應(yīng)原。其可衍生自霉菌(真菌和/或其孢子)、花粉、室內(nèi)塵?；蝻暳向?和/或其糞便)，優(yōu)選來(lái)自樹(shù)、草、草本、豚草的花粉和/或十字花科花粉和/或曲霉菌屬(aspergillus)、鏈格孢菌屬(alternaria)、灰霉菌屬(botrytis)、尾孢菌屬(cercospora)、枝孢菌屬(cladosporium)、彎孢菌屬(curvularia)、內(nèi)臍蠕孢菌屬(drechslera)、散囊菌屬(eurotium)、麥類胡麻葉枯病菌屬(helminthosporium)、附球孢菌屬(epicoccum)、白粉菌屬(erysiphe)/粉孢菌屬(oidium)、鐮孢菌屬(fusarium)、橫梗霉屬(lichtheimia)、黑孢菌屬(nigrospora)、青霉菌屬(penicillium)、黑團(tuán)孢菌屬(periconia)、霜霉菌屬(peronospora)、浪梗霉菌屬(polythrincium)、糖多孢菌屬(saccharopolyspora)(此前也稱作干草菌屬(faenia)或小多孢菌屬(micropolyspora))、高溫放線菌屬(thermoactinomyces)、匍柄霉菌屬(stemphylium)、圓酵母屬(torula)的真菌和/或其孢子和/或粉螨屬(acarus)、糖螨屬(glycophagus)、食酪螨屬(tyrophagus)、塵螨屬(dermatophagoides)的螨(和/或其糞便)。本發(fā)明iMAT分子中的至少一個(gè)抗原模塊更優(yōu)選為庫(kù)蠓(culicoides)變應(yīng)原。依照以下標(biāo)準(zhǔn)來(lái)選擇變應(yīng)原：在尚不知曉誘導(dǎo)個(gè)體變態(tài)反應(yīng)的主要變應(yīng)原時(shí)，可通過(guò)本文實(shí)施例6及7中示例性地且詳細(xì)描述的生物信息方法來(lái)選擇本發(fā)明iMAT分子中的至少一個(gè)抗原模塊。依此方式可獲得特別適用作例如用于治療和/或預(yù)防馬科動(dòng)物變態(tài)反應(yīng)的疫苗的經(jīng)改良MAT分子。本發(fā)明iMAT分子中的至少一個(gè)抗原模塊也可以是參與一或多種傳染性疾病的病原體的抗原。其可衍生自紅球菌屬(rhodococcus)、馬鏈球菌屬(streptococcus)、環(huán)狀病毒屬(orbivirus)、黃病毒屬(flavivirus)、毛癬菌屬(trichophyton)、小孢癬菌屬(microsporum)、隱孢子蟲(chóng)屬(cryptosporidium)和/或圓線蟲(chóng)屬(strongylus)。本發(fā)明iMAT分子中的至少一個(gè)抗原模塊也可以是參與一或多種傳染性疾病傳播的載體的抗原，例如，庫(kù)蠓屬、庫(kù)蚊屬和/或硬蜱屬的唾液組分。依此方式可獲得特別適用作例如用于治療和/或預(yù)防馬科動(dòng)物傳染性疾病和/或防止馬科動(dòng)物傳染性疾病傳播的疫苗的經(jīng)改良MAT分子。

具體而言，本發(fā)明提供展現(xiàn)經(jīng)改良溶解度的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)，其可輕易地應(yīng)用于層析分離技術(shù)且顯示經(jīng)改良的穩(wěn)定性。

此外，根據(jù)本發(fā)明的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)優(yōu)選呈遞在誘導(dǎo)期望的免疫學(xué)效應(yīng)方面的高活性及效力，也即有利地以物種特異性調(diào)節(jié)對(duì)象(優(yōu)選馬科動(dòng)物)的抗變應(yīng)原的免疫應(yīng)答。例如，依此方式，使得治療及減輕感染IBH的馬科動(dòng)物的癥狀變成可行。

發(fā)明詳述

在更詳細(xì)地論述本發(fā)明之實(shí)施方案之前，應(yīng)注意，如本文及所附權(quán)利要求中所用，除非本文清楚地另作指明，否則單數(shù)形式“一”、“一個(gè)”、及“該”包括復(fù)數(shù)指示物。

除非另有定義，否則本文中使用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有如本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所通常了解的含義。除非另有指示或以其他方式為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，否則所有的給定范圍及數(shù)值可改變1至5％，因此，術(shù)語(yǔ)“約”通常從描述及權(quán)利要求省去。雖然類似于或等效于那些如本文所述者的任何方法及材料可用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明，但現(xiàn)將描述優(yōu)選的方法、裝置、及材料。本文中述及的所有公開(kāi)的申請(qǐng)是出于如可結(jié)合本發(fā)明使用的公開(kāi)申請(qǐng)中所報(bào)告般描述并揭示物質(zhì)、賦形劑、載劑、及方法的目的而援引加入本文中。本文任何內(nèi)容均不應(yīng)被解釋為承認(rèn)本發(fā)明無(wú)權(quán)先于藉助在線發(fā)明的這些揭示內(nèi)容。

術(shù)語(yǔ)“經(jīng)分離重組蛋白質(zhì)”、“重組蛋白質(zhì)”和/或“經(jīng)改良MAT(iMAT)分子”可在本發(fā)明過(guò)程中互換使用。其均具有相同含義。

在本發(fā)明過(guò)程中，術(shù)語(yǔ)“模塊”指具體的氨基酸序列，例如多肽的一部分、單元或部分，通常是具有所定義功能的短氨基酸/肽序列。

本文中術(shù)語(yǔ)“第一模塊，其為使得(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)，優(yōu)選經(jīng)改良MAT(iMAT)分子從細(xì)胞外空間移位進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部中的氨基酸序列”也可互換地稱作“移位模塊”或“移位序列”，在本發(fā)明過(guò)程中是指促使貨物分子(cargo molecule)例如氨基酸序列、肽、多肽、蛋白質(zhì)及其他類別物質(zhì)如核酸或醫(yī)藥活性成分(API)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞，具體而言真核細(xì)胞，更具體而言如文獻(xiàn)中已知的表面上表達(dá)II類MHC分子和/或表面上表達(dá)I類MHC分子的細(xì)胞內(nèi)部中的具體氨基酸序列。

移位模塊的存在，可促使該貨物分子進(jìn)入至此類細(xì)胞中。

適用作移位模塊的氨基酸序列述于現(xiàn)有技術(shù)中。例如，US 7,653,866公開(kāi)了若干有用的移位序列，其包含衍生自單純皰疹病毒的HIV-tat分子或蛋白質(zhì)VP22。促使指定標(biāo)靶分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部中的該原理多數(shù)地述于相關(guān)專利申請(qǐng)及非專利申請(qǐng)文獻(xiàn)中的不同研究中。此外，適宜的移位序列包括同源異型蛋白質(zhì)(homeoprotein)序列、亮氨酸拉鏈序列、富含精氨酸和/或富含賴氨酸的序列、及(不管缺乏分泌信號(hào)序列)分泌的蛋白質(zhì)或多肽的各種其他序列。特別有用的是病毒肽序列，例如蛋白質(zhì)HIV轉(zhuǎn)錄活化蛋白(HIV tat)。已在現(xiàn)有技術(shù)中描述Tat序列或Tat肽(包括各種不同修改)?，F(xiàn)有技術(shù)中所述的Tat的肽序列的所有變型一般適用作移位模塊。其他實(shí)例包括VP22肽及衍生自果蠅同源蛋白觸角足蛋白的觸角足蛋白肽。此外，可使用其他同源異型蛋白質(zhì)。適宜同源異型蛋白質(zhì)的各種實(shí)例述于現(xiàn)有技術(shù)中。此外，可使用亮氨酸拉鏈蛋白質(zhì)，例如人cFos-(139-164)、或人cJun-(252-279)。除此之外，富含精氨酸和/或富含賴氨酸的肽適用作包含例如HIV-1rev(34-50)或衍生自病毒或酵母的其他肽之序列的移位模塊。當(dāng)然，富含聚精氨酸和/或富含聚賴氨酸的肽可以合成方式制得。此類富含聚精氨酸和/或富含聚賴氨酸的肽可包含其他氨基酸。適宜的實(shí)例述于相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一個(gè)移位模塊包括(優(yōu)選由)不是由如上所說(shuō)明的完全蛋白質(zhì)序列組成而是由仍舊具功能性(即，可有效地促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入)的最小序列組成的氨基酸序列(組成)。適宜的最小序列為(例如)根據(jù)SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一個(gè)移位模塊包括(優(yōu)選由)HIV-tat、VP22和/或觸角足蛋白或其部分序列(組成)，限制條件為該至少一個(gè)移位模塊作用為用于從細(xì)胞外空間移位進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部中的模塊。

本文中術(shù)語(yǔ)“第二模塊，其為使得(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)，優(yōu)選經(jīng)改良MAT(iMAT)分子在細(xì)胞內(nèi)物種特異性靶向參與加工抗原和/或使MHC分子加載抗原，優(yōu)選經(jīng)處理之抗原的細(xì)胞器的氨基酸序列”也可互換地稱作“靶向模塊”或“靶向序列”，在本發(fā)明過(guò)程中，是指容許/促進(jìn)將本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至此類參與加工抗原和/或使MHC分子加載抗原的細(xì)胞器的具體氨基酸序列。

具體而言，此類細(xì)胞器包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、反面高爾基體管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、溶酶體、內(nèi)涵體及MHC II隔室。這些細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器參與諸如(例如)轉(zhuǎn)運(yùn)和/或處理抗原、制造和/或使MHC II分子加載抗原或經(jīng)加工的抗原、和/或轉(zhuǎn)運(yùn)加載此類抗原的MHC II分子至細(xì)胞表面的過(guò)程。

相關(guān)技術(shù)中已知多種序列。有用的靶向序列的突出實(shí)例包括II類MHC分子的不變鏈，也稱作Ii不變鏈或MHC IIγ鏈。不變鏈的各種變體述于專利申請(qǐng)及非專利申請(qǐng)文獻(xiàn)中。

在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，不變鏈選自應(yīng)當(dāng)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的物種和/或選自應(yīng)當(dāng)細(xì)胞內(nèi)靶向iMAT分子的物種。

例如，就馬科動(dòng)物如馬而言，所選的優(yōu)選不變鏈為馬科動(dòng)物不變鏈，包括(優(yōu)選由)SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其片段(組成)，限制條件為此類片段維持其細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)功能。優(yōu)選的此類片段為根據(jù)SEQ ID NO：15和/或16的氨基酸序列。

靶向序列的其他適宜實(shí)例包括溶酶體膜蛋白，其包含適用作靶向模塊的序列。即，許多膜蛋白產(chǎn)生于溶酶體中，其具有容許靶向溶酶體的序列基序。蛋白質(zhì)的此類組別尤其包括lamp 1、lamp 2、lamp 3、limp II及l(fā)ap。此外，四跨膜蛋白在現(xiàn)有技術(shù)中已知為靶向模塊。其他蛋白質(zhì)可在顯示靶向性質(zhì)的內(nèi)涵體/溶酶體隔室中發(fā)現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員明了如何據(jù)此確定適宜的靶向序列。

在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)靶向模塊包括(優(yōu)選由)馬科動(dòng)物不變鏈(組成)及優(yōu)選由SEQ ID NO：2、15、16的氨基酸序列中之一或多者組成。

本文中術(shù)語(yǔ)“第三模塊作為抗原模塊，其為衍生自至少一種抗原，優(yōu)選至少一種變應(yīng)原的至少一個(gè)完全或部分表位，從而確定由該(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)，優(yōu)選經(jīng)改良MAT(iMAT)分子調(diào)節(jié)(對(duì)象優(yōu)選馬科動(dòng)物)的免疫應(yīng)答的特異性的氨基酸序列”也可互換地稱作“抗原模塊”或“抗原序列”，在本發(fā)明的過(guò)程中是指容許調(diào)節(jié)對(duì)象，優(yōu)選馬科動(dòng)物的抗表位/抗原的免疫應(yīng)答及確定對(duì)象優(yōu)選馬科動(dòng)物的免疫應(yīng)答的特異性的具體氨基酸序列。

在此背景下，此(類)抗原模塊包括至少一個(gè)經(jīng)不同的氨基酸殘基，優(yōu)選絲氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和/或天冬氨酸取代的半胱氨酸殘基。因此，所述免疫應(yīng)答與暴露于抗原的未經(jīng)改變的氨基酸序列的對(duì)象優(yōu)選馬科動(dòng)物的免疫應(yīng)答相比不同。

在該方法基礎(chǔ)上，不存在與抗原相關(guān)的限制。該方法可(例如)用于活化對(duì)象的針對(duì)病原體的免疫系統(tǒng)，如(例如)針對(duì)病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)、原生動(dòng)物等，即，最常見(jiàn)是用作疫苗。另外，該方法不僅可用于直接針對(duì)此類病原體，而且可用于活化宿主免疫系統(tǒng)以防止涉及病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)、原生動(dòng)物等的載體傳播疾病的傳播。此外，該方法可用于活化抗退化細(xì)胞如(例如)腫瘤細(xì)胞等的免疫系統(tǒng)。然而，該方法另一方面也可用于對(duì)象抗如(例如)衍生自食物、霉菌(真菌和/或其孢子)、花粉、動(dòng)物毛發(fā)、室內(nèi)塵?；蝻暳向?和/或其糞便)、昆蟲(chóng)毒素等的變應(yīng)原的免疫系統(tǒng)的脫敏或用于免疫系統(tǒng)的靶向抑制，例如，假若存在自體免疫應(yīng)答，如(例如)關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕病、糖尿病、SLE(全身性紅斑狼瘡)等，及用于抑制移植排斥反應(yīng)。未具體提及但與過(guò)強(qiáng)或過(guò)弱的免疫應(yīng)答相關(guān)聯(lián)的其他疾病可同樣地經(jīng)本文公開(kāi)并要求保護(hù)的iMAT分子治療。

原則上，可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的所有類型的抗原都可以作為抗原模塊用于本發(fā)明的目的。目前已經(jīng)知曉的抗原及會(huì)在將來(lái)發(fā)現(xiàn)的抗原均適宜。在一些情況中，抗原也可是利用目前相關(guān)技術(shù)中已知的常規(guī)免疫接種方法不會(huì)導(dǎo)致免疫應(yīng)答但在獨(dú)享應(yīng)用本發(fā)明所述的新穎方法時(shí)導(dǎo)致免疫應(yīng)答的那些。另外，術(shù)語(yǔ)抗原涵蓋包含抗原決定簇(也稱作表位)的抗原片段。因此，抗原模塊可為整體分子，例如蛋白質(zhì)，或?yàn)榉肿影辽僖粋€(gè)抗原決定簇或表位的部分，也即其片段，例如肽。所述至少一個(gè)抗原決定簇或表位可引起針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。表位可包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸或肽或可引起免疫應(yīng)答的其他結(jié)構(gòu)(如糖結(jié)構(gòu)、磷酸化氨基酸等)或其組合。抗原可為連續(xù)表位(即，不依賴于構(gòu)象，例如呈(例如)天然及變性蛋白質(zhì)存在)或不連續(xù)表位(即，依賴于構(gòu)象，例如僅呈天然、折疊形式存在，但不以變性蛋白質(zhì)存在)。不僅可使用蛋白質(zhì)及肽，而且可使用糖結(jié)構(gòu)、脂質(zhì)(例如脂多糖)、脂磷壁酸及細(xì)菌膜的其他組分(CD1b與例如糖結(jié)構(gòu)及脂質(zhì)結(jié)合)、核酸(如(例如)包含CpG基元之DNA)、有機(jī)物質(zhì)(如(例如)乳膠或用作用于本發(fā)明目的的抗原的醫(yī)藥活性物質(zhì))?？乖裳苌运锌赡艿纳问剑?例如)人、動(dòng)物、植物、真菌、寄生蟲(chóng)、單細(xì)胞或多細(xì)胞微生物、病毒及其他生命形式?？乖蓮纳锊牧戏蛛x，已制成重組抗原或已通過(guò)合成，例如通過(guò)肽合成制得。以合成方式制得的抗原可為自然生成或非自然生成而是通過(guò)化學(xué)合成獲得的物質(zhì)。非自然生成物質(zhì)(但在一些情況中適用作抗原)的實(shí)例有：例如存在于藥物中的以合成方式制得的物質(zhì)、或具有非自然生成的氨基酸序列的合成肽、或模擬肽(peptidomimetic)等。自然生成或合成或重組抗原可通過(guò)分子生物學(xué)方法、酶方法、化學(xué)方法和/或其他方法修飾以賦予其更有利地用于特定應(yīng)用的性質(zhì)。此類有利的性質(zhì)可以具體是：作為抗原的更高或更低活性、作為抗原的更寬廣或更特異性的作用、在親水性或疏水性溶劑中更優(yōu)選的溶解度、抗原模塊對(duì)細(xì)胞膜、對(duì)細(xì)胞器膜、對(duì)血腦障壁、對(duì)血液-CSF障壁等的更大滲透性、更長(zhǎng)或更短體內(nèi)或體外半衰期、更低或更高毒性、施用呈iMAT分子形式的抗原后體內(nèi)或體外抗原更優(yōu)選的可檢測(cè)性等。另外，可出于本發(fā)明的目的而將多種抗原組合在一個(gè)抗原模塊中。為此，相同抗原可呈多于一個(gè)復(fù)本存在于抗原模塊中，或例如相同抗原的不同變體可在抗原模塊中組合。抗原模塊中抗原(例如抗原1)及其他抗原(例如抗原2)的組合也是可以的。如(例如)呈多于一個(gè)復(fù)本的抗原1及呈單一復(fù)本的抗原2的其他組合也可在抗原模塊中組合等。另外，一或多個(gè)不同和/或一或多個(gè)相同抗原模塊也可存在于一個(gè)iMAT分子中。原則上，衍生自一或多種不同抗原的抗原單一及多重存在的相同或改變復(fù)本所有可能的組合可出于本發(fā)明目的而進(jìn)行組合。

