本發(fā)明涉及輪狀病毒，尤其是人輪狀病毒毒種毒株的分離、培養(yǎng)和鑒定。

背景技術(shù)：

滅活輪狀病毒疫苗是一種安全有效地預(yù)防兒童因感染輪狀病毒所引起疾病的疫苗。但至今仍未有滅活輪狀病毒疫苗產(chǎn)品上市。目前臨床前研究或投放市場(chǎng)的輪狀病毒疫苗均為口服減毒活疫苗，減毒活疫苗盡管有一定效果，但在安全性方面存在缺陷，例如引發(fā)腸套疊和毒力回復(fù)突變及產(chǎn)生新的變異株的風(fēng)險(xiǎn)；以及冷鏈保存系統(tǒng)要求費(fèi)用高，因此，研制安全、有效的滅活輪狀病毒疫苗不僅在避免減毒活疫苗使用中存在的問(wèn)題方面具有優(yōu)勢(shì)，也為未來(lái)研制聯(lián)合疫苗提供基礎(chǔ)。綜上所述，研制滅活輪狀病毒疫苗具有重要意義及應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種人源性輪狀病毒野生型單一純化毒株，該毒株病毒復(fù)制能力強(qiáng)，遺傳穩(wěn)定性好；該毒種可應(yīng)用于開(kāi)發(fā)人用輪狀病毒疫苗的生產(chǎn)毒種，適用包括減毒型輪狀病毒口服疫苗及滅活型人輪狀病毒注射疫苗；并提供上述毒株的分離、培養(yǎng)和鑒定方法。

本發(fā)明公開(kāi)了一種人輪狀病毒毒種毒株，其特征在于為人輪狀病毒毒種ztr-18毒株，已于2015年10月16日向中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（cgmcc）提交保藏，編號(hào)：11288，分類(lèi)命名：輪狀病毒rotavirusa。

本發(fā)明所涉及ztr-18毒株的分離方法：

（1）獲取病毒樣本

收集醫(yī)院兒科腹瀉病患幼兒腹瀉排泄物標(biāo)本，重懸于0.01mpbs，ph7.2溶液中，12000g離心20分鐘取上清液，并使用0.22μm濾器除菌過(guò)濾，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）ztr-18毒株病毒在ma104細(xì)胞上的適應(yīng)

采用0.25%胰酶-edta消化已形成單層的p64代ma104細(xì)胞，待細(xì)胞經(jīng)消化形成單個(gè)后，以deme-8%bcs重懸細(xì)胞，稀釋至10^5.0細(xì)胞/ml，按2×10^5.0細(xì)胞/瓶接種小方瓶，37℃培養(yǎng)3～4天后，將輪狀病毒感染的患兒腹瀉樣本稀釋液200μl接種于細(xì)胞單層，37℃吸附2小時(shí)，隨后加入不含小牛血清的dmem細(xì)胞維持液，37℃培養(yǎng)并觀察細(xì)胞病變，至3～4天出現(xiàn)細(xì)胞病變后，收獲培養(yǎng)物后繼續(xù)同法接種ma104細(xì)胞傳代或凍存?zhèn)溆茫?/p>

在本發(fā)明的輪狀病毒分離方法中，通過(guò)改良傳統(tǒng)輪狀病毒分離方法，采用11300×g離心30分鐘取上清液，并采用100k超濾膜包濃縮15倍體積，獲得較高的病毒回收得率和除雜效果，37℃培養(yǎng)并觀察細(xì)胞病變，改善了輪狀病毒初代培養(yǎng)效率。

本發(fā)明所涉及ztr-18毒株的培養(yǎng)方法：

（1）ztr-18毒株病毒在vero細(xì)胞上的適應(yīng)：

采用0.25%胰酶-0.01%edta消化已形成單層的p148代vero細(xì)胞，并以dmem-8%bcs重懸細(xì)胞，按10^5.0細(xì)胞/瓶接種小方瓶，37℃培養(yǎng)3～4天至形成致密細(xì)胞單層后，接種原ma104細(xì)胞收獲的病毒液1ml，接種量約為10^5.0～10^6.0ccid50/ml，37℃吸附2小時(shí)，隨后加入不含小牛血清的dmem細(xì)胞維持液，37℃培養(yǎng)并觀察細(xì)胞病變，收獲培養(yǎng)物后繼續(xù)同法接種vero細(xì)胞傳代或凍存?zhèn)溆茫?/p>

