本申請(qǐng)涉及惡性腫瘤基因治療領(lǐng)域，尤其涉及一種定位目標(biāo)表型癌細(xì)胞中表型基因的方法。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤己成為嚴(yán)重威脅人類生命與健康的疾病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界死于惡性腫瘤的人約每年700萬，我國(guó)每年死于惡性腫瘤的人約150萬，目前我國(guó)國(guó)內(nèi)新增腫瘤患者每年高達(dá)180萬以上，癌癥治療技術(shù)的研究已經(jīng)迫在眉睫。經(jīng)研究表明，腫瘤的發(fā)生既與外源性致癌因素的性質(zhì)、強(qiáng)度和作用時(shí)間有關(guān)，同時(shí)也與人體的內(nèi)在因素有重要的關(guān)系。經(jīng)常可以見到，處于同樣條件下接觸同質(zhì)、同量致癌因素，有的人發(fā)病，而有的人不發(fā)病，可見外源性致癌因素雖然很重要，但人體的內(nèi)在因素才是癌細(xì)胞產(chǎn)生和發(fā)展的決定性因素。因此，從人體自身層面上研究癌癥發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

在引起人體惡性腫瘤的眾多內(nèi)在因素中，與基因相關(guān)的因素占據(jù)極其重要的部分。分子生物學(xué)的研究己經(jīng)發(fā)現(xiàn)2.5萬多種癌癥與相關(guān)的基因變異和基因表達(dá)失調(diào)有關(guān)，這些與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)的基因一般是編碼生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)因子受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、凋亡蛋白、細(xì)胞周期蛋白和DNA修復(fù)蛋白等的基因。

一方面癌細(xì)胞有許多共性，如生長(zhǎng)和分裂失去控制，具有浸潤(rùn)性和擴(kuò)散性，細(xì)胞間粘著性下降，細(xì)胞分化程度較低，失去運(yùn)動(dòng)和分裂的接觸抑制等，癌細(xì)胞的每種細(xì)胞功能特點(diǎn)都有相對(duì)應(yīng)的基因所控制，如癌細(xì)胞中調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞間粘連等功能的基因往往出現(xiàn)異常。另一方面不同種類的癌細(xì)胞基因表達(dá)譜卻不盡相同，正是由于這些不同的基因表達(dá)決定了各式各樣癌細(xì)胞的 表型。因此，研究這些基因表達(dá)譜中不同的表達(dá)基因能夠?qū)Π┌Y的發(fā)病原因以及癌癥的治療提供重要幫助。

然而，人類的基因組數(shù)據(jù)庫過于復(fù)雜，從不同表型癌細(xì)胞的基因表達(dá)譜中篩選出決定其表型的基因需要花費(fèi)大量的工作，并且有的時(shí)候癌癥病人的治療情況十分急迫，要檢測(cè)導(dǎo)致癌細(xì)胞表型的基因會(huì)耗費(fèi)大量時(shí)間，從而不利于癌癥病人的及時(shí)治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的實(shí)施例提供了一種定位目標(biāo)表型癌細(xì)胞中表型基因的方法，用于定位目標(biāo)表型癌細(xì)胞的表型基因。

一種定位目標(biāo)表型癌細(xì)胞中表型基因的方法，其特征在于，該方法包括：

對(duì)目標(biāo)表型癌細(xì)胞和對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞分別進(jìn)行總RNA提取；

將所提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA；

以得到的cDNA為模板，實(shí)時(shí)定量PCR計(jì)算目標(biāo)表型癌細(xì)胞中選定基因的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平；

根據(jù)目標(biāo)表型癌細(xì)胞中選定基因的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的計(jì)算結(jié)果定位目標(biāo)表型癌細(xì)胞的表型基因。

優(yōu)選的，所述定位目標(biāo)表型癌細(xì)胞的表型基因具體為：比較目標(biāo)表型癌細(xì)胞各個(gè)基因mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，以目標(biāo)表型癌細(xì)胞中mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平最高的基因作為目標(biāo)表型癌細(xì)胞表型基因。

優(yōu)選的，所述方法還包括：根據(jù)目標(biāo)表型癌細(xì)胞以及所定位的表型基因，構(gòu)建癌細(xì)胞表型、表型基因和它們對(duì)應(yīng)關(guān)系三者的文庫；所述文庫具體為癌細(xì)胞表型、表型基因以及對(duì)應(yīng)關(guān)系三者的數(shù)據(jù)表。

優(yōu)選的，其特征在于，當(dāng)獲知癌細(xì)胞表型時(shí)，能夠根據(jù)所述癌細(xì)胞表型在所述文庫中快速查詢表型基因，用于癌癥的基因治療。