在一優(yōu)選實(shí)施方案中，抗原模塊包含衍生自至少一種抗原的至少一個(gè)完全或部分表位，其中該抗原為變應(yīng)原。至少一個(gè)表位可引起針對(duì)變應(yīng)原的免疫應(yīng)答，由此該表位可包含一種或多于一種可引起免疫應(yīng)答的結(jié)構(gòu)，例如肽。表位可以是變應(yīng)原的連續(xù)表位或不連續(xù)表位。表位優(yōu)選為至少八個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，優(yōu)選為至少十個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，更優(yōu)選為至少13個(gè)氨基酸長(zhǎng)度?？乖K包含至少一個(gè)完全或部分表位，但也可包含兩個(gè)或更多個(gè)可彼此相同或相異的完全或部分表位。另外，抗原模塊可包含鄰接該至少一個(gè)完全或部分表位的額外氨基酸序列。表位可以是自然生成的表位或可以是經(jīng)修飾的表位，在其氨基酸序列中修飾和/或通過(guò)一或多次翻譯后修飾來(lái)修飾。

在一實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)第三抗原模塊包含衍生自參與一或多種傳染性疾病的病原體的至少一種抗原的至少一個(gè)完全或部分表位。其可衍生自紅球菌屬、馬鏈球菌屬、環(huán)狀病毒屬、黃病毒屬、毛癬菌屬、小孢癬菌屬、隱孢子蟲(chóng)屬和/或圓線蟲(chóng)屬。本發(fā)明iMAT分子中的所述至少一種抗原模塊也可以是參與一或多種傳染性疾病的傳播的載體的抗原，例如，蠓、庫(kù)蚊屬和/或硬蜱屬唾液組分。

在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)第三抗原模塊包含衍生自至少一種引起馬科動(dòng)物的一或多種變態(tài)反應(yīng)的變應(yīng)原的之至少一個(gè)完全或部分表位。這可以是至少一種衍生自霉菌(真菌和/或其孢子)、花粉、室內(nèi)塵?；蝻暳向?和/或其糞便)，優(yōu)選來(lái)自樹(shù)、草、草本、豚草之花粉和/或十字花科花粉和/或曲霉菌屬、鏈格孢菌屬、灰霉菌屬、尾孢菌屬、枝孢菌屬、彎孢菌屬、內(nèi)臍蠕孢菌屬、散囊菌屬、麥類胡麻葉枯病菌屬、附球孢菌屬、白粉菌屬/粉孢菌屬、鐮孢菌屬、橫梗霉屬、黑孢菌屬、青霉菌屬、黑團(tuán)孢菌屬、霜霉菌屬、浪梗霉菌屬、糖多孢菌屬(先前也稱作干草菌屬或小多孢菌屬)、高溫放線菌屬、匍柄霉菌屬、圓酵母屬之真菌和/或其孢子和/或粉螨屬、糖螨屬、食酪螨屬、塵螨屬之螨(或其糞便)的變應(yīng)原的至少一個(gè)完全或部分表位。

在一優(yōu)選實(shí)施方案中，即優(yōu)選至少一種衍生自食血昆蟲(chóng)，更優(yōu)選衍生自庫(kù)蠓屬的變應(yīng)原的至少一個(gè)完全或部分表位。

庫(kù)蠓屬變應(yīng)原的實(shí)例顯示于圖1中，識(shí)別物種、變應(yīng)原及uniprot寄存號(hào)(數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)行為UniProt發(fā)行2013_09)。

在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，事實(shí)至少一種抗原為Cul n4、Cul o1、Cul o2、Cul o3、Cul o4和/或Cul o7變應(yīng)原。抗原模塊的優(yōu)選具體序列為根據(jù)SEQ ID NO：3、4、5、6、18、19的氨基酸序列。

在本發(fā)明過(guò)程中的術(shù)語(yǔ)“通過(guò)……調(diào)節(jié)的免疫應(yīng)答”或可互換的“免疫調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答”與“(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)”和/或“iMAT分子”搭配時(shí)是指免疫原性和/或致耐受性免疫應(yīng)答。

在本發(fā)明之過(guò)程中，術(shù)語(yǔ)“變應(yīng)原”是指一類呈天然形式產(chǎn)生出異常顯著免疫應(yīng)答，其中免疫系統(tǒng)消除所有感知威脅，否則將對(duì)對(duì)象無(wú)害的抗原。典型地，此類類型的反應(yīng)導(dǎo)致稱作變態(tài)反應(yīng)的表型?，F(xiàn)有技術(shù)中描述了各種類型的變應(yīng)原，包括食物、藥物、動(dòng)物產(chǎn)品或天然或合成物質(zhì)。優(yōu)選地，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)呈天然形式引起至少五種獨(dú)享，優(yōu)選馬科動(dòng)物的特異性IgE反應(yīng)時(shí)，蛋白質(zhì)被認(rèn)為是變應(yīng)原。為避免疑義，“變應(yīng)原”與“至少一個(gè)包含衍生自至少一種變應(yīng)原的至少一個(gè)完全或部分表位的第三抗原模塊”搭配時(shí)不再必需呈天然形式，此點(diǎn)亦優(yōu)選，換言之，在本發(fā)明過(guò)程中術(shù)語(yǔ)“變應(yīng)原”也具體是指作為如本文所描述并要求保護(hù)的iMAT分子之部分的非天然氨基酸序列，其不引起至少五種個(gè)體優(yōu)選馬科動(dòng)物的特異性IgE反應(yīng)。

本文中術(shù)語(yǔ)“表位”也可以互換地稱作“抗原決定簇”，在本發(fā)明過(guò)程中是指抗原可通過(guò)免疫系統(tǒng)(無(wú)論通過(guò)B-細(xì)胞或T-細(xì)胞)所識(shí)別的部分。表位借助其所結(jié)合的MHC分子呈遞于抗原呈遞細(xì)胞的表面上。

本文中術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”也可以互換地稱作“個(gè)體”和/或“生物體”，在本發(fā)明過(guò)程中，優(yōu)選是指馬科動(dòng)物。

本文中術(shù)語(yǔ)“馬科動(dòng)物(equine)”也可以互換地稱作“馬(horse)”，在本發(fā)明過(guò)程中，包含馬屬(Equus)的任何成員。其包含(例如)任何馬、小型馬和/或驢，分類指示為：野馬(Equus ferus)和/或家馬(Equus caballus)、和/或子種馬(Equus ferus caballus)。馬可為(例如)家養(yǎng)馬。

術(shù)語(yǔ)“肽”及“蛋白質(zhì)”在本發(fā)明過(guò)程中并列用作等效物。肽或蛋白質(zhì)出于本發(fā)明目的意指至少兩個(gè)氨基酸經(jīng)肽鍵的共價(jià)連接。術(shù)語(yǔ)“氨基酸”及術(shù)語(yǔ)“氨基酸殘基”在本申請(qǐng)中用作等效物，即，此兩術(shù)語(yǔ)的含義相同。術(shù)語(yǔ)氨基酸/氨基酸殘基及肽/蛋白質(zhì)在本申請(qǐng)中呈最寬廣可能定義形式進(jìn)行使用。

就此而言，術(shù)語(yǔ)“重組蛋白質(zhì)”是指可通過(guò)遺傳工程及在真核或原核系統(tǒng)中表達(dá)獲得的多肽。此外，該術(shù)語(yǔ)包含通過(guò)人工(例如，固相)合成獲得的多肽。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“不同氨基酸殘基”除非另有指示，否則是指除了半胱氨酸之外的已知氨基酸殘基。例如，該氨基酸殘基可以是自然生成的氨基酸殘基，如絲氨酸或異亮氨酸。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“線性形式”是指根據(jù)本發(fā)明的缺乏二級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。此類蛋白質(zhì)通常假設(shè)為展現(xiàn)隨機(jī)卷取構(gòu)象，其中唯一的固定關(guān)系是由肽鍵將相鄰氨基酸殘基接合。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)系呈單體形式和/或線性形式存在。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“治療”是指施用本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)、和/或相應(yīng)的疫苗和/或免疫原性組合物和/或醫(yī)藥組合物以獲得所需的臨床結(jié)果，包括預(yù)防和/或治療性治療。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“免疫治療”是指(例如)通過(guò)預(yù)防性和/或治療性疫苗接種來(lái)治療性和/或預(yù)防性治療對(duì)象。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“載體”與“一或多種傳染性疾病的傳播”搭配時(shí)是指活生物體，及在本文中可與術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)載體”、“生物學(xué)攜帶者”和/或“疾病攜帶者”如食血蒼蠅、蠓、壁虱和/或蚊互換使用。

另外，可能且優(yōu)選地，本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)另外包含至少一個(gè)標(biāo)簽?zāi)K。即，可能且優(yōu)選地，一或多個(gè)不同和/或相同標(biāo)簽?zāi)K是本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)的部分。標(biāo)簽?zāi)K通常是由至多20個(gè)氨基酸或由非氨基酸組成的官能團(tuán)所組成的短肽，如(例如)生物素或毛地黃毒苷(digoxigenin)。適宜的標(biāo)簽?zāi)K包括熟知且優(yōu)選的包含4至12個(gè)或更多個(gè)組氨酸序列，優(yōu)選直接連續(xù)組氨酸殘基，優(yōu)選5、6或7個(gè)連續(xù)組氨酸殘基的His-標(biāo)簽。其他適宜的標(biāo)簽?zāi)K包括HA-標(biāo)簽、FLAG-標(biāo)簽、GST-標(biāo)簽或Strep-標(biāo)簽。雖然標(biāo)簽可存在于本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)的任何位置，但是在優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)簽?zāi)K存在于(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)的N-端和/或C-端。

標(biāo)簽?zāi)K適用于分離出本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)，及此外可檢測(cè)體外或體內(nèi)此類(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)的存在。另外，可使用任選連同來(lái)自相鄰模塊的一或多個(gè)相鄰氨基酸殘基或間隔開(kāi)不同模塊的接頭一起的標(biāo)簽?zāi)K以引起目標(biāo)對(duì)象中可用作免疫性和/或免疫性持續(xù)時(shí)間的替代標(biāo)記的特異性免疫上可檢測(cè)信號(hào)(例如抗體)。利用本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫治療，引發(fā)目標(biāo)對(duì)象的抗原-特異性，優(yōu)選變應(yīng)原-特異性免疫應(yīng)答，其在暴露于自然存在的抗原(優(yōu)選變應(yīng)原)后可與自然免疫應(yīng)答定性區(qū)別。因此，結(jié)合至抗原模塊的抗體不適用于作為iMAT誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)的效之替代標(biāo)記。該障礙可通過(guò)確定通過(guò)C-端和/或N-端標(biāo)簽?zāi)K(任選連同相鄰氨基酸殘基一起)獲得的獨(dú)特抗原特異性免疫學(xué)信號(hào)來(lái)消除。因此，可相應(yīng)地提供適宜的替代標(biāo)記。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)進(jìn)一步包含至少一個(gè)標(biāo)簽?zāi)K，優(yōu)選至少一個(gè)His-標(biāo)簽，其中該至少一個(gè)標(biāo)簽?zāi)K優(yōu)選存在于(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)的N-端和/或C-端，更優(yōu)選是緊隨一個(gè)甲硫氨酸殘基后面的N-端。

除此之外，本文所公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)的模塊，即，至少一個(gè)移位模塊、至少一個(gè)靶向模塊及至少一個(gè)抗原模塊，可任選由一或多個(gè)位于至少兩個(gè)此類模塊之間的間隔模塊所間隔開(kāi)。

此類間隔模塊可具體而言是肽序列或有機(jī)分子?，F(xiàn)有技術(shù)中已知許多可用于本發(fā)明目的的間隔分子。此外，也可以使用將會(huì)出于本發(fā)明目的而開(kāi)發(fā)或發(fā)現(xiàn)的間隔分子。適宜的間隔模塊可以具體而言是肽間隔物、交聯(lián)劑、天然或合成聚合物(如(例如)核酸)、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烴等。

偶合不但可通過(guò)共價(jià)連接(優(yōu)選)而且可通過(guò)非共價(jià)連接來(lái)進(jìn)行。間隔模塊尤其具有這樣的作用：其使本文所公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)的各個(gè)不同模塊空間上彼此分離使得其對(duì)彼此在其功能性方面無(wú)不良影響。用于本發(fā)明目的的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)的模塊可通過(guò)一或多個(gè)可經(jīng)化學(xué)和/或酶促反應(yīng)例如通過(guò)蛋白酶裂解的間隔模塊來(lái)偶合。因此可視需要使本文所公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)的經(jīng)間隔模塊連接的模塊彼此分離。

然而，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，具體而言，若抗原模塊衍生自至少一種抗原(至少一種變應(yīng)原)的至少一個(gè)完全或部分表位的氨基酸序列，則在所述第一、第二和/或第三模塊的兩個(gè)或更多個(gè)相鄰模塊之間根本不存在任何此類額外間隔模塊，即，不存在額外間隔模塊。

本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)的個(gè)別模塊的任何期望配置一般是可行的。各模塊可一或多次地存在于(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)中。最低要求存在至少一個(gè)移位模塊、至少一個(gè)靶向模塊及至少一個(gè)抗原模塊。額外模塊如標(biāo)簽?zāi)K、間隔模塊等可任選存在但并非必需存在。所有模塊可一或多次地存在于本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)中。假若模塊多于一次地存在，則其可呈相同復(fù)本形式存在，或模塊的不同變型可在各情況中呈單一復(fù)本或呈多于一個(gè)復(fù)本形式存在。相同類別模塊的完全不同的模塊例如His-標(biāo)簽?zāi)K及生物素-標(biāo)簽?zāi)K也可以存在于本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)中。這兩個(gè)模塊在(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)中功能上發(fā)揮相同的作用(標(biāo)簽?zāi)K)，但并非必需在分子結(jié)構(gòu)方面有任何共同之處。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，此類模塊中之一的兩個(gè)或更多個(gè)復(fù)本可存在于本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)中。即，可存在相同或不同抗原模塊的兩個(gè)或更多個(gè)復(fù)本?；蛘?，(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)可包含兩個(gè)不同抗原模塊以調(diào)節(jié)對(duì)象的免疫應(yīng)答。