本發(fā)明涉及的輪狀病毒培養(yǎng)及制備方法是基于傳統(tǒng)病毒型疫苗毒種制備的方法進(jìn)行適應(yīng)于新基因型人輪狀病毒的改良。

本發(fā)明所涉及ztr-18毒種的鑒定方法：

（1）ztr-18毒株病毒滴度測(cè)定：

取毒種10倍系列稀釋?zhuān)臃Nma104單層細(xì)胞進(jìn)行病毒pfu滴定，按10^5.0細(xì)胞/1000μl/孔加入ma104細(xì)胞至6孔培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)3～4天細(xì)胞生長(zhǎng)為致密單層，加入10倍系列稀釋的毒種，每個(gè)稀釋度2個(gè)孔，37℃吸附1小時(shí)后加入不含小牛血清的dmem細(xì)胞維持液，加入1.0%瓊脂糖凝膠，37℃培養(yǎng)3天，加入1.0%含0.02mg/ml終濃度的中性紅瓊脂糖凝膠，37℃繼續(xù)倒置培養(yǎng)4天，觀察結(jié)果；

（2）中和鑒別實(shí)驗(yàn)：

將分離毒株病毒抗血清按梯度稀釋后，100μl/孔接入96孔平底組織培養(yǎng)板，加入梯度稀釋的收獲病毒，37℃co2孵箱中和1小時(shí)后，按104細(xì)胞/100μl/孔加入經(jīng)消化懸浮的vero細(xì)胞，37℃co2孵箱中培養(yǎng)8～10天，觀察結(jié)果；

（3）ztr-18毒株病毒基因組核酸及逆轉(zhuǎn)錄、cdna質(zhì)粒構(gòu)建：

病毒基因組的核酸提取按takaraminibest病毒基因組rna提取試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行，病毒基因rna逆轉(zhuǎn)錄使用takaraonesteprt-pcr試劑盒，按操作手冊(cè)進(jìn)行，并根據(jù)a組輪狀病毒g3型基因型全基因序列設(shè)計(jì)合成針對(duì)11個(gè)rna片段的11對(duì)引物，并分段以rt-pcr方法獲得11個(gè)cdna基因片段，克隆入pmd19-t載體中，逐一進(jìn)行測(cè)序；

本發(fā)明涉及的輪狀病毒毒種鑒定方法是基于傳統(tǒng)病毒型疫苗毒種制備的方法進(jìn)行適應(yīng)于人輪狀病毒的改良。其中病毒滴度的檢測(cè)方法改良pfu檢測(cè)方法。

附圖說(shuō)明

圖1電子顯微鏡下的輪狀病毒形態(tài)。

圖2部分腹瀉病例排泄物輪狀病毒基因組page電泳檢測(cè)。

圖3分離毒株ztr-18在ma104細(xì)胞上傳代培養(yǎng)情況。

圖4正常ma104細(xì)胞及分離毒株ztr-18在細(xì)胞上的病變情況，圖中a:正常ma104細(xì)胞，b:ztr-18毒株在ma104細(xì)胞上的病變。

圖5分離毒株ztr-18傳代page基因組電泳圖。

圖6ztr-18毒株傳代rt-pcr擴(kuò)增輪狀病毒特異性vp7基因電泳圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1、如圖1-6所示

1、ztr-18毒株的分離方法：

（1）獲取病毒樣本

收集醫(yī)院兒科腹瀉病患幼兒腹瀉排泄物標(biāo)本，重懸于0.01mpbs，ph7.2溶液中，12000g離心20分鐘取上清液，并使用0.22μm濾器除菌過(guò)濾，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）ztr-18毒株病毒在ma104細(xì)胞上的適應(yīng)

采用0.25%胰酶-edta消化已形成單層的p64代ma104細(xì)胞，待細(xì)胞經(jīng)消化形成單個(gè)后，以deme-8%bcs重懸細(xì)胞，稀釋至10^5.0細(xì)胞/ml，按2×10^5.0細(xì)胞/瓶接種小方瓶，37℃培養(yǎng)3～4天后，將輪狀病毒感染的患兒腹瀉樣本稀釋液200μl接種于細(xì)胞單層，37℃吸附2小時(shí)，隨后加入不含小牛血清的dmem細(xì)胞維持液，37℃培養(yǎng)并觀察細(xì)胞病變，至3～4天出現(xiàn)細(xì)胞病變后，收獲培養(yǎng)物后繼續(xù)同法接種ma104細(xì)胞傳代或凍存?zhèn)溆茫?/p>