優(yōu)選的，其特征在于，所述對(duì)目標(biāo)表型癌細(xì)胞和對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞分別進(jìn)行總 RNA提取具體為：使用TaKaRa Code D9108A RNAiso Plus試劑盒分別提取目標(biāo)表型癌細(xì)胞和對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞中全部的RNA。

優(yōu)選的，所述目標(biāo)表型癌細(xì)胞具體指：包括人胰腺癌細(xì)胞在內(nèi)的不同表型的癌細(xì)胞；所述對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞指：與目標(biāo)表型癌細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的正常細(xì)胞，包括人胰腺細(xì)胞HPC-Y5。

優(yōu)選的，所述反轉(zhuǎn)錄具體為：用TaKaRa Primer Script RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將提取得到的目標(biāo)表型癌細(xì)胞和對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞的總RNA分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

優(yōu)選的，所述目標(biāo)表型癌細(xì)胞中選定基因的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平計(jì)算方法為：將選定基因在對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄mRNA的量定為1個(gè)基本單位，并以此確定目標(biāo)表型癌細(xì)胞中相同基因的mRNA轉(zhuǎn)錄量；所述選定基因?yàn)槿祟惢蚪M數(shù)據(jù)庫中任何一個(gè)基因。

優(yōu)選的，所述表型基因指通過精確協(xié)調(diào)的活動(dòng)而維持細(xì)胞特定表型的基因，癌細(xì)胞表型基因的mRNA高相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平造成了癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的差別。

本發(fā)明所帶來的有益效果是，一方面本發(fā)明對(duì)目標(biāo)表型癌細(xì)胞中基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR，通過比較癌細(xì)胞和對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞之間不同基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平之間的比較，根據(jù)細(xì)胞表型的差異由表型基因的活動(dòng)狀態(tài)決定的原理，篩選出決定癌細(xì)胞表型的表型基因，另一方面本發(fā)明提供了表型基因、癌細(xì)胞表型和表型基因及癌細(xì)胞表型對(duì)應(yīng)關(guān)系三者的文庫，當(dāng)獲知癌細(xì)胞表型時(shí)，能夠根據(jù)所述癌細(xì)胞表型在所述文庫中快速查詢表型基因，用于癌癥的基因治療。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對(duì)本申請(qǐng)的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分，本申請(qǐng)的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本申請(qǐng)，并不構(gòu)成對(duì)本申請(qǐng)的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1為本發(fā)明實(shí)施例一的流程圖

圖2為本發(fā)明實(shí)施例二的流程圖

圖3為本發(fā)明實(shí)施例二胸RNA提取具體操作步驟流程圖

圖4為本發(fā)明實(shí)施例三的流程圖

圖5為本發(fā)明實(shí)施例四的流程圖

圖6為PANC-1中4種基因mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平

圖7為本發(fā)明實(shí)施例五的流程圖

具體實(shí)施方式

為使本申請(qǐng)的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本申請(qǐng)具體實(shí)施例及相應(yīng)的附圖對(duì)本申請(qǐng)技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實(shí)施例僅是本申請(qǐng)一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒旧暾?qǐng)中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本申請(qǐng)保護(hù)的范圍。

本發(fā)明的主要思想是細(xì)胞表型的差異(正常細(xì)胞和癌細(xì)胞之間以及不同癌細(xì)胞之間)與表型基因的活動(dòng)狀態(tài)有關(guān)，表型基因是指通過精確協(xié)調(diào)的活動(dòng)而維持細(xì)胞特定表型的基因，癌細(xì)胞表型基因的mRNA高相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平造成了癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的差別。可以通過比較目標(biāo)表型癌細(xì)胞不同基因信使RNA(mRNA)的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平最高的基因即為目標(biāo)表型癌細(xì)胞的表型基因，并且目標(biāo)表型癌細(xì)胞整個(gè)生命過程受到表型基因的調(diào)控。本發(fā)明通過比較PANC-1細(xì)胞內(nèi)不同基因mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，篩選出決定PANC-1細(xì)胞表型的表型基因。并根據(jù)篩選的結(jié)果構(gòu)建癌細(xì)胞表型、表型基因和它們對(duì)應(yīng)關(guān)系三者的文庫。

根據(jù)上述總體過程，本發(fā)明篩選出的表型基因與癌細(xì)胞的增殖和/或凋亡和/或浸潤(rùn)和/或轉(zhuǎn)移等細(xì)胞生命過程相關(guān)。

為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員能進(jìn)一步了解本發(fā)明的特征及技術(shù)內(nèi)容，下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)描述。