重組蛋白質(zhì)中的抗原模塊的兩個(gè)或更多個(gè)相同復(fù)本可(例如)對(duì)所述相關(guān)抗原引起增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。兩個(gè)或更多個(gè)不同抗原模塊可(例如)經(jīng)組合在一個(gè)(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)中以同時(shí)地對(duì)兩個(gè)或更多個(gè)不同抗原調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。兩個(gè)或更多個(gè)不同移位模塊可用于本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)中。例如，Tat序列及VP22序列可用來(lái)使得移位更有效，這是因?yàn)?經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)的移位接著可有效地在更廣范圍的不同細(xì)胞類型或組織類型中發(fā)生。也可以(例如)使用兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽?zāi)K于(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)中，例如，His-標(biāo)簽及FLAG-標(biāo)簽，在該情況中，例如His-標(biāo)簽可用于分離重組蛋白質(zhì)及例如FLAG-標(biāo)簽用于檢測(cè)(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)?？墒褂脙蓚€(gè)或更多個(gè)不同靶向模塊于(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)中，例如，衍生自MHC II分子的不變鏈的序列，及使用甘露糖6磷酸基作為另一靶向模塊。例如，不變鏈作為進(jìn)入MIIC中的靶向模塊，及甘露糖6磷酸基團(tuán)介導(dǎo)靶向進(jìn)入溶酶體中，因此，可增加抗原呈遞的效率或總體上通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞呈遞的抗原不同表位的數(shù)量。此外，本發(fā)明iMAT分子可包含兩條或更多條不同的源于相同或不同物種的不變鏈，因此，容許將本發(fā)明的蛋白質(zhì)用于不同物種中。

本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)中個(gè)別模塊的位置也可以視需要改變，只要存在至少一個(gè)移位模塊、至少一個(gè)靶向模塊及至少一個(gè)抗原模塊即可。(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)的所有或某些模塊也可以(例如)不是以模塊的線性連續(xù)配置形式存在，而是呈圓形或呈分支化模塊結(jié)構(gòu)象式或呈樹(shù)枝狀聚合物形式、或呈線性和/或分支化和/或圓形和/或樹(shù)枝狀聚合物分子部分的組合形式存在。存在表達(dá)載體的商業(yè)供應(yīng)商，其可供應(yīng)使得可通過(guò)這些機(jī)制產(chǎn)生圓形融合蛋白質(zhì)的特定載體，如(例如)來(lái)自美國(guó)馬薩諸塞州比佛利New England Biolabs的IMPACTTM-TWIN系統(tǒng)。分支化模塊可例如通過(guò)從聚L-賴氨酸開(kāi)始，將新賴氨酸殘基附著至隨后賴氨酸殘基各者之兩個(gè)游離胺基合成肽來(lái)制得。依此方式可建立具有實(shí)質(zhì)上任何分支化程度之肽結(jié)構(gòu)。接著可于隨后合成(例如)移位模塊和/或靶向模塊至該分支化肽基本結(jié)構(gòu)上。其他模塊也可以通過(guò)蛋白質(zhì)接合偶合至線性、圓形或分支化肽基本結(jié)構(gòu)上。也可以在肽合成期間將(例如)生物素基團(tuán)引入至肽基本結(jié)構(gòu)中，及可接著經(jīng)由(例如)鏈霉親和素Strep標(biāo)簽系統(tǒng)或經(jīng)由PinPointTM系統(tǒng)(分別來(lái)自德國(guó)哥廷根IBA GmbH及美國(guó)加州圣路易斯奧比斯波Promega Biosciences Inc.)將模塊附著至此類生物素基團(tuán)。依此方式附著的模塊接著經(jīng)由非共價(jià)連接偶合至肽的基本結(jié)構(gòu)。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)包含(優(yōu)選由)根據(jù)SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、14、17、20、21、22、23之氨基酸序列中之一或多者(組成)。

本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)特別可用于具體解決治療和/或預(yù)防患有昆蟲(chóng)叮咬過(guò)敏(IBH)和/或蕁麻疹的馬科動(dòng)物的方法中。

昆蟲(chóng)叮咬過(guò)敏可能是由引起對(duì)象全身反應(yīng)的其他無(wú)害昆蟲(chóng)唾液、毒液、身體部分、外分泌物或內(nèi)分泌物所誘導(dǎo)。實(shí)際上，IBH是一種痛苦的常見(jiàn)馬科動(dòng)物變態(tài)反應(yīng)皮膚疾病并表現(xiàn)為通常因在世界各地發(fā)現(xiàn)的庫(kù)蠓屬昆蟲(chóng)叮咬而引起的慢性復(fù)發(fā)季節(jié)性變態(tài)反應(yīng)皮膚炎。IBH在全世界以不同名稱報(bào)道如甜癢、夏癢、夏疹、卡森(Kasen)、昆士蘭癢(Queensland itch)、季節(jié)性皮膚炎或庫(kù)蠓屬變態(tài)反應(yīng)性反應(yīng)。被感染的個(gè)體極癢且非常痛苦，并強(qiáng)烈地擦摩及啃咬自身。典型臨床癥狀為瘙癢癥，飛蟲(chóng)叮咬起泡，所起泡可能滲液，從而引起結(jié)硬皮、疥瘡及剝落。長(zhǎng)時(shí)間的擦摩及啃咬尤其導(dǎo)致毛發(fā)損失及損傷皮膚，有時(shí)伴隨潰瘍性出血。偶爾可發(fā)生二次細(xì)菌感染。馬擦摩掉其鬣毛及上尾毛也并不罕見(jiàn)。長(zhǎng)遠(yuǎn)而言，可能發(fā)生皮膚增厚及毛發(fā)損失的色素沉著。鬣毛及尾最常受感染；然而，具有嚴(yán)重癥狀的馬可在整個(gè)身體的大部分區(qū)域上具有病灶。診斷以臨床檢查及典型、季節(jié)性發(fā)生癥狀為基礎(chǔ)。

對(duì)馬中IBH的病理生理學(xué)所知甚少。與其他物種相比，就皮膚的表現(xiàn)癥狀而變態(tài)反應(yīng)似乎顯著不同。因此，其對(duì)治療的反應(yīng)也不同，例如，組氨酸受體拮抗劑無(wú)法改善臨床癥狀(Olsen等人，Vet.J.2011,187:347–351)。也已使用變應(yīng)原特異性免疫治療(SIT)，在過(guò)去于馬的IBH方面并未取得成功(Ginel等人，Vet.Derm.2014,25:29–e10)。為解決該醫(yī)療問(wèn)題，本文公開(kāi)并要求保護(hù)的IBH專用(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)中的至少一個(gè)抗原模塊選自目前發(fā)現(xiàn)的自庫(kù)蠓屬(雙翅目：蠓科)不同物種的蠓所分離的變應(yīng)原的群租。另外，感染IBH的馬具有增加7.1倍的也患有蕁麻疹的風(fēng)險(xiǎn)[Kehrli D等人，J Vet Intern Med 2015,29(1):320-326]。蕁麻疹(也稱作“麻疹(hives)”/“風(fēng)疹(nettle rash)”)的特征為出現(xiàn)在皮膚中的離散型腫脹。此類離散型腫脹可以是圓形斑塊、環(huán)形病灶，模擬馬蹄形或具有其他非尋常形狀。大多數(shù)病例為蕁麻疹的復(fù)發(fā)性、突然發(fā)作并在24至48小時(shí)或數(shù)天內(nèi)自發(fā)地恢復(fù)。

有良好的證據(jù)證明存在涉及蕁麻疹相的IgE介導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)組分。然而，仍舊很少知曉病理生理學(xué)。在易感性對(duì)象，例如，患有IBH和/或另外對(duì)環(huán)境變應(yīng)原易感皮膚過(guò)敏反應(yīng)的馬中，直接的誘因可以是昆蟲(chóng)之?；蛞?、膳食、藥物反應(yīng)、草墊、化學(xué)品等。因此，成功的(例如)抗IBH的免疫治療可減少此類對(duì)象中復(fù)發(fā)性蕁麻疹的發(fā)生。

在另一實(shí)施方案中，如本文所公開(kāi)的并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)特別可用于具體解決治療和/或預(yù)防患有復(fù)發(fā)性氣管阻塞(RAO)的馬科動(dòng)物的方法中。

馬科動(dòng)物中的復(fù)發(fā)性氣管阻塞(RAO)(一種類似于人哮喘的呼吸系統(tǒng)疾病)為全球范圍內(nèi)感染中年及老年馬肺中最常見(jiàn)確診病癥之一。其也稱作氣喘病、或慢性支氣管炎/細(xì)支氣管炎，或在早期時(shí)稱作慢性阻塞性肺部疾病。當(dāng)在例如馬處于放牧飼養(yǎng)時(shí)的夏日存在時(shí)，使用術(shù)語(yǔ)與夏日放牧飼養(yǎng)相關(guān)聯(lián)的阻塞性肺部疾病或與夏日放牧飼養(yǎng)相關(guān)聯(lián)的RAO。RAO為1型速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)疾病，其包括一系列典型事件，以反應(yīng)抗體(主要為IgE)開(kāi)始，導(dǎo)致肥大細(xì)胞去顆粒而致產(chǎn)生出組織胺及可共同用來(lái)誘導(dǎo)氣管發(fā)炎及可逆性氣管阻塞的其他化學(xué)介質(zhì)。惡化期間所觀察到的臨床癥狀可以是嚴(yán)重的并包括運(yùn)動(dòng)無(wú)耐力、咳嗽、流鼻涕及增加的休息時(shí)呼吸努力。診斷程序如肺功能測(cè)定、血液氣體分析或支氣管肺泡灌洗可提供額外關(guān)于疾病的信息。典型治療僅涉及緩解性治療(例如支氣管擴(kuò)張劑和/或腎上腺皮質(zhì)類固醇)，但目前尚沒(méi)有病因治療可以采用(Leclere等人，Respirology 2011,16:1027–1046，Pirie,Equine Vet J 2014,46:276–288)。

目前已聲明利用克瑞拉細(xì)胞(Clara Cell)10kDa蛋白質(zhì)(CC10)的治療可有效地保護(hù)或適用作患有RAO的馬的被動(dòng)式免疫治療。CC10為主要產(chǎn)生于人及動(dòng)物氣管上皮中的抗炎癥防御蛋白質(zhì)家族成員之一。該發(fā)明述于US2014/0105906中。

RAO是一種復(fù)雜疾病，但顯然地，暴露于空氣變應(yīng)原在病因方面起關(guān)鍵作用。通常通過(guò)免除暴露于空氣變應(yīng)原來(lái)達(dá)成臨床緩解。然而，迄今為止尚未清楚地識(shí)別觸發(fā)RAO相關(guān)的主要抗原。許多可能的作用劑存在于例如有機(jī)塵埃中，其主要以馬廄或干草塵埃存在于關(guān)在馬廄中的馬中或存在于另外與花粉有關(guān)的牧馬中(Leclere等人，Respirology 2011,16:1027–1046，Pirie,Equine Vet J 2014,46:276–288)。

可依照如本文中實(shí)例6及7中示例性且詳細(xì)地論述的生物信息方法來(lái)選擇本發(fā)明iMAT分子的抗原模塊。依此方式可使得iMAT分子特別適用作例如用于治療和/或預(yù)防對(duì)象優(yōu)選馬科動(dòng)物的RAO疫苗。

在另一實(shí)施方案中，本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)特別適用于具體解決治療和/或預(yù)防患有由細(xì)菌引起的傳染性疾病的馬科動(dòng)物的方法中。

馬紅球菌(Rhodococcus equi)為引發(fā)肺及肺外化膿性肉芽腫性感染(馬紅球菌炎)的長(zhǎng)在土壤中的致病原性放線菌。幼馬特別容易患病并發(fā)展為威脅生命的肺部疾病。然而，偶爾觀察到潰瘍性小腸結(jié)腸炎、骨髓炎及敗血性關(guān)節(jié)炎。已嘗試過(guò)許多免疫接種方法來(lái)預(yù)防小馬的紅球菌炎，沒(méi)有成功或僅有限成功?？股刂委煼且恢滦缘赜行野嘿F，且新近的研究已揭示抗生素抗性菌株的出現(xiàn)。

感染主要經(jīng)由吸入帶有病原體的空氣塵埃。在進(jìn)入至宿主中時(shí)，馬紅球菌在吸入后被肺中局部巨噬細(xì)胞(特別是齒槽巨噬細(xì)胞)吸收。其擴(kuò)散并伴有肺功能緩慢漸進(jìn)性地?fù)p失，使得早期臨床診斷困難。早期臨床癥狀通常僅由輕度發(fā)熱、偶爾咳嗽、或呼吸速率輕微增加(該增加可能不明顯，除非通過(guò)處理使小馬運(yùn)動(dòng)或受壓)組成。另外，診斷并非那么容易，目前，用于監(jiān)測(cè)農(nóng)場(chǎng)中地方性馬紅球菌肺炎的推薦工具是分析白血球濃度及培養(yǎng)來(lái)自經(jīng)氣管洗液的細(xì)菌并且通過(guò)PCR或細(xì)胞學(xué)檢查從該材料識(shí)別出馬紅球菌(van Bargen,K及Haas,A.FEMS Microbiol Rev 2009,33:870–891，Vazquez-Boland,JA等人，Vet Microbiol 2013,167:9–33)。

為解決該醫(yī)學(xué)問(wèn)題，本文公開(kāi)并要求保護(hù)的紅球菌炎專用(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)中的至少一個(gè)抗原模塊可選自衍生自馬紅球菌的抗原，例如，毒性相關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)A(VapA)、免疫顯性表面表達(dá)的脂蛋白、或其他表面蛋白質(zhì)，其也可以衍生自受馬紅球菌感染的噬菌體。經(jīng)改良MAT分子可達(dá)成具體用作(例如)用于治療和/或預(yù)防馬紅球菌炎的疫苗。治療可能涉及施用iMAT分子給小馬和/或也可以包括根據(jù)本發(fā)明來(lái)治療懷孕母馬。

腺疫是馬感染的另一實(shí)例。腺疫，其特征為頭頸部淋巴結(jié)化膿，是由馬鏈球菌(Streptococcus equi)引且為最頻繁確診的馬傳染性疾病之一并且仍急需開(kāi)發(fā)新的預(yù)防性疫苗。

在另一實(shí)施方案中，本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)特別適用于具體解決治療和/或預(yù)防患有由病毒引起的傳染性疾病的馬科動(dòng)物的方法中。

非洲馬疫(AHS)為高度傳染性且致命性疾病。其通常感染馬、騾及驢。其是由屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)的環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)病毒引起。AHS不是直接傳染，然而，已知通過(guò)昆蟲(chóng)載體，主要通過(guò)庫(kù)蠓、以及庫(kù)蚊、按蚊(Anopheles)及斑蚊(Aedes)擴(kuò)散，或已描述通過(guò)壁虱(例如璃眼蜱屬(Hyalomma)或扇頭蜱屬(Rhipicephalus))傳播。迄今，尚無(wú)針對(duì)AHS的有效治療，就24小時(shí)的感染而言，受感染的馬中有接近90％主要死于呼吸衰竭。因此，對(duì)該疾病的控制仰賴于預(yù)防性疫苗接種。

西尼羅河病毒(WNV)屬于黃病毒科中黃病毒屬的日本腦炎病毒血清型群的經(jīng)蚊傳播的正鏈RNA病毒。WNV為疾病綜合征的致病物，也稱作西尼羅發(fā)熱。鳥(niǎo)類為自然貯存宿主，且WNV在自然中維持蚊–鳥(niǎo)–蚊傳播循環(huán)。然而，當(dāng)馬受感染時(shí)，其常常仍未被識(shí)別出。馬因重度神經(jīng)癥狀(包括輕癱、失調(diào)、仰臥及肌肉顫動(dòng))而死亡或安樂(lè)死，其他馬展現(xiàn)輕度至重度腦脊髓灰質(zhì)炎。WNV感染的診斷及證實(shí)可直接地通過(guò)識(shí)別病毒或直接地通過(guò)測(cè)試臨床樣本中的抗體來(lái)進(jìn)行。然而，其通常受到馬病毒血癥的短持續(xù)時(shí)間及低程度所妨礙。

在另一實(shí)施方案中，本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)特別適用于具體解決防止馬科動(dòng)物的傳染性疾病經(jīng)載體(例如食血蒼蠅、蠓、壁虱和/或蚊)傳播的方法中。