在本發(fā)明的輪狀病毒分離方法中，通過(guò)改良傳統(tǒng)輪狀病毒分離方法，采用11300×g離心30分鐘取上清液，并采用100k超濾膜包濃縮15倍體積，獲得較高的病毒回收得率和除雜效果，37℃培養(yǎng)并觀察細(xì)胞病變，改善了輪狀病毒初代培養(yǎng)效率。

2、ztr-18毒株的培養(yǎng)方法：

（1）ztr-18毒株病毒在vero細(xì)胞上的適應(yīng)：

采用0.25%胰酶-0.01%edta消化已形成單層的p148代vero細(xì)胞，并以dmem-8%bcs重懸細(xì)胞，按10^5.0細(xì)胞/瓶接種小方瓶，37℃培養(yǎng)3～4天至形成致密細(xì)胞單層后，接種原ma104細(xì)胞收獲的病毒液1ml，接種量約為10^5.0～10^6.0ccid50/ml，37℃吸附2小時(shí)，隨后加入不含小牛血清的dmem細(xì)胞維持液，37℃培養(yǎng)并觀察細(xì)胞病變，收獲培養(yǎng)物后繼續(xù)同法接種vero細(xì)胞傳代或凍存?zhèn)溆茫?/p>

本發(fā)明涉及的輪狀病毒培養(yǎng)及制備方法是基于傳統(tǒng)病毒型疫苗毒種制備的方法進(jìn)行適應(yīng)于新基因型人輪狀病毒的改良。

3、ztr-18毒種的鑒定方法：

（1）ztr-18毒株病毒滴度測(cè)定：

取毒種10倍系列稀釋?zhuān)臃Nma104單層細(xì)胞進(jìn)行病毒pfu滴定，按10^5.0細(xì)胞/1000μl/孔加入ma104細(xì)胞至6孔培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)3～4天細(xì)胞生長(zhǎng)為致密單層，加入10倍系列稀釋的毒種，每個(gè)稀釋度2個(gè)孔，37℃吸附1小時(shí)后加入不含小牛血清的dmem細(xì)胞維持液，加入1.0%瓊脂糖凝膠，37℃培養(yǎng)3天，加入1.0%含0.02mg/ml終濃度的中性紅瓊脂糖凝膠，37℃繼續(xù)倒置培養(yǎng)4天，觀察結(jié)果；

（2）中和鑒別實(shí)驗(yàn)：

將分離毒株病毒抗血清按梯度稀釋后，100μl/孔接入96孔平底組織培養(yǎng)板，加入梯度稀釋的收獲病毒，37℃co2孵箱中和1小時(shí)后，按104細(xì)胞/100μl/孔加入經(jīng)消化懸浮的vero細(xì)胞，37℃co2孵箱中培養(yǎng)8～10天，觀察結(jié)果；

（3）ztr-18毒株病毒基因組核酸及逆轉(zhuǎn)錄、cdna質(zhì)粒構(gòu)建：

病毒基因組的核酸提取按takaraminibest病毒基因組rna提取試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行，病毒基因rna逆轉(zhuǎn)錄使用takaraonesteprt-pcr試劑盒，按操作手冊(cè)進(jìn)行，并根據(jù)a組輪狀病毒g3型基因型全基因序列設(shè)計(jì)合成針對(duì)11個(gè)rna片段的11對(duì)引物，并分段以rt-pcr方法獲得11個(gè)cdna基因片段，克隆入pmd19-t載體中，逐一進(jìn)行測(cè)序；

4、ztr-18毒種的免疫效力評(píng)價(jià)方法：

（1）輪狀病毒疫苗樣品免疫原性分析

為了解輪狀病毒疫苗樣品免疫原性的變化情況，選取第5代病毒收獲液，經(jīng)純化滅活制備為免疫用疫苗樣品后，以40e.u./100μl、80e.u./100μl、160e.u./100μl（rotaviruselisaunit）三個(gè)劑量，每個(gè)劑量肌內(nèi)注射6只小鼠（balb/c品系，體重約16g，年齡約3個(gè)月，公母?jìng)€(gè)半），陰性對(duì)照6只注射pbs100μl。免疫后2、4、6、8周取血分離血清進(jìn)行血清抗體elisa效價(jià)分析。