病原體連同包含多種生物活性分子的節(jié)肢動(dòng)物唾液一起遞送至哺乳動(dòng)物宿主皮膚中。此類唾液組分可改變止血及免疫應(yīng)答及可促成病原體建立感染的能力。食血節(jié)肢動(dòng)物自身唾腺中傳染性微生物的存在會(huì)改變唾液組成，如，受感染蚊中腺苷三磷酸雙磷酸酶或抗凝血酶濃度的改變。此類或其他抗原極適合用于本發(fā)明iMAT分子的抗原模塊中并可具體適用作用于活化宿主免疫系統(tǒng)以防止馬科動(dòng)物經(jīng)載體傳播傳染性病原體的疫苗。

在另一實(shí)施方案中，本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)特別適用于具體解決治療和/或預(yù)防患有由真菌引起的傳染性疾病的馬科動(dòng)物的方法中。

皮癬菌病或輪廯是發(fā)生在動(dòng)物及人毛發(fā)及皮膚表面角質(zhì)化細(xì)胞層的真菌感染。屬于親動(dòng)物性或親土壤性皮癬菌病群組的小孢癬菌屬或毛癬菌屬的若干物種可引起動(dòng)物的臨床感染。真菌和/或其孢子的多種表面抗原極適合用于本發(fā)明iMAT分子的抗原模塊中，并可具體用作(例如)用于治療和/或預(yù)防馬科動(dòng)物皮癬菌病的疫苗。

在另一實(shí)施方案中，本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)特別適用于具體解決治療和/或預(yù)防患有因寄生蟲(chóng)引起的傳染性疾病的馬科動(dòng)物的方法中。

感染寄生蟲(chóng)的普遍存在并在全球具臨床重要意義。威脅馬健康的主要寄生蟲(chóng)為小型圓線蟲(chóng)(cyathostomins)、馬蛔蟲(chóng)(parascaris equorum)、葉狀裸頭絳蟲(chóng)(anoplocephala perfoliata)、及尋常圓線蟲(chóng)(strongylus vulgaris)。全球報(bào)告在馬寄生蟲(chóng)中驅(qū)蟲(chóng)藥耐藥性程度漸增。就原生蟲(chóng)例如隱孢子蟲(chóng)屬而言，很少藥物可始終抑制宿主中寄生蟲(chóng)再現(xiàn)。主要是小馬受感染且結(jié)果仰賴于先天及適應(yīng)性免疫應(yīng)答。

衍生自成年寄生蟲(chóng)的抗原及潛隱期(prepatent stage)為要用于本發(fā)明iMAT分子的抗原模塊的另一實(shí)例及可具體用作(例如)用于治療和/或預(yù)防馬科動(dòng)物寄生蟲(chóng)感染的疫苗。

具體而言，就調(diào)節(jié)馬的免疫應(yīng)答而言，至少一個(gè)靶向模塊優(yōu)選為馬不變鏈，更優(yōu)選為一或多個(gè)根據(jù)SEQ ID NO:2、15、16的氨基酸序列。

在一有利實(shí)施方案中，本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)呈單體形式存在，這是因?yàn)?例如)重組引入的變應(yīng)原傾向于形成聚積物，尤其假若經(jīng)由包含體產(chǎn)生。通過(guò)取代(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)的整體序列中的至少一個(gè)、優(yōu)選全部半胱氨酸殘基，優(yōu)選通過(guò)取代為絲氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和/或天冬氨酸，可防止形成分子間二硫鍵，因此，避免任何聚積，具體而言，避免任何非自然形成分子間-和/或分子內(nèi)鍵。即，整體缺乏半胱氨酸殘基的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)不會(huì)聚積。因此，蛋白質(zhì)可輕易地表達(dá)并展現(xiàn)經(jīng)改良的靶向及MHC呈遞。

另外，(例如)變應(yīng)原的此類不含半胱氨酸的變體，其中野生型變應(yīng)原氨基酸序列中的半胱氨酸殘基已單獨(dú)地或以組合方式突變，顯示與相應(yīng)的野生型變應(yīng)原相比降低的IgE反應(yīng)性且同時(shí)實(shí)質(zhì)上保持對(duì)T-淋巴細(xì)胞反應(yīng)性及因此具低變應(yīng)原性。

本發(fā)明因此關(guān)于誘導(dǎo)馬中(例如)IBH的變應(yīng)原的此類低變應(yīng)原性變體，其中在此類變體中，野生型變應(yīng)原的半胱氨酸殘基已單獨(dú)地或以組合方式突變。

另外，用于分離包含本發(fā)明iMAT分子的樣品中蛋白質(zhì)的標(biāo)簽?zāi)K的存在，(例如)使用載鋅或載鈷固體支持物，進(jìn)一步提高產(chǎn)生出融合蛋白質(zhì)而不在純化過(guò)程期間聚積的可能性。典型地，標(biāo)簽?zāi)K包括5至6個(gè)連續(xù)組氨酸殘基的聚組氨酸標(biāo)簽。

本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)可用于醫(yī)藥組合物中。例如，(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)用于疫苗中。因此，本發(fā)明提供包含一或多種本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)的疫苗組合物。該疫苗組合物可治療上和/或預(yù)防上用于患有昆蟲(chóng)叮咬過(guò)敏(IBH)、蕁麻疹和/或馬復(fù)發(fā)性氣管阻塞(RAO)、由病原體誘導(dǎo)的傳染性疾病(例如紅球菌肺炎、腺疫、非洲馬疫、西尼羅河病毒感染、皮癬菌病)和/或消化道或其他器官的寄生蟲(chóng)(例如隱孢子蟲(chóng)病、蠕蟲(chóng)和/或其潛隱期)的馬科動(dòng)物中。另外，該方法可不僅針對(duì)抗此類病原體使用，而且可用于活化宿主免疫系統(tǒng)以防止經(jīng)載體例如食血蒼蠅、螨、壁虱和/或蚊傳播。

因此，在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，提供用于對(duì)象如馬科動(dòng)物的疫苗以治療和/或預(yù)防因?qū)鐜?kù)蠓和/或其他食血昆蟲(chóng)的叮咬反應(yīng)而引起的IBH。另外，成功地抗IBH的免疫治療一般可降低對(duì)環(huán)境變應(yīng)原的皮膚過(guò)敏反應(yīng)及因此可降低此類易感性對(duì)象的復(fù)發(fā)性蕁麻疹的發(fā)生。

在本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，提供用于對(duì)象如馬科動(dòng)物的疫苗以治療和/或預(yù)防因?qū)缑咕?真菌和/或其孢子)、花粉、室內(nèi)塵?；蝻暳向?和/或其孢子)反應(yīng)而引起的RAO。

在本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，提供用于對(duì)象如馬科動(dòng)物的疫苗以治療和/或預(yù)防與例如紅球菌屬、馬鏈球菌屬、環(huán)狀病毒屬、黃病毒屬、毛癬菌屬、小孢癬菌屬、隱孢子蟲(chóng)屬和/或圓線蟲(chóng)屬相關(guān)的傳染性疾病。另外，可提供疫苗以活化宿主免疫系統(tǒng)來(lái)防止疾病經(jīng)載體例如庫(kù)蠓屬、庫(kù)蚊屬和/或硬蜱屬和/或其他食血昆蟲(chóng)傳播。

(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)例如呈疫苗形式的醫(yī)藥組合物優(yōu)選經(jīng)設(shè)計(jì)用于舌下施用、皮下和/或皮內(nèi)注射、注射至淋巴結(jié)中和/或用于經(jīng)粘膜，具體而言經(jīng)胃腸道或呼吸系統(tǒng)的粘膜施用。

在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，醫(yī)藥組合物以非經(jīng)腸方式施用。

本發(fā)明iMAT分子可用作醫(yī)藥或用作疫苗來(lái)調(diào)節(jié)(例如)過(guò)敏性疾病。例如，昆蟲(chóng)叮咬過(guò)敏(IBH)可通過(guò)此類iMAT分子來(lái)治療。

少量(1至1000μg是指僅一或多個(gè)抗原模塊的重量)包含誘導(dǎo)IBH的昆蟲(chóng)例如庫(kù)蠓屬變應(yīng)原的重組制得的iMAT分子，例如經(jīng)皮下、經(jīng)皮內(nèi)或直接注射至淋巴結(jié)中1至5次，引發(fā)馬科動(dòng)物的強(qiáng)力且持久免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致緩解臨床癥狀。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明iMAT分子以與至少一種佐劑組合的方式施用。該佐劑包括(但不限于)以下中之一或多者：明礬、BCG、氫氧化鋁、磷酸鋁、磷酸鈣、脂質(zhì)乳液、脂質(zhì)或聚合納米-或微球體、膠束、脂質(zhì)體、皂苷、脂質(zhì)A、或胞壁酰二肽、細(xì)菌產(chǎn)物、趨化激素、細(xì)胞激素及激素、甲殼素、淀粉、海藻鹽、纖維素衍生物(例如，乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素)、核酸、或核酸構(gòu)建物?？商砑哟祟惤M分中之一或多者以增進(jìn)或改良免疫應(yīng)答?；蛘?，iMAT分子可在不含佐劑下或呈水溶液形式施用。

iMAT分子可以約1μg至1000μg(該劑量及隨后的劑量是指僅一或多個(gè)抗原模塊的重量)的劑量及更優(yōu)選以約10μg至約100μg的劑量及甚至更優(yōu)選以約20μg至約50μg的劑量施用，然而，最佳劑量可根據(jù)注射的抗原(優(yōu)選變應(yīng)原)、對(duì)象體重、對(duì)象的免疫系統(tǒng)等改變。在許多情況中，有效的治療可通過(guò)一次施用來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，治療包括1至15次施用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，治療包括1至5次施用及更優(yōu)選包括1至3次施用。就初始治療而言，施用可例如在數(shù)天中定期進(jìn)行，每月或每年一次或兩次、或每年數(shù)次。就維持免疫應(yīng)答而言，施用可以數(shù)月至數(shù)年的時(shí)間間隔進(jìn)行。

在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)是經(jīng)設(shè)計(jì)用于淋巴結(jié)內(nèi)施用。在直接注射至淋巴結(jié)中的過(guò)程中，各淋巴結(jié)可在注射程序期間例如通過(guò)超音波可視化，以監(jiān)測(cè)針頭位置及淋巴結(jié)改變(如腫脹)。注射至下頜、腋、腹股溝和/或腘肌淋巴結(jié)中優(yōu)選，這歸因于便于超音波導(dǎo)引定位及注射。

現(xiàn)有技術(shù)中已知食血昆蟲(chóng)唾液中有若干(>20)種識(shí)別的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)馬科動(dòng)物的IgE反應(yīng)性及病理皮膚反應(yīng)[Schaffartzik,Veterinary Immunology and Immunopathology 2012,147:113-126；Allergome(www.allergome.org)]。因此，預(yù)期治療可僅在大多數(shù)相關(guān)變應(yīng)原包含于用于特異性免疫治療的藥物中的情況下成功。然而，出乎意料地，根據(jù)本發(fā)明的各包含(例如)昆蟲(chóng)唾液的不同抗原模塊或僅表位的類鑲嵌結(jié)構(gòu)的此類iMAT分子中僅1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)足以引起患病對(duì)象的免疫調(diào)節(jié)和/或臨床改善，假若此類iMAT分子經(jīng)皮下、經(jīng)皮內(nèi)和/或直接注射至淋巴結(jié)中1至5次。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，單一iMAT分子經(jīng)使用且足以誘導(dǎo)治療效應(yīng)和/或預(yù)防發(fā)展出馬科動(dòng)物的昆蟲(chóng)叮咬過(guò)敏(IBH)、蕁麻疹和/或馬科動(dòng)物復(fù)發(fā)性氣管阻塞(RAO)。

在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)iMAT分子的組合通過(guò)同時(shí)、連續(xù)和/或時(shí)序交錯(cuò)地共同施用進(jìn)行使用。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，單一iMAT分子經(jīng)使用且足以誘導(dǎo)治療效應(yīng)和/或預(yù)防和/或防止馬科動(dòng)物的傳染性疾病(例如紅球菌肺炎、腺疫、非洲馬疫、西尼羅河病毒感染、皮癬菌病和/或消化道或其他器官的寄生蟲(chóng)例如隱孢子蟲(chóng)病、蠕蟲(chóng)和/或其潛隱期)傳播和/或此類傳染性疾病通過(guò)例如食血蒼蠅、蠓、壁虱和/或蚊傳播。

在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)iMAT分子的組合通過(guò)同時(shí)、連續(xù)和/或時(shí)序交錯(cuò)地共同施用進(jìn)行使用。

基于本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)的熱動(dòng)力評(píng)估，穩(wěn)定性受到半胱氨酸突變(即，不同氨基酸殘基的取代)影響。例如，該取代可以是Cys或Ser取代。然而，使用除Ser氨基酸外的不同氨基酸殘基，穩(wěn)定性可更高以達(dá)成期望的穩(wěn)定性及溶解性。即，盡管第一選擇可以是改由Ser取代Cys，然而，在不穩(wěn)定的情況下，應(yīng)改由除Ser外的其他氨基酸殘基置換Cys。

為選擇穩(wěn)定氨基酸殘基作為標(biāo)靶序列中半胱氨酸的替代，選用三步法：

1.將包含末端六聚組氨酸標(biāo)簽、iMAT序列及受關(guān)注蛋白質(zhì)的一級(jí)氨基酸序列的靶向蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型化。模型化可利用天然序列且并與半胱氨酸取代來(lái)進(jìn)行。

2.基于單點(diǎn)取代，如改由不同氨基酸殘基例如Ser和/或Ile取代半胱氨酸殘基來(lái)反覆測(cè)定蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，并評(píng)分以通過(guò)分析所有可取得的三維結(jié)構(gòu)來(lái)確定穩(wěn)定的替代。

3.再模型化經(jīng)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)及通過(guò)重復(fù)步驟1及2驗(yàn)證穩(wěn)定性。

三維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)于在分子水平上明了蛋白質(zhì)功能具關(guān)鍵性且對(duì)于許多不同類型的生物實(shí)驗(yàn)如定點(diǎn)誘變產(chǎn)生的合理設(shè)計(jì)受到極大關(guān)注。然而，經(jīng)結(jié)構(gòu)表征的蛋白質(zhì)的數(shù)目與已知蛋白質(zhì)序列的數(shù)目相比很小。對(duì)于給定蛋白質(zhì)序列(標(biāo)靶)，可識(shí)別具有已知結(jié)構(gòu)的同源蛋白質(zhì)(模板)。在此類情況中，已證實(shí)同源模型化選擇性地自蛋白質(zhì)一級(jí)氨基酸序列產(chǎn)生出其可靠3D模型的方法。建構(gòu)同源模型，包括四個(gè)主要步驟：(1)識(shí)別結(jié)構(gòu)模板，(2)將標(biāo)靶序列及模板結(jié)構(gòu)比對(duì)，(3)構(gòu)建模型及(4)模型質(zhì)量評(píng)估?？芍貜?fù)此類步驟直到達(dá)成令人滿意的模型化結(jié)果。在無(wú)法確定準(zhǔn)確同源模型的情況中，使用計(jì)算方法以自一級(jí)結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)?！爸匦?De novo)”或“從頭開(kāi)始(ab initio)”方法基于物理原理及嘗試模擬折疊過(guò)程。此類方法必須對(duì)大量構(gòu)象取樣及需要極準(zhǔn)確能量函數(shù)以識(shí)別在總體自由能最小的結(jié)構(gòu)。許多方法利用此類所述原理的組合。

產(chǎn)生合理地準(zhǔn)確估計(jì)氨基酸取代對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性影響的計(jì)算工具的可利用性在廣泛范圍應(yīng)用中具關(guān)鍵重要性。具體而言，此類工具具有刺激并支持專門(mén)用于產(chǎn)生出經(jīng)修改蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)工程及設(shè)計(jì)工程的潛力。

可在就可逆地快速去折疊及再折疊的蛋白質(zhì)的熱動(dòng)力穩(wěn)定性方面考慮蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。在此類情況中，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性是折疊及去折疊狀態(tài)之間的吉布斯(Gibbs)自由能差。影響穩(wěn)定性的唯一因素為折疊及去折疊狀態(tài)的相對(duì)自由能。折疊自由能差越大且為越大的正值，則蛋白質(zhì)的變性更穩(wěn)定。折疊自由能差通常很小，對(duì)于球蛋白而言，在5至15kcal/mol級(jí)別。然而，另一方面，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性可被認(rèn)為是耐受苛刻溫度或溶劑條件的蛋白質(zhì)性質(zhì)。此與熱動(dòng)力穩(wěn)定性相關(guān)而又與折疊/去折疊的可逆性或不可逆性(動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性)相關(guān)。

為預(yù)測(cè)因蛋白質(zhì)中單點(diǎn)取代所引起的熱動(dòng)力穩(wěn)定性改變，可應(yīng)用數(shù)種不同方法以研究此類取代對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能的影響[Pires DE等人，Bioinformatics 2014,30(3):335-342]。此類方法可大致被歸類為那些尋求明了自僅蛋白質(zhì)的氨基酸序列取代的效應(yīng)者、以及那些利用大量結(jié)構(gòu)信息者?；诮Y(jié)構(gòu)的方法通常嘗試基于取代或?qū)嶋H自由能值(ΔΔG)中來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性改變。

就特定取代出現(xiàn)的次數(shù)而言使用評(píng)分系統(tǒng)對(duì)各特異性蛋白質(zhì)及其對(duì)應(yīng)模型的結(jié)果作統(tǒng)計(jì)分析，該評(píng)分系統(tǒng)基于在使用的模型中的出現(xiàn)及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性自由能改變(ΔΔG)而對(duì)取代評(píng)級(jí)，因而確定輸入結(jié)構(gòu)及可能取代中最不穩(wěn)定的殘基(若有的話)。通過(guò)測(cè)定各模型中受關(guān)注各位置處的最低ΔΔG(ΔΔG<0)及對(duì)各可能取代位置指派相應(yīng)的線性值及累積ΔΔG值來(lái)計(jì)算分?jǐn)?shù)且接著評(píng)估結(jié)果以確定模型之間的一致性。由于經(jīng)過(guò)計(jì)算的蛋白質(zhì)模型具有不同質(zhì)量(預(yù)測(cè)正確三維結(jié)構(gòu)的可能性)，故可實(shí)施加權(quán)因子以優(yōu)先排序更準(zhǔn)確模型的結(jié)果。明顯(基于ΔΔG而言)不穩(wěn)定的殘基(若有的話)經(jīng)取代；產(chǎn)生出新穎模型且反覆再分析直到達(dá)成穩(wěn)態(tài)。通過(guò)主要組分分析法分析xyz坐標(biāo)來(lái)評(píng)估額外產(chǎn)生出的模型以確定由于在特定位置取代氨基酸所致的可能結(jié)構(gòu)錯(cuò)誤折疊。

在又一方面中，本發(fā)明基本目標(biāo)已出乎意料地通過(guò)提供一種識(shí)別預(yù)定氨基酸序列中的氨基酸取代使得此類預(yù)定氨基酸序列穩(wěn)定的方法得以解決，該方法包括以下步驟：

(i)將標(biāo)靶預(yù)定氨基酸序列的三維/三級(jí)結(jié)構(gòu)模型化，

(ii)基于單點(diǎn)取代，如改由不同氨基酸殘基，優(yōu)選絲氨酸和/或異亮氨酸殘基取代半胱氨酸殘基來(lái)反覆確定蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，及基于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性自由能改變(ΔΔG)的評(píng)分系統(tǒng)通過(guò)分析所有可取的三維/三級(jí)氨基酸序列結(jié)構(gòu)來(lái)確定穩(wěn)定的取代，

(iii)將經(jīng)取代的三維/三級(jí)氨基酸序列結(jié)構(gòu)再模型化及通過(guò)重復(fù)步驟(ii)及(iii)來(lái)計(jì)算得其穩(wěn)定性直到達(dá)成穩(wěn)態(tài)。

在又一方面中，本發(fā)明基本目標(biāo)已出乎意料地通過(guò)提供本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)得以解決，其中其完全或部分氨基酸序列系通過(guò)本文公開(kāi)并要求保護(hù)的識(shí)別預(yù)定氨基酸序列中的氨基酸取代方法而穩(wěn)定化(參見(jiàn)本文中實(shí)施例5)。

附圖簡(jiǎn)述

圖1：顯示庫(kù)蠓屬變應(yīng)原的實(shí)例，識(shí)別物種、變應(yīng)原及uniprot寄存號(hào)(數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)行為UniProt發(fā)行2013_09)。

圖2：顯示MAT-Fel d1(IVN201)在還原條件下的SDS-PAGE；A)初始SDS-PAGE(10μg蛋白質(zhì)/泳道，考馬斯染色)及B)具有已從凝膠A中切除及重新加載于SDS-PAGE上的譜帶的SDS-PAGE(銀染色)。

圖3：顯示Fel d1在還原條件下的SDS-PAGE；4至12％Bis-Tris凝膠。泳道：1)標(biāo)記物：SeeBlue Plus2預(yù)染色標(biāo)準(zhǔn)；2)5μg Fel d1；3)5μg Fel d1。

圖4：顯示RP-HPLC層析圖，0.1％TFA/乙腈梯度a)不含添加劑的天然蛋白質(zhì)(MAT-Fel d1)(左圖)；b)通過(guò)添加氯化胍加上DTT變性的MAT-Fel d1(右圖)。

圖5：描繪MAT-Fel d1分子及其Kyte Doolittle疏水性圖。

圖6：顯示SDS-PAGE-系統(tǒng)(4至12％Bis-Tris凝膠，1×MES-運(yùn)行緩沖液，35分鐘，200V)。泳道：1)溶菌酶，1μg蛋白質(zhì)ox。2)PageRuler預(yù)染色蛋白梯；3)經(jīng)碘乙酰胺氧化的MAT-Fel d1(5μg)(ox.)；4)iMAT-Cul o4(ox.)；5)PageRuler預(yù)染色蛋白梯；6)還原的MAT-Fel d1(5μg)；7)還原的iMAT-Cul o4；8)還原的溶菌酶。

圖7：顯示RP-HPLC層析圖，0.1％TFA/乙腈梯度。峰反映不含添加劑之天然(經(jīng)氧化)蛋白質(zhì)(iMAT-Cul o4)。

圖8：描繪了展現(xiàn)所選定庫(kù)蠓變應(yīng)原的局部比對(duì)對(duì)應(yīng)計(jì)數(shù)與所測(cè)量的敏化進(jìn)行比較的實(shí)例(詳細(xì)內(nèi)容請(qǐng)參見(jiàn)說(shuō)明書(shū))。該圖描繪在一組IBH馬群中就嚴(yán)重度(每一變應(yīng)原的總評(píng)分值)方面的HRT測(cè)試中的抗原預(yù)測(cè)(淺灰色及右Y軸)與結(jié)果(深灰色及左Y軸)之間的比較。嚴(yán)重度以半定量標(biāo)度(左Y軸)描述該測(cè)試中反應(yīng)的程度。來(lái)自預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)是通過(guò)設(shè)定等于最高嚴(yán)重度評(píng)分的最高出現(xiàn)率評(píng)分來(lái)縮放。

圖9：顯示隨后實(shí)驗(yàn)的結(jié)果：在RT下培養(yǎng)30分鐘同時(shí)輕輕地混合的蛋白質(zhì)及在培養(yǎng)之后，將樣品離心3分鐘并在隨后進(jìn)行SDS-Page分析：泳道1)pageRuler預(yù)染色蛋白梯；2)iMAT-Cul o3上清液；3)在尿素中的iMAT-Cul o3細(xì)胞小球；4)iMAT-Cul o3上清液；5)在尿素中的iMAT-Cul o3細(xì)胞小球；6)空白；7)iMAT-Cul o2上清液；8)在尿素中的iMAT-Cul o2細(xì)胞小球；9)iMAT-Cul o2上清液；10)在尿素中的iMAT-Cul o2細(xì)胞小球；11)空白；12)iMAT-Cul o4上清液；13)在尿素中的iMAT-Cul o4細(xì)胞小球；14)iMAT-Cul o4上清液；15)在尿素中的iMAT-Cul o4細(xì)胞小球；(2、3、7、8、12、13w/o凍融)；(4、5、9、10、14、15系在兩次凍融制程之后)。

圖10：顯示5種濃度的iMAT-Cul o2及iMAT-Cul o3及多重致變態(tài)反應(yīng)化的馬(馬1)中的各個(gè)變應(yīng)原的組織胺釋放測(cè)試(分析的詳細(xì)內(nèi)容可參見(jiàn)實(shí)例2)。

圖11：顯示各個(gè)融合蛋白質(zhì)室溫一般部分[即，不含各個(gè)抗原模塊]中MAT分子相對(duì)iMAT分子室溫Kyte-Doolittle疏水性圖。疏水性指數(shù)相對(duì)在X軸上的氨基酸位置顯示在Y軸上。指數(shù)的正數(shù)值指示疏水性。在疏水性圖開(kāi)始處iMAT分子的圖相對(duì)MAT分子的圖的位移歸因于iMAT分子中N端額外存在His-標(biāo)簽及一個(gè)甲硫氨酸殘基及不存在任何間隔模塊所致。

圖12：該圖顯示正規(guī)數(shù)據(jù)庫(kù)中的Cul o3(M4X062，SEQ ID NO:6)的每個(gè)具有13個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽的非隨機(jī)對(duì)應(yīng)數(shù)及其在相應(yīng)前體蛋白質(zhì)中的位置。y軸描繪對(duì)應(yīng)數(shù)而x軸描繪參考前體蛋白質(zhì)的氨基酸位置。垂直點(diǎn)線指示半胱氨酸殘基，點(diǎn)虛線描繪非隨機(jī)發(fā)現(xiàn)的同源性數(shù)的平均移動(dòng)及水平實(shí)線對(duì)應(yīng)于經(jīng)計(jì)算機(jī)模擬裂解的肽。

實(shí)施例

下列實(shí)例用來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但其不應(yīng)解釋成限制本文所揭示之本發(fā)明的范疇。

實(shí)施例1:免疫性/免疫性持續(xù)時(shí)間的替代標(biāo)記

將本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)施用給馬科動(dòng)物，而對(duì)存在于抗原模塊中的變應(yīng)原和/或表位產(chǎn)生出免疫學(xué)反應(yīng)。另外，可使用C-或N-端標(biāo)簽?zāi)K連同來(lái)自相鄰模塊的相鄰氨基酸殘基一起以檢測(cè)可用作用于免疫性或免疫性持續(xù)時(shí)間的替代標(biāo)記的目標(biāo)對(duì)象中獨(dú)特的產(chǎn)物特異性免疫學(xué)信號(hào)(例如，抗體-或T-細(xì)胞反應(yīng))。作為治療特異性免疫學(xué)參數(shù)，該替代標(biāo)記可實(shí)現(xiàn)評(píng)估施用后的免疫性或免疫調(diào)節(jié)或免疫性持續(xù)時(shí)間或免疫調(diào)節(jié)持續(xù)時(shí)間。因此，用于由根據(jù)本發(fā)明的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)所觸發(fā)的免疫應(yīng)答的特異性指示為誘導(dǎo)末端-標(biāo)簽(任選與相鄰氨基酸殘基)特異性抗體，如IgG抗體?；蛘呋蛄硗?，指示為誘導(dǎo)對(duì)間隔物及本文公開(kāi)并要求保護(hù)的模塊的接合或兩個(gè)模塊之間的接合特異性的抗體。

實(shí)施例2:低變應(yīng)原性

準(zhǔn)備患有IBH的馬的新抽取的血液以測(cè)試對(duì)本文公開(kāi)并要求保護(hù)的(經(jīng)分離)重組蛋白質(zhì)/iMAT分子的嗜堿細(xì)胞反應(yīng)性。此可通過(guò)Kaul的改良方法[Kaul,S.,1998.Type I allergies in the horse:Basic development of a histamine release test(HRT).Doctoral thesis.Veterinary School Hannover，德國(guó)]來(lái)測(cè)定。簡(jiǎn)言之，iMAT分子和/或重組變應(yīng)原的10倍系列稀釋(例如，范圍自10nM至0.001nM最終變應(yīng)原濃度)在PIPES緩沖液(AppliChem，德國(guó)達(dá)姆斯塔特)(pH 7.4)中制得。在37℃利用個(gè)別稀釋液培養(yǎng)自Na-EDTA凝結(jié)抑制的血液獲得的經(jīng)洗滌的紅血球及白血球1小時(shí)。通過(guò)在冰上培養(yǎng)20分鐘停止反應(yīng)及在離心之后自各樣品收集包含所釋放組織胺的上清液。通過(guò)在水浴中煮沸血液細(xì)胞維持10分鐘，獲得最大組織胺含量(最大釋放)。以經(jīng)洗滌的血液細(xì)胞培養(yǎng)釋放緩沖液作為陰性對(duì)照組(自發(fā)釋放)。使用競(jìng)爭(zhēng)性RIA(LDN Nordhorn，德國(guó))按照制造商指示來(lái)測(cè)定組織胺濃度。

或者，另一嗜堿細(xì)胞活化測(cè)試為細(xì)胞抗原刺激測(cè)試ELISA，其也可以被視為是體外變態(tài)反應(yīng)激發(fā)測(cè)試。根據(jù)制造商指示(Bühlmann Laboratories AG，瑞士阿勒斯海姆)來(lái)進(jìn)行此試驗(yàn)。在中，從變態(tài)反應(yīng)對(duì)象血液沉淀出的白血球同時(shí)獲得細(xì)胞激素IL-3并通過(guò)iMAT分子和/或重組變應(yīng)原刺激。嗜堿細(xì)胞等產(chǎn)生出變態(tài)反應(yīng)性介質(zhì)、硫化白細(xì)胞三烯(sulfidoleukotriene)LTC4、及其代謝產(chǎn)物L(fēng)TD4及LTE4。于隨后以ELISA測(cè)試法(酶聯(lián)免疫吸附分析法)測(cè)定此類新合成的硫化白細(xì)胞三烯(sLT)。

可利用此類試驗(yàn)，通過(guò)僅比較iMAT分子(包含變應(yīng)原)及僅各個(gè)重組變應(yīng)原的效應(yīng)來(lái)體外評(píng)估iMAT分子引起不良事件例如作為施用副作用的激發(fā)變態(tài)反應(yīng)性反應(yīng)的可能性。

與重組變應(yīng)原相比，通過(guò)iMAT分子降低的嗜堿細(xì)胞去顆粒(例如，組織胺和/或硫化白細(xì)胞三烯釋放)，顯示不良效應(yīng)的較低可能性，即，iMAT分子的安全性特性更優(yōu)選。

該HRT(或)可用作用于馬的1型過(guò)敏反應(yīng)的體外激發(fā)測(cè)試。變應(yīng)原特異性組織胺釋放指示各個(gè)變應(yīng)原針對(duì)嗜堿細(xì)胞活化的相關(guān)性及因此可用作用于對(duì)象的變應(yīng)原特異性敏化的定量參數(shù)。

就現(xiàn)有技術(shù)中所述的MAT分子而言，在細(xì)胞抗原刺激測(cè)試(CAST)分析及真皮內(nèi)及皮內(nèi)測(cè)試中證實(shí)與相應(yīng)的天然變應(yīng)原(Fel d1)相比的低變應(yīng)原性[Senti G等人，J Allergy Clin Immunol.2012,129(5):1290-1296]。變應(yīng)原及包含F(xiàn)el d1的MAT分子之間的敏感性定量差異分別為100、23及16倍。盡管MAT-Fel d1清楚地為低變應(yīng)原性，但保留部分變態(tài)反應(yīng)性。

關(guān)于本發(fā)明，測(cè)試2種根據(jù)本發(fā)明制得的在抗原模塊中分別包含Cul o2及Cul o3之iMAT分子的安全性。在如上所述的組織胺釋放測(cè)試(HRT)中使用患有IBH的多重敏化馬的新抽取的血液。

如圖10中所顯示，天然變應(yīng)原誘導(dǎo)強(qiáng)力的組織胺釋放，然而，出乎意料地，這兩種不同iMAT分子(iMAT-Cul o3及iMAT-Cul o2)顯示實(shí)質(zhì)上根本沒(méi)有反應(yīng)。因此，iMAT分子與如現(xiàn)有技術(shù)中所述的MAT分子(參見(jiàn)上述)相比顯示在就安全性方面的明顯優(yōu)勢(shì)。