（2）輪狀病毒疫苗樣品免疫效力分析

為了解輪狀病毒疫苗樣品免疫原性的變化情況，選取第5代病毒收獲液，經(jīng)純化滅活制備為免疫用疫苗樣品后，以40e.u./100μl、80e.u./100μl、160e.u./100μl（rotaviruselisaunit）三個(gè)劑量，每個(gè)劑量肌內(nèi)注射6只小鼠（balb/c品系，體重約16g，年齡約3個(gè)月，公母?jìng)€(gè)半），陰性對(duì)照6只注射pbs100μl。免疫后2、4、6、8周取血分離血清進(jìn)行中和抗體效價(jià)測(cè)定。免疫后4、8周取血進(jìn)行基于流式細(xì)胞技術(shù)的細(xì)胞免疫分析。

（3）免疫血清特異性輪狀病毒抗體elisa效價(jià)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)

將羊抗輪狀病毒免疫多克隆抗體（millipore公司）用碳酸鹽緩沖液(ph值9.6)按1：1000稀釋?zhuān)靠?00μl在96孔elisa板4℃包被過(guò)夜；之后去除包被液，用含0.5%tween-20的pbs溶液（pbst溶液）洗板3次，每次3min；用含有3%牛血清白蛋白的pbst溶液，100μl/孔，37℃封閉2小時(shí)；去除，pbst洗板，將純化輪狀病毒抗原每孔500ffa(ccid50)/100μl加入elisa板，37℃溫育1h；洗板后，2倍梯度稀釋待測(cè)小鼠免疫血清，100μl/孔加入elisa板，37℃結(jié)合1h；pbst洗板，加入用pbst緩沖液1：5000稀釋的hrp標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體（millipore公司），100μl/孔，37℃結(jié)合1h；pbst洗板，用tmb，100μl/孔，在室溫顯色15min，再用2mh2so4終止顯色；用酶標(biāo)儀在450nm檢測(cè)光密度值。當(dāng)待測(cè)血清的光密度值是陰性血清的2.1倍時(shí)，認(rèn)為該待測(cè)血清為陽(yáng)性，血清抗體的滴度用血清稀釋度的倒數(shù)表示。

檢測(cè)體系采用經(jīng)純化的滅活輪狀病毒免疫豚鼠血清作為陽(yáng)性參考品，無(wú)輪狀病毒pbs免疫豚鼠血清作為陰性參考品，pbst緩沖液1：5000稀釋的hrp標(biāo)記的山羊抗豚鼠抗體（millipore公司）作為酶標(biāo)二抗標(biāo)定檢測(cè)系統(tǒng)的有效性。

（4）免疫血清輪狀病毒中和抗體效價(jià)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)

將免疫血清按2被梯度稀釋后，按100μl/孔加入96孔平底組織培養(yǎng)板，每孔按100ccid50/100μl/孔加入稀釋后的收獲病毒液，37℃co2孵箱中和2小時(shí)后，加入已用不含小牛血清的dmem維持溶液37℃co2處理1小時(shí)的培養(yǎng)成致密單層的96孔平底組織培養(yǎng)板，37℃co2孵箱培養(yǎng)24小時(shí)，吸出溶液，加入不含小牛血清的dmem維持溶液37℃co2培養(yǎng)16小時(shí)后，用50%（v/v）甲醛溶液4℃固定細(xì)胞板2小時(shí)，除凈甲醛，隨后加入含1：500稀釋抗輪狀病毒豚鼠血清（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所制備）的5%bsa-pbsph7.2溶液，37℃培養(yǎng)1小時(shí)，洗板后加入含1：2000稀釋的羊抗豚鼠fitc標(biāo)記抗體(millipore公司)的5%bsa-pbsph7.2溶液，37℃培養(yǎng)1小時(shí)，洗板后在熒光顯微鏡下判定結(jié)果。記錄無(wú)熒光信號(hào)標(biāo)記細(xì)胞的最高血清稀釋度，血清中和抗體的滴度用血清稀釋度的倒數(shù)表示。