可預(yù)期假若患有IBH的馬通過(guò)此類iMAT分子處理，則不發(fā)生與變應(yīng)原相關(guān)的不良反應(yīng)。

與MAT分子不同，iMAT分子這種出乎意料的安全性特性的結(jié)果是，用作脫敏蛋白質(zhì)的iMAT分子可類似于抗病原體疫苗使用。不需要擴(kuò)大典型治療性變應(yīng)原的劑量，這是因?yàn)榘琲MAT分子的疫苗不顯示在就變態(tài)反應(yīng)不良事件方面的變應(yīng)原性質(zhì)。治療過(guò)程中iMAT分子的首次注射劑量可已經(jīng)僅基于療效考量來(lái)選擇而不須要考慮可能的變態(tài)反應(yīng)不良反應(yīng)。這不可使用現(xiàn)有技術(shù)中所述的MAT分子來(lái)進(jìn)行，這是因?yàn)榕c天然變應(yīng)原相比MAT得過(guò)敏性僅降低至特定水平。然而，MAT分子仍舊是變應(yīng)原；相反地，iMAT分子不是。此類改良的性質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是可通過(guò)例如以高生物醫(yī)藥含量三次皮下或經(jīng)淋巴注射(例如，3次，20μg至50μg iMAT蛋白質(zhì))實(shí)現(xiàn)更有效的治療療程。

所測(cè)試的這兩種iMAT分子的致敏性的缺乏可由與現(xiàn)有技術(shù)中所述的MAT分子不同不使用接頭氨基酸殘基[即，介于第一、第二和/或第三模塊之間的間隔模塊]以分離此類iMAT分子中的不同模塊的事實(shí)來(lái)解釋?，F(xiàn)有技術(shù)中已知包含兩種或更多種經(jīng)肽或蛋白質(zhì)接頭接合的功能性多肽的改造融合蛋白質(zhì)對(duì)于蛋白質(zhì)的功能(例如，通過(guò)免疫系統(tǒng)識(shí)別表位)具重要作用[Klein JS等人，Protein Eng Des Sel.2014,27(10):325-330]。功能性單元之間的分離距離可影響表位進(jìn)入及以抗體親抗原性結(jié)合能力。假若模塊之間，具體而言靶向結(jié)構(gòu)與與抗原模塊之間缺失氨基酸殘基接頭，則獲得更剛性的結(jié)構(gòu)，可能因不正確折疊而無(wú)法形成變應(yīng)原模塊的構(gòu)象表位。必需使嗜堿細(xì)胞(例如IgE)表面上以其高親和力受體結(jié)合的抗體交聯(lián)以引發(fā)活化及組織胺釋放。然而，錯(cuò)誤折疊的變應(yīng)原可能無(wú)法引發(fā)該交聯(lián)。因此，不含接頭的iMAT分子可不形成構(gòu)象IgE表位，這使得iMAT分子不具有致變態(tài)反應(yīng)性。

實(shí)施例3:變應(yīng)原/生物標(biāo)記的計(jì)算機(jī)模擬檢測(cè)

如本發(fā)明在IBH方面的敘述中詳細(xì)地描述，尚未描述引發(fā)IBH的主要變應(yīng)原，可使用針對(duì)靶向IBH的iMAT抗原模塊的生物信息工程來(lái)電腦模擬評(píng)估某些變應(yīng)原的相關(guān)性(參見(jiàn)本文中實(shí)施例6)。例如，如圖8所顯示，Cul o3的計(jì)算機(jī)模擬及體外功能性HRT測(cè)試結(jié)果似乎顯示Cul o3為主要變應(yīng)原。經(jīng)測(cè)試的大多數(shù)馬(然而并非全部)顯示明顯的抗Cul o3過(guò)敏反應(yīng)。

此點(diǎn)出乎意料，如在其他實(shí)驗(yàn)中，例如，通過(guò)van der Meide等人(Vet J 2014,200:31–37)，不同重組變應(yīng)原在其針對(duì)疾病相關(guān)性中不可區(qū)分：患有IBH的馬中有約80％至90％顯示對(duì)所測(cè)試各種變應(yīng)原敏感。

因此，出乎意料地，在本發(fā)明過(guò)程中，可證實(shí)Cul o3(i)事實(shí)上為IBH的主要變應(yīng)原(即，>50％的動(dòng)物敏化)及(ii)與其他變應(yīng)原相比具優(yōu)越相關(guān)性。

除用于iMAT抗原模塊中外，各個(gè)變應(yīng)原也可以用于通過(guò)在開(kāi)始治療前研究抗該變應(yīng)原的變態(tài)反應(yīng)的強(qiáng)度使得治療成就最佳化。且在整個(gè)治療過(guò)程中，可監(jiān)測(cè)免疫系統(tǒng)的不同組分的變應(yīng)原特異性調(diào)節(jié)，例如，變應(yīng)原特異性IgE及IgG抗體效價(jià)的改變可指示治療和/或預(yù)防效應(yīng)。

因此，計(jì)算機(jī)模擬檢測(cè)到的變應(yīng)原和/或各個(gè)變應(yīng)原特異性免疫球蛋白可用作診斷和/或治療診斷生物標(biāo)記。

實(shí)施例4：馬科目動(dòng)物中IBH的治療性疫苗/預(yù)防

根據(jù)本發(fā)明包含不同抗原模塊的單一iMAT分子或iMAT分子的組合可用于預(yù)防性或治療性地治療患有或意欲處在引起IBH的昆蟲(chóng)叮咬風(fēng)險(xiǎn)中的馬。本發(fā)明iMAT分子可施用至馬的下顎下淋巴結(jié)中(Landholt等人，Vet Rec 2010,167:302-304)。簡(jiǎn)言之，夾住位于淋巴結(jié)上的毛發(fā)并做好手術(shù)準(zhǔn)備。使用觸診和/或超音波引導(dǎo)，將25G針頭插入至淋巴結(jié)中。注射的iMAT分子被吸附至佐劑。佐劑是由(例如)磷酸鋁組成(Brenntag Biosector，丹麥)。iMAT分子原液為小瓶中的375μg/mL蛋白質(zhì)濃度的冷凍溶液，各小瓶裝納500μL，意欲在使用前解凍。

在解凍iMAT分子溶液后，取400μL溶液與例如200μL磷酸鋁凝膠懸浮液混合。讓該最終調(diào)配物在室溫下靜置60分鐘再經(jīng)淋巴內(nèi)注射以容許iMAT分子吸附至例如，將200μL的包含50μg iMAT分子的混合物移至500μL針筒中以用于淋巴結(jié)注射。通常在第0天、第28天及第56天以每次注射介于20μg與50μg(是指僅一或多個(gè)抗原模塊之重量)之間的劑量及iMAT分子首次施用該制劑。

在整個(gè)治療期中和/或于此后，可臨床上通過(guò)定量、半定量或定性評(píng)估皮膚病灶(例如，斷發(fā)、掉發(fā)、結(jié)殼/磨砂及濕區(qū)域)來(lái)研究治療或預(yù)防IBH的療效?？蓪?duì)磨砂/癢的強(qiáng)度評(píng)分。

可將此類臨床參數(shù)與先前IBH季節(jié)中各個(gè)馬的臨床癥狀和/或在開(kāi)始治療干預(yù)前的嚴(yán)重度進(jìn)行比較?；蛘?，與未經(jīng)治療或經(jīng)安慰劑治療的感染IBH的馬的比較證實(shí)iMAT分子介導(dǎo)的治療和/或預(yù)防IBH的臨床癥狀的療效。

例如，利用HRT或(關(guān)于細(xì)節(jié)請(qǐng)參見(jiàn)上述實(shí)施例3)，此類馬的新鮮血液可用于馬的1型變態(tài)反應(yīng)性反應(yīng)的體外激發(fā)測(cè)試。與iMAT分子施用前相比在iMAT分子施用后回應(yīng)于某些庫(kù)蠓變應(yīng)原的挑戰(zhàn)，嗜堿細(xì)胞去顆粒降低，例如組織胺和/或硫化白細(xì)胞三烯釋放指示治療和/或預(yù)防效應(yīng)。

或者或另外，利用某些庫(kù)蠓變應(yīng)原的真皮內(nèi)激發(fā)測(cè)試[Langner等人，Vet Immunol Immunopathol 2008,122(1-2):126-37]可用于此類馬中。降低的反應(yīng)(速發(fā)和/或后期階段反應(yīng)性)指示iMAT分子施用的治療和/或預(yù)防效應(yīng)。

另外，可監(jiān)測(cè)免疫系統(tǒng)不同組分的調(diào)節(jié)，例如，變應(yīng)原特異性IgE及IgG抗體效價(jià)的改變可指示治療和/或預(yù)防效應(yīng)。

利用此類iMAT分子治療馬的IBH時(shí)，除了IgE含量改變外，可出乎意料地發(fā)現(xiàn)變應(yīng)原特異性IgG的增加。此類抗體可阻斷體內(nèi)IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)性反應(yīng)及似乎不僅抑制變應(yīng)原引發(fā)的發(fā)炎介質(zhì)自嗜堿細(xì)胞及肥大細(xì)胞釋放，而且抑制IgE介導(dǎo)的變應(yīng)原對(duì)T細(xì)胞呈遞。在iMAT引起的特異性結(jié)合至變應(yīng)原的IgG抗體中，已表明一些變應(yīng)原特異性亞型發(fā)揮重要“保護(hù)”作用，這是因?yàn)槠渑c變應(yīng)原特異性IgE抗體競(jìng)爭(zhēng)及可通過(guò)抑制IgE介導(dǎo)的抗原呈遞來(lái)防止活化CD4+T細(xì)胞。另外，所分泌的IgG子集促使肥大細(xì)胞及嗜酸細(xì)胞顯著減少，伴隨著發(fā)炎介質(zhì)減少釋放[Senna G等人，Curr Opin Allergy Clin Immunol.2011,11(4):375-380]。

如通過(guò)抑制FcεRI依賴性嗜堿細(xì)胞組織胺釋放測(cè)定的血清“阻斷”IgG活性[Niederberger V等人，Proc Natl Acad Sci U S A 2004,101:14677–14682]和/或抑制FcεRII(CD23)依賴性IgE-變應(yīng)原復(fù)合物與B細(xì)胞結(jié)合的功能分析似乎可更好地預(yù)測(cè)個(gè)別臨床反應(yīng)(Wacholz PA等人，J Allergy Clin Immunol 2003；112:915–922)。

變應(yīng)原特異性免疫治療可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的不同組分。細(xì)胞修飾由降低變應(yīng)原引起的T-細(xì)胞增殖所組成，指示誘導(dǎo)變應(yīng)原特異性T細(xì)胞中的外周耐受性及抗原特異性Th2主導(dǎo)的免疫應(yīng)答的降低，隨著IFN-γ生成增加有利于Th1反應(yīng)(Durham SR等人，J Allergy Clin Immunol 1996,97:1356–1365)。負(fù)責(zé)配位此免疫學(xué)切換的重要細(xì)胞類型為異質(zhì)T-細(xì)胞群體，稱作調(diào)節(jié)T細(xì)胞(T_reg)。在細(xì)胞層級(jí)上，成功的變應(yīng)原免疫治療的關(guān)鍵因素是1型T_reg細(xì)胞的外周誘導(dǎo)。對(duì)在識(shí)別抗原上具特異性的1型T_reg細(xì)胞的功能性研究顯示，通過(guò)1型T_reg細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)Th1及Th2反應(yīng)主要取決于具有免疫抑制特性的細(xì)胞激素IL-10的分泌。事實(shí)上，IL-10抑制外周T細(xì)胞抗特異性變應(yīng)原的增殖反應(yīng)且在誘導(dǎo)T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性中具有重要作用(James LK、Durham SR,Clin Exp Allergy 2008,38:1074–1088)。體外IL-10增進(jìn)調(diào)節(jié)因子FoxP3的表達(dá)，調(diào)節(jié)嗜伊紅血球功能及減少由肥大細(xì)胞釋放之前發(fā)炎性介質(zhì)(Mobs C等人，Int Arch Allergy Immunol 2008,147:171–178)。

經(jīng)此類iMAT分子介導(dǎo)的免疫治療的杰出臨床療效的另一可能標(biāo)記是檢測(cè)變應(yīng)原特異性T細(xì)胞的數(shù)量或性質(zhì)的改變?；?例如)Bet v1四聚物染色研究的基礎(chǔ)上，循環(huán)樺樹(shù)花粉特異性CD4⁺T細(xì)胞的含量及特性可潛在性地在SIT之前及之后進(jìn)行比較(van Overtvelt L等人，J Immunol 2008,180:4514-4522)。最近，轉(zhuǎn)變生長(zhǎng)因子(TGF)-β也已識(shí)別為成功SIT中的重要細(xì)胞激素。諸多作用可說(shuō)明其相關(guān)性，如，特異性Th1、Th2及Th17細(xì)胞的抑制、FoxP3的誘導(dǎo)及Tregs的功能抑制。此外，TGF-β下調(diào)蘭格罕(Langherhans)細(xì)胞上的FcεRI表達(dá)并抑制IgE合成(Akdis CA,Akdis MJ,Allergy Clin Immunol 2009,123:735–746)。

實(shí)施例5：本發(fā)明iMAT分子與根據(jù)WO 2004/035793(US等同申請(qǐng)US 2005/0281816)的現(xiàn)有技術(shù)MAT分子之間的比較

就評(píng)估MAT蛋白質(zhì)的純度而言，已建立十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測(cè)試程序(Thompson J等人，J Biol Chem 2002,277:34310-34331)。該方法包括利用還原劑十二烷基硫酸鋰(LDS)制備樣品及在75℃下加熱，在電泳分離后產(chǎn)生可再現(xiàn)多條明顯譜帶。在負(fù)載有200至1000ng蛋白質(zhì)的凝膠中利用考馬斯藍(lán)(Coomassie blue)染色可提供線性定量(密度測(cè)定法)特征。使用單株抗體，在具有Fel d 1作為變應(yīng)原模塊的MAT分子(MAT-Fel d1)中檢測(cè)變應(yīng)原模塊，已顯示主要譜帶及13條次要譜帶均包含MAT-Fel d1蛋白質(zhì)。小型譜帶也在重新裝載于凝膠上之后遷移到如在初始凝膠上得相同位置(圖2)。在PAGE之前用于制備樣品的數(shù)種不同方法，如不同溫度及緩沖劑組合物方案產(chǎn)生出相同譜帶圖譜。

在所有此類譜帶中，在各譜帶從凝膠中切出之后，通過(guò)胰蛋白酶消化及于隨后通過(guò)質(zhì)譜法(nanoLC/ESI-MS)分析，可證實(shí)存在全長(zhǎng)(完全)MAT-Fel d1蛋白質(zhì)及僅微量的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)。從此類實(shí)驗(yàn)可得出結(jié)論SDS-PAGE中MAT-Fel d1的例如不同折疊變體的異常特征(凝膠遷移)。此意指所分析的制劑中的MAT-Fel d1不適合用作具體而言用于臨床和/或商業(yè)生物醫(yī)藥制造的生物醫(yī)藥分子，這是因?yàn)槠浼兌炔豢捎脴?biāo)準(zhǔn)方法(例如SDS-PAGE)來(lái)測(cè)定，而僅可通過(guò)上文所闡述的改良程序測(cè)定。

與該MAT-Fel d1分子的凝膠遷移現(xiàn)象不同，F(xiàn)el d1本身不顯示SDS PAGE中的該異常特征(圖3，泳道2及3)。Fel d1在預(yù)期分子量(19.6kD)下呈現(xiàn)單一明顯譜帶。

可在RP-HPLC分析中觀察到另一異常特征。在該分析方法中未見(jiàn)到MAT-Fel d1的單峰(圖4)，在蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象中或在通過(guò)離液(chaotropic)及還原條件誘導(dǎo)的變性形式中均未看到。然而，就經(jīng)GMP驗(yàn)證的生物醫(yī)藥制造而言，所銷售醫(yī)藥制劑中生物分子的單一同種型是必需的。

SDS-PAGE及RP-HPLC分析中的此類觀察結(jié)果可通過(guò)基于氨基酸序列的物理化學(xué)性質(zhì)來(lái)解釋。Kyte及Doolittle疏水性圖分析[Kyte J、Doolittle RF,Journal of Molecular Biology 1982,157(1),105-132]顯示相鄰極端疏水性及親水性結(jié)構(gòu)域(圖5)，此可造成此異常行為結(jié)果。

具體而言，融合蛋白質(zhì)的靶向結(jié)構(gòu)與的疏水性區(qū)域類似于現(xiàn)有技術(shù)中已知可引起該異常特征的膜蛋白的跨膜片段[Rath A等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2009,106(6):1760-1765]。

SDS-PAGE上與化學(xué)式分子量無(wú)關(guān)聯(lián)的遷移(稱作“凝膠遷移”)顯示對(duì)于膜蛋白而言常見(jiàn)。此意指僅根據(jù)其分子量分離分子而與其天然2D-或3D結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)的SDS-PAGE方法的先決條件不適用于此類情況。在上文引述的公開(kāi)(PNAS文章)中，作者使用衍生自人囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)子(CFTR)的跨膜片段3及4的野生型及突變體螺旋-環(huán)-螺旋(“發(fā)夾(hairpin)”)序列庫(kù)(包括疾病-表型殘基取代)，來(lái)研究螺旋狀膜蛋白的異常凝膠遷移。其發(fā)現(xiàn)此類發(fā)夾以相對(duì)其實(shí)際化學(xué)式的分子量-10％至+30％的速率在SDS-PAGE上遷移及以范圍自3.4至10g SDS/g蛋白質(zhì)的比裝載清潔劑。其另外證實(shí)突變體凝膠遷移與發(fā)夾SDS裝載能力改變、及發(fā)夾螺旋度有強(qiáng)烈相關(guān)性，指明凝膠遷移行為源自于清潔劑結(jié)合的改變。在某些情況中，此通過(guò)SDS的差別性溶劑化作用可能由于蛋白質(zhì)-清潔劑接觸改為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)接觸替代所引起，此意味著清潔劑結(jié)合及折疊緊密地聯(lián)結(jié)。

MAT及iMAT蛋白質(zhì)的SDS PAGE(圖6)及RP-HPLC分析(圖4及7)分別顯示遷移圖譜或洗脫方面的實(shí)質(zhì)差異。MAT-Fel d1的氧化形式?jīng)]有顯示SDS-PAGE凝膠上單一明顯譜帶(泳道3)，然顯示若干離散的具有比MAT-Fel d1的實(shí)際分子量32.2kD更大及更小表觀分子量的譜帶。相反地，iMAT-Cul o4在氧化條件下展現(xiàn)單一明顯譜帶(M＝41.6kD)。此外，RP-HPLC層析圖顯示單一峰(圖7)。

在還原條件下，SDS-PAGE中的MAT-Fel d1顯示大約在已知分子量處遷移的主要譜帶，但此外圖2中所述已知包含MAT-Fel d1的完全序列的某些次要譜帶再次出現(xiàn)(圖6，泳道6)。這是表征MAT-Fel d1異常特征的屬性。另外，MAT-Fel d1在還原條件下的RP-HPLC層析圖(圖4，右圖)顯示MAT-Fel d1的至少3種不同同型物。相反地，iMAT分子顯示明顯指示SDS-PAGE(圖6，泳道7)及RP-HPLC(圖7)中的單一同型物的特征。

此類還原條件導(dǎo)致MAT分子中的二硫鍵裂解，因此，MAT及iMAT分子在還原條件下的行為應(yīng)相似，假若二硫鍵是唯一造成MAT異常特征的原因。然而，此并非是該種情況，這是因?yàn)樵谶€原條件下仍舊存在MAT分子的異常凝膠遷移及在RP-HPLC中出現(xiàn)同型物。

然而，呈蛋白質(zhì)的天然(氧化)形式的iMAT分子不顯示該凝膠遷移但在RP-HPLC層析圖中展現(xiàn)峰值。另外，MAT及iMAT分子的Kyte-Doolittle圖(Kyte,J.及Doolittle,R.1982.A simple method for displaying the hydropathic character of a protein.J.Mol.Biol.157:105-132)在涵蓋His-標(biāo)簽、TAT及靶向域之序列的N-端處幾近相同(圖11)。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將不欲依照現(xiàn)有技術(shù)改由其他氨基酸殘基取代半胱氨酸殘基以克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)來(lái)建構(gòu)MAT分子。

所產(chǎn)生的三種iMAT分子已通過(guò)依照以下實(shí)施例6的“生物信息工程”程序進(jìn)行建構(gòu)及通過(guò)在大腸桿菌中的重組表達(dá)技術(shù)產(chǎn)生出。所有這三種iMAT分子在凍融兩次后于緩沖液(20mM檸檬酸鹽、1M精氨酸，pH 6.0)中穩(wěn)定及可吸附至作為佐劑的(Brenntag，丹麥)，使得此類iMAT分子可用作疫苗。此類蛋白質(zhì)可自解吸附而不在相同緩沖液系統(tǒng)中降解(圖9)。

實(shí)施例6：靶向馬中IBH的iMAT分子的“生物信息工程”

為例如有效地使用iMAT技術(shù)來(lái)治療患有過(guò)敏性昆蟲(chóng)叮咬變態(tài)反應(yīng)性反應(yīng)(IBH)的馬，進(jìn)一步地強(qiáng)制以：

a)將庫(kù)蠓蛋白質(zhì)選作iMAT分子中的變應(yīng)原模塊，其是主要變應(yīng)原病因此高普遍性地在受感染的馬中引起變態(tài)反應(yīng)性反應(yīng)及因此也可以是用于耐受性誘導(dǎo)的標(biāo)靶，及

b)建構(gòu)具有此類主要變應(yīng)原的iMAT分子，其是熱力學(xué)穩(wěn)定且可有效地通過(guò)蛋白質(zhì)工程制得且可另外利用標(biāo)準(zhǔn)方法分析以確保足夠的質(zhì)量(即，同一性、純度及效力)。

為滿足此類要求，選擇一種生物信息方法以選擇欲包含于本發(fā)明iMAT分子中的變應(yīng)原。選擇的目標(biāo)為(i)選擇一或多種預(yù)期具IBH相關(guān)性的變應(yīng)原(即，患有IBH的馬中大多數(shù)對(duì)各個(gè)變應(yīng)原敏感)，及(ii)選擇具有最高概率的包含變應(yīng)原特征的線性表位的變應(yīng)原，也即，那些已公開(kāi)的變應(yīng)原的包含最大數(shù)目之短肽序列(7至13個(gè)氨基酸殘基)的同系物。

目前，已知來(lái)自庫(kù)蠓屬(沙諾氏庫(kù)蠓(Culicoides sonorensis)、云斑庫(kù)蠓(Culicoides nubeculosus)、不顯庫(kù)蠓(Culicoides obsoletus))的在唾液中發(fā)現(xiàn)的約230種蛋白質(zhì)可潛在地引起對(duì)象例如馬的變態(tài)反應(yīng)。為選擇用于醫(yī)藥制劑的適宜抗原，選擇基于與已知非庫(kù)蠓變應(yīng)原的局部序列比對(duì)的同源性比較。通常，用于抗體識(shí)別的表位(主要是構(gòu)象表位)的檢測(cè)是通過(guò)功能性分析(例如肽微陣列)來(lái)達(dá)成或T-細(xì)胞表位(線性表位)的檢測(cè)是通過(guò)計(jì)算與MHC分子的肽結(jié)合概率來(lái)達(dá)成。iMAT技術(shù)的治療原理具體是以內(nèi)涵體中酸依賴性蛋白酶的內(nèi)吞及降解接著II類MHC結(jié)合及抗原呈遞為基礎(chǔ)。目前馬中此類系統(tǒng)的特征并未全面地進(jìn)行探討，這是因?yàn)榕c人系統(tǒng)相比對(duì)馬MHC基因的等位基因多樣性的研究少得多且因此實(shí)驗(yàn)上無(wú)法輕易地取得。另外，僅在最近開(kāi)始對(duì)呈I類變態(tài)反應(yīng)的IBH及誘導(dǎo)癥狀的病因性變應(yīng)原進(jìn)行研究。直到2008年才描述特征為效應(yīng)細(xì)胞(即，嗜堿細(xì)胞粒細(xì)胞)中變應(yīng)原活性的第一蛋白質(zhì)[Langner等人，Vet Immunol Immunopathol 2008,122(1-2):126-137。

因此，選用不同的用于變應(yīng)原選擇的非實(shí)驗(yàn)但為生物信息的方法，該方法是基于相對(duì)已知非庫(kù)蠓變態(tài)反應(yīng)性蛋白對(duì)衍生自庫(kù)蠓蛋白質(zhì)的肽進(jìn)行局部同源性研究，已知其中的大多數(shù)可使人產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)。從可公開(kāi)取得的數(shù)據(jù)庫(kù)(例如UNIPROT)輸出疑似具有致變態(tài)反應(yīng)性質(zhì)的蛋白質(zhì)氨基酸序列，并通過(guò)分析所輸出數(shù)據(jù)集中的序列同源性來(lái)確定富足性。消除高度同源序列對(duì)應(yīng)物且所得的其余序列作為可能有效抗原的正規(guī)序列數(shù)據(jù)庫(kù)用于隨后分析。為確定具有推定高致變態(tài)反應(yīng)可能性的庫(kù)蠓蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)計(jì)算機(jī)模擬裂解成具有6至15個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽，其中一個(gè)氨基酸移位。接著，在各庫(kù)蠓蛋白質(zhì)及對(duì)應(yīng)肽與正規(guī)序列數(shù)據(jù)庫(kù)之間進(jìn)行局部逐對(duì)比對(duì)。于此之后，通過(guò)設(shè)定給定庫(kù)蠓蛋白質(zhì)相對(duì)一者的自比對(duì)評(píng)分及相應(yīng)地對(duì)應(yīng)肽的比對(duì)對(duì)應(yīng)來(lái)進(jìn)行所獲得比對(duì)對(duì)應(yīng)的縮放。接著，對(duì)各肽計(jì)數(shù)超出給定閾值的比對(duì)對(duì)應(yīng)數(shù)量及以局部逐對(duì)比對(duì)方式與不具有已知致變態(tài)反應(yīng)性質(zhì)的隨機(jī)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，并于隨后縮放并計(jì)數(shù)。所得“非變態(tài)反應(yīng)性蛋白質(zhì)”計(jì)數(shù)是從變應(yīng)原結(jié)果中其計(jì)數(shù)被減去及基于所有對(duì)應(yīng)肽的對(duì)應(yīng)數(shù)量來(lái)計(jì)算得各庫(kù)蠓蛋白質(zhì)的累積對(duì)應(yīng)評(píng)分(圖12)。具有最高計(jì)數(shù)的蛋白質(zhì)選作候選iMAT抗原模塊。

就驗(yàn)證生物信息抗原選擇方法而言，在13只患有臨床確診的IBH的馬中測(cè)量抗5種庫(kù)蠓變應(yīng)原的致敏化發(fā)生。在半定量功能性體外實(shí)驗(yàn)中，以釋放自血液樣品分離的馬嗜堿細(xì)胞的變應(yīng)原特異性組織胺為基礎(chǔ)，來(lái)測(cè)試所有選定抗原(組織胺釋放測(cè)試＝HRT，實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)內(nèi)容：參見(jiàn)實(shí)施例2)。以3種濃度測(cè)試重組變應(yīng)原且各變應(yīng)原的評(píng)分值范圍在0(無(wú)敏化)至6(最高敏化)之間。將所有13只馬的數(shù)據(jù)與生物信息計(jì)算結(jié)果比較(圖8)。該分析顯示致敏化(每一變應(yīng)原群組的總體評(píng)分值)與預(yù)測(cè)評(píng)分之間的極佳總體相關(guān)性(r＝0.97)。從該相關(guān)性分析可得出的結(jié)論是，生物信息抗原選擇方法適用于選擇相關(guān)庫(kù)蠓變應(yīng)原用于iMAT分子中的抗原模塊。因此，感染IBH的馬可利用根據(jù)本發(fā)明的包含選定變應(yīng)原的iMAT分子進(jìn)行治療以在大比例的患病對(duì)象子群中以高概率誘導(dǎo)抗此類變應(yīng)原的耐受性。

已基于生物信息分析選擇3種變應(yīng)原以意欲包含于三種不同iMAT分子(即，Cul o3、Cul o2及Cul o4)中。

將每個(gè)選定的變應(yīng)原作為抗原模塊整合入單獨(dú)iMAT分子中并于隨后通過(guò)三維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的迭代建模并計(jì)算單氨基酸取代后自由能改變，從而將熱動(dòng)力穩(wěn)定性優(yōu)化。通過(guò)于一級(jí)氨基酸序列中取代不同氨基酸殘基，可影響物理化學(xué)性質(zhì)及穩(wěn)定性。

將本文所述分析(抗原研究及模型化)的結(jié)果轉(zhuǎn)換成適用于馬科動(dòng)物的藥理學(xué)制造及應(yīng)用的iMAT氨基酸序列中以治療(例如)IBH。

實(shí)施例7：根據(jù)本發(fā)明的類鑲嵌iMAT分子的構(gòu)建

如果多于一種變應(yīng)原的組分包含于抗原模塊中，則預(yù)期可進(jìn)一步改良本發(fā)明iMAT分子。就此目的而言，可以不同方式應(yīng)用上述生物信息選擇方法(實(shí)施例6)的基本原理。代替基于在變應(yīng)原數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的變應(yīng)原肽的對(duì)應(yīng)計(jì)數(shù)來(lái)選擇完全變應(yīng)原，僅使用數(shù)種此類變應(yīng)原的最富足的肽來(lái)改造iMAT抗原分子。因此，該iMAT分子由源于數(shù)種變應(yīng)原的肽的抗原模塊組成。此容許加寬單一iMAT分子在就其靶向變態(tài)反應(yīng)特性方面的范圍并因此對(duì)藥理學(xué)藥物開(kāi)發(fā)有益。

為尋求具有該類鑲嵌iMAT蛋白質(zhì)資格的短肽序列，通過(guò)如上文所述的同源性比較(參見(jiàn)實(shí)施例6)來(lái)分析在唾液中發(fā)現(xiàn)的衍生自庫(kù)蠓物種(沙諾氏庫(kù)蠓、云斑庫(kù)蠓、不顯庫(kù)蠓)的230種蛋白質(zhì)。簡(jiǎn)言之，將經(jīng)計(jì)算機(jī)模擬裂解的具有6至15個(gè)氨基酸殘基的肽長(zhǎng)度的庫(kù)蠓蛋白質(zhì)局部地與變應(yīng)原相關(guān)蛋白質(zhì)的正規(guī)序列數(shù)據(jù)庫(kù)及非變態(tài)反應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)的隨機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。確定在正規(guī)數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的各肽的顯著同源性差異數(shù)。隨后，將各肽局部地與大小三倍于正規(guī)數(shù)據(jù)庫(kù)的隨機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)以減少假陽(yáng)性對(duì)應(yīng)。各肽長(zhǎng)度的殘余同源性的頂部(例如，前10％)尤其適合作為用于構(gòu)建帶有類鑲嵌或混合變應(yīng)原的iMAT分子的基底。為構(gòu)建類鑲嵌iMAT分子，將蛋白質(zhì)前體選擇(例如，從對(duì)應(yīng)于最高等級(jí)肽的之前體蛋白質(zhì)清單)作為用于包埋最高等級(jí)肽的骨架蛋白質(zhì)。自骨架蛋白質(zhì)移除信號(hào)肽序列及可將具有額外相鄰N-或C-端氨基酸的最高等級(jí)肽插入至骨架蛋白質(zhì)的初始序列中或可替代骨架蛋白質(zhì)的初始序列部分。使用相似比對(duì)或?qū)?yīng)前體蛋白質(zhì)中肽的參考位置來(lái)確定插入或取代的位置。作為下一步驟，新增His-標(biāo)簽、TAT及靶向域。最終，如上所述改由最穩(wěn)定的殘基取代半胱氨酸殘基。

在該方法的示例性實(shí)例中，將沙諾氏庫(kù)蠓(UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)條目“Q66U13”)的唾液蛋白質(zhì)用作骨架蛋白質(zhì)。確定該蛋白質(zhì)中最具致變態(tài)反應(yīng)性的結(jié)構(gòu)以保留序列的該部分。移除信號(hào)肽序列及于隨后新增UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)條目“Q5QBI9”、“Q5QBK6”、“Q5QBL6”、“Q5QBJ4”及“Q5QBI2”的序列。之后，將類鑲嵌變應(yīng)原整合至iMAT一般分子結(jié)構(gòu)中。最終，半胱氨酸殘基改由其他氨基酸殘基，優(yōu)選絲氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和/或天冬氨酸取代，這不減損所構(gòu)建iMAT分子(融合蛋白質(zhì))的穩(wěn)定性。

SEQ ID NO:17描繪了根據(jù)本發(fā)明得示例性類鑲嵌(混合)iMAT分子的整體序列[氨基酸殘基1：N-端甲硫氨酸，氨基酸殘基2至7：His-標(biāo)簽，氨基酸殘基8至18：TAT序列，氨基酸殘基19至128：靶向結(jié)構(gòu)域，氨基酸殘基129至333：混合變應(yīng)原(不含信號(hào)肽及經(jīng)插入/取代序列的骨架蛋白質(zhì)Q66U13；經(jīng)插入/取代之序列：氨基酸殘基137至151：Q5QBI9；氨基酸殘基155至166：Q66U13；氨基酸殘基185至200：Q5QBK6；氨基酸殘基215至229：Q5QBL6：氨基酸殘基235至250；Q5QBL6；氨基酸殘基265至278：Q5QBJ4；氨基酸殘基318至333：Q5QBI2；經(jīng)取代的半胱氨酸(絲氨酸)：46、146、158、173、222、225、246、273、283、329；經(jīng)取代的半胱氨酸(亮氨酸)：295；經(jīng)取代的半胱氨酸(異亮氨酸)：299；經(jīng)取代的半胱氨酸(天冬氨酸)：181]。

實(shí)施例8：馬科動(dòng)物中復(fù)發(fā)性氣管阻塞(RAO)的治療性疫苗/預(yù)防

根據(jù)本發(fā)明的包含不同抗原模塊的單一iMAT分子或iMAT分子的組合可用于預(yù)防性或治療性地治療患有或處在RAO和/或與夏日放牧飼養(yǎng)相關(guān)聯(lián)RAO風(fēng)險(xiǎn)的馬。在馬中，可如實(shí)施例4中所述施用本發(fā)明iMAT分子。

將使用具有已知RAO病史的成年馬。在治療之前，馬經(jīng)調(diào)理(例如)以使其在原地穿戴面罩站立而可實(shí)現(xiàn)全身氣管檢查，包括呼吸速度描記器測(cè)量、上氣管內(nèi)視鏡及支氣管肺泡灌洗(BAL)以分析例如BAL流體中嗜中性細(xì)胞百分比。進(jìn)行全血計(jì)數(shù)及生物化學(xué)特性以排除相伴醫(yī)學(xué)病狀的存在。

可研究以下參數(shù)以檢查呼吸系統(tǒng)并測(cè)量以iMAT分子的治療性和/或預(yù)防性治療的療效：肺功能變量例如呼吸速率、最大經(jīng)肺壓力、肺抗性、肺彈性的改變。另外，參數(shù)可并入至加權(quán)臨床評(píng)分系統(tǒng)中，例如，也評(píng)估呼吸努力(breathing effort)/抬高腹部、流鼻涕和/或鼻翼?yè)亜?dòng)、咳嗽和/或肺功能異常、支氣管和/或氣管音的臨床評(píng)分。

因此，貫穿治療期間和/或之后，可臨床上通過(guò)定量、半定量或定性評(píng)估來(lái)研究治療或預(yù)防RAO的療效。

可將此類臨床參數(shù)與在先前季節(jié)個(gè)別馬的臨床癥狀和/或在開(kāi)始治療干預(yù)之前的嚴(yán)重度進(jìn)行比較。或者，與未經(jīng)治療或經(jīng)安慰劑治療的感染RAO的馬的比較可證實(shí)，iMAT分子介導(dǎo)的治療和/或預(yù)防RAO臨床癥狀的療效。

此類馬的支氣管肺泡灌洗(BAL)流體和/或新鮮血液可(例如)利用HRT或用于針對(duì)馬的1型變態(tài)反應(yīng)性反應(yīng)的體外激發(fā)測(cè)試中(關(guān)于詳細(xì)內(nèi)容請(qǐng)參見(jiàn)實(shí)施例2和/或Hare等人的Can J Vet Res 1998；62:133-139)。與在iMAT分子治療之前相比，在iMAT分子治療之后，響應(yīng)于某些變應(yīng)原挑戰(zhàn)的肺肥大細(xì)胞和/或嗜堿細(xì)胞去顆粒減少，例如組織胺和/或硫化白細(xì)胞三烯釋放，指示治療和/或預(yù)防效應(yīng)。

或者或另外，利用某些重組變應(yīng)原，可在此類馬中監(jiān)測(cè)真皮內(nèi)激發(fā)測(cè)試、皮膚刺傷測(cè)試或者BAL流體或血清中變應(yīng)原特異性IgE和/或IgG測(cè)定(Tilley P等人，J Equine Vet Sci 2012,32:719-727)。降低的反應(yīng)(速發(fā)和/或后期階段反應(yīng)性)和/或抗體效價(jià)的改變指示iMAT分子治療的治療和/或預(yù)防效應(yīng)。

參考文獻(xiàn)

(1)Akdis CA,Akdis MJ,Allergy Clin Immunol 2009,123:735–746

(2)Allergome(www.allergome.org)

(3)Durham SR et al.,J Allergy Clin Immunol 1996,97:1356–1365

(4)Gadermaier G et al.,Molecular Immunology 2010,47:1292-1298

(5)Ginel PJ et al.,Vet.Dermatol.2014,25(1):29-e10

(6)Hare JE et al.,Can J Vet Res 1998,62:133-139

(7)James LK,Durham SR,Clin Exp Allergy 2008,38:1074–1088

(8)Kaul,S.,Type I allergies in the horse:Basic development of a histamine release test(HRT).Doctoral thesis.Veterinary School Hannover 1998,Germany

(9)Kehrli D et al,J Vet Intern Med 2015,29(1):320-326

(10)Kelley J et al.,Immunogenetics 2005,56:683–695

(11)Klein JS et al.,Protein Eng Des Sel 2014,27(10):325-330

(12)Kyte J,Doolittle RF,Journal of Molecular Biology 1982,157(1):105-132

(13)Landholt GA et al.,Vet Rec 2010,167:302-304

(14)Langner K et al.,Vet Immunol Immunopathol 2008,122(1-2):126-137

(15)Leclere M et al.,Respirology 2011,16:1027–1046

(16)Martínez-Gómez JM et al.,Allergy 2009,64(1):172-178

(17)Mobs C,et al.,Int Arch Allergy Immunol 2008,147:171–178

(18)Niederberger V et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 2004,101:14677–14682

(19)Olsen L et al.,Vet.J.2011,187:347–351

(20)Pires DE et al..Bioinformatics 2014,30(3):335-342

(21)Pirie RS,Equine Vet J 2014,46:276–288

(22)Rath A et al.,PNAS 2009,106(6):1760-1765

(23)Report of the 3^rd Havemeyer workshop on allergenic diseases of the Horse,Hólar,Iceland,June 2007,Veterinary Immunology and Immunotherapy 2008,126:351-361

(24)Rose H,Arb Paul Ehrlich Inst Bundesinstitut Impfstoffe Biomed Arzneim Langen Hess 2009,96:319-327

(25)Schaffartzik A et al.,Veterinary Immunology and Immunopathology 2012,147:113-126

(26)Senna G et al.,Curr Opin Allergy Clin Immunol.2011,11(4):375-380

(27)Senti G et al.,J Allergy Clin Immunol.2012,129(5):1290-1296

(28)SIAF Annual Report 2010

(29)SIAF Annual Report 2011

(30)Tilley P et al.,J Equine Vet Sci 2012,32:719-727

(31)US 2005/0281816

(32)US 2014/0105906

(33)US 7,653,866

(34)van Bargen,K and Haas,A.FEMS Microbiol Rev 2009,33:870–891

(35)van der Meide N et al.,Vet J 2014,200:31–37

(36)van Overtvelt L et al.,J Immunol 2008,180:4514-4522

(37)Vazquez-Boland,JA et al.,Vet Microbiol 2013,167:9–33

(38)Wacholz PA et al.,J Allergy Clin Immunol 2003；112:915–922

(39)WO 2004/035793

在序列表中：

SEQ ID NO:1涉及本發(fā)明的一個(gè)移位模塊仍具功能性的適宜最短氨基酸序列，所述具功能性也即可有效地促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入；

SEQ ID NO:2涉及完全馬不變鏈氨基酸序列；

SEQ ID NO:3涉及完全Cul n4變應(yīng)原氨基酸序列；

SEQ ID NO:4涉及完全Cul o1變應(yīng)原氨基酸序列；

SEQ ID NO:5涉及完全Cul o2變應(yīng)原氨基酸序列；

SEQ ID NO:6涉及完全Cul o3變應(yīng)原氨基酸序列；

SEQ ID NO:7涉及本發(fā)明的Cul n4 iMAT分子；

SEQ ID NO:8涉及本發(fā)明的Cul n4 iMAT分子；

SEQ ID NO:9涉及本發(fā)明的Cul o1 iMAT分子；

SEQ ID NO:10涉及本發(fā)明的Cul o1 iMAT分子；

SEQ ID NO:11涉及本發(fā)明的Cul o2 iMAT分子；

SEQ ID NO:12涉及本發(fā)明的Cul o2 iMAT分子；

SEQ ID NO:13涉及本發(fā)明的Cul o3 iMAT分子；

SEQ ID NO:14涉及本發(fā)明的Cul o3 iMAT分子；

SEQ ID NO:15涉及馬不變鏈氨基酸序列具有維持細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)功能的具體片段；

SEQ ID NO:16涉及馬不變鏈氨基酸序列具有維持細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)功能的具體片段；

SEQ ID NO:17涉及本發(fā)明的示例性類鑲嵌iMAT分子的完整序列；

SEQ ID NO:18涉及完全Cul o4變應(yīng)原氨基酸序列；

SEQ ID NO:19涉及完全Cul o7變應(yīng)原氨基酸序列；

SEQ ID NO:20涉及本發(fā)明的Cul o4 iMAT分子；

SEQ ID NO:21涉及本發(fā)明的Cul o4 iMAT分子；

SEQ ID NO:22涉及本發(fā)明的Cul o7 iMAT分子；

SEQ ID NO:23涉及本發(fā)明的Cul o7 iMAT分子。

本文所引述的所有現(xiàn)有技術(shù)參考及隨附本申請(qǐng)的序列表彼此獨(dú)立地以其全文引用之方式并入本文中。

條目：

1.經(jīng)分離的重組蛋白質(zhì)，其包含至少可自細(xì)胞外空間轉(zhuǎn)運(yùn)重組蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部中的第一模塊、至少可細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)重組蛋白質(zhì)至參與加工抗原或使MHC分子加載抗原的細(xì)胞器的第二模塊、及至少確定對(duì)象中通過(guò)該重組蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的免疫應(yīng)答的特異性的抗原模塊，其中此類模塊彼此共價(jià)連接，任選在至少一個(gè)此類模塊之間包含間隔模塊，其中

a.)該第一模塊是使自細(xì)胞外空間移位進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部中的氨基酸序列，

b.)該第二模塊事使得該重組蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)物種特異性靶向參與加工抗原和/或使MHC分子加載抗原的細(xì)胞器的氨基酸序列，

c.)該抗原模塊是衍生自抗原(變應(yīng)原)的至少一個(gè)表位的氨基酸序列，

其中至少在該抗原模塊中，所述經(jīng)分離重組蛋白質(zhì)中的至少一個(gè)半胱氨酸殘基經(jīng)絲氨酸或不同氨基酸殘基取代。

2.根據(jù)條目1的經(jīng)分離重組蛋白質(zhì)，其中在所述抗原模塊或在整個(gè)經(jīng)分離重組蛋白質(zhì)中，所有半胱氨酸殘基經(jīng)不同的氨基酸殘基取代。

3.根據(jù)條目1或2的經(jīng)分離重組蛋白質(zhì)，其中所述半胱氨酸殘基是經(jīng)絲氨酸殘基取代。

4.根據(jù)條目1或2的經(jīng)分離重組蛋白質(zhì)，其中所述第二模塊為馬科動(dòng)物不變鏈，如SEQ ID.No：2、15、16的氨基酸序列，和/或該抗原模塊包含衍生自引起馬科動(dòng)物過(guò)敏的變應(yīng)原的表位。

5.根據(jù)條目1或2的經(jīng)分離重組蛋白質(zhì)，其中所述抗原模塊包含衍生自食血昆蟲(chóng)，具體而言衍生自庫(kù)蠓亞屬的變應(yīng)原的至少一個(gè)表位。

6.根據(jù)前述條目中任一條目的經(jīng)分離重組蛋白質(zhì)，其中所述變應(yīng)原為Cul n 4、Cul o 1、Cul o 2或Cul o 3變應(yīng)原中的至少一種。

7.根據(jù)前述條目中任一條目的重組蛋白質(zhì)，其進(jìn)一步包含標(biāo)簽?zāi)K，例如His-標(biāo)簽，其中所述標(biāo)簽?zāi)K可存在于N-端和/或C-端。

8.根據(jù)前述條目中任一條目的經(jīng)分離重組蛋白質(zhì)，其中所述第一模塊為HIV-tat、VP22或觸角足蛋白(Antennapedia)或其功能為用作移位模塊的部分序列。

9.根據(jù)前述條目中任一條目的經(jīng)分離重組蛋白質(zhì)，其以單體形式存在。

10.根據(jù)前述條目中任一條目的經(jīng)分離重組蛋白質(zhì)，其以線性形式存在。

11.根據(jù)前述條目中任一條目的經(jīng)分離重組蛋白質(zhì)，其包含Seq.ID-No：7至14的序列的任何之一或者由其所組成。

12.根據(jù)前述條目中任一條目的經(jīng)分離重組蛋白質(zhì)，其用于醫(yī)藥組合物中。

13.用于條目12用途的經(jīng)分離重組蛋白質(zhì)，其中所述醫(yī)藥組合物為疫苗。

14.用于條目12至13中任一條目用途的經(jīng)分離重組蛋白質(zhì)，其設(shè)計(jì)用于舌下施用、皮下或皮內(nèi)注射、注射至淋巴結(jié)中或用于經(jīng)粘膜施用(具體而言經(jīng)胃腸道或呼吸系統(tǒng)的粘膜施用)。

15.編碼根據(jù)條目1至11中任一條目的經(jīng)分離重組蛋白質(zhì)的核酸。

16.包含至少一種根據(jù)條目15的核酸序列的載體。

17.原代細(xì)胞或細(xì)胞系，其包含至少一種根據(jù)條目15所要求保護(hù)的載體或根據(jù)條目15的核酸。

18.識(shí)別預(yù)先確定的氨基酸序列中使得所述預(yù)先確定的氨基酸序列穩(wěn)定化的氨基酸取代的方法，該方法包括以下步驟：

i.將靶向蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型化；

ii.基于單點(diǎn)取代(如由不同氨基酸殘基取代半胱氨酸)迭代(iterative)測(cè)定蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，并評(píng)分以通過(guò)分析所有可用的三維結(jié)構(gòu)來(lái)確定穩(wěn)定化取代；

iii.將新結(jié)構(gòu)再模型化并通過(guò)重復(fù)步驟i.)及ii.)驗(yàn)證穩(wěn)定性。

19.根據(jù)條目18的方法，其中在步驟ii.)中，評(píng)估折疊自由能的改變。

20.根據(jù)條目18或19的方法，其中在步驟ii.)中，出現(xiàn)特異性取代的次數(shù)，使用基于在所使用模型中出現(xiàn)率及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性自由能改變?chǔ)う而對(duì)置換分級(jí)的評(píng)分系統(tǒng)。

21.根據(jù)條目1至11中任一條目的重組蛋白質(zhì)，其通過(guò)條目18至20中任一條目的方法獲。

22.根據(jù)條目1至14中任一條目的重組蛋白質(zhì)，其用于預(yù)防和/或治療馬科動(dòng)物的昆蟲(chóng)叮咬過(guò)敏反應(yīng)。