實(shí)施例一

附圖1為本發(fā)明實(shí)施例一的流程圖。該實(shí)施例所述的一種定位目標(biāo)表型癌細(xì)胞中表型基因的方法包括以下步驟：

步驟101：對(duì)目標(biāo)表型癌細(xì)胞和對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞分別進(jìn)行總RNA提取；

步驟102：將步驟101中提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA；

所述總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄具體為用TaKaRa Primer Script RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將提取得到的目標(biāo)表型癌細(xì)胞和對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞的總RNA分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

步驟103：以步驟102得到的cDNA為模板，實(shí)時(shí)定量PCR計(jì)算目標(biāo)表型癌細(xì)胞中選定基因的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平；

所述選定基因具體為人類基因組數(shù)據(jù)庫中任何單個(gè)基因，當(dāng)需要測(cè)量多個(gè)選定基因的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平時(shí)，分別測(cè)量每個(gè)選定基因的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

步驟104：根據(jù)步驟103的計(jì)算結(jié)果定位目標(biāo)表型癌細(xì)胞的表型基因；

本發(fā)明對(duì)目標(biāo)表型癌細(xì)胞中基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR，通過比較癌細(xì)胞和對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞之間不同基因的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平之間的比較，根據(jù)細(xì)胞表型的差異由表型基因的活動(dòng)狀態(tài)決定的原理，篩選出決定癌細(xì)胞表型的表型基因。

實(shí)施例二

實(shí)施例一中步驟101提到對(duì)目標(biāo)表型癌細(xì)胞和對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞分別進(jìn)行總RNA提取，這種總RNA提取可以有多種具體實(shí)現(xiàn)方式，只要這些方式能夠分別提取細(xì)胞內(nèi)全部的RNA即不妨礙本發(fā)明的發(fā)明目的的實(shí)現(xiàn)。比如可以使用TaKaRa Code D9108A RNAiso Plus試劑盒對(duì)目標(biāo)表型癌細(xì)胞和對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞分別進(jìn)行總RNA提取。由此可構(gòu)成本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施例，參見附圖2和附圖3，本實(shí)施例二與實(shí)施例一相比，除步驟101外，其他步驟均相同。實(shí)施例一的步驟101在本實(shí)施例中變化為：

步驟201：使用TaKaRa Code D9108A RNAiso Plus試劑盒對(duì)目標(biāo)表型癌細(xì)胞和對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞分別進(jìn)行總RNA提取。

所述目標(biāo)表型癌細(xì)胞具體指包括人胰腺癌細(xì)胞(PANC-1)在內(nèi)的不同表型 的癌細(xì)胞；所述對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞指與目標(biāo)表型癌細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的正常細(xì)胞，包括人胰腺細(xì)胞(HPC-Y5)；所述總RNA提取指提取細(xì)胞內(nèi)的全部的RNA；所述RNAiso Plus用量為每10cm²的貼壁細(xì)胞1mL；所述步驟201具體為：

步驟2011：勻漿。倒出培養(yǎng)液，用杜氏磷酸緩沖液洗一次后，加入RNAiso Plus，水平放置片刻使細(xì)胞裂解，將裂解液移至無酶離心管中，反復(fù)吹吸至無明顯沉淀，室溫靜置5分鐘；

步驟2012：總RNA提取。向勻漿裂解液中加入氯仿(加入的量為RNAiso Plus體積的1/5)，用手劇烈震蕩15秒，室溫靜置5分鐘。然后在4℃的條件下離心15分鐘，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為12000rpm。將離心后的無色上清液移至新的無酶離心管中，向其中加入等體積的異丙醇，混勻后靜置10分鐘，然后在4℃、12000rpm的條件下離心10分鐘，最后得到的下層沉淀物為總RNA；

步驟2013：總RNA清洗。使用75％的無水乙醇清洗總RNA；

步驟2014：總RNA溶解。將得到的總RNA在室溫干燥2-5分鐘，然后加入20uL的無酶水溶解總RNA。

實(shí)施例三

實(shí)施例一中步驟103提到以cDNA為模板，實(shí)時(shí)定量PCR計(jì)算目標(biāo)表型癌細(xì)胞中選定基因的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，這種計(jì)算目標(biāo)表型癌細(xì)胞中選定基因的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平有多種方法，只要這些方法能計(jì)算選定基因的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平即不妨礙本發(fā)明發(fā)明目的的實(shí)現(xiàn)。實(shí)施例三與實(shí)施例一相比，除步驟103外，其他步驟均相同。參考附圖4，實(shí)施例一的步驟103在本實(shí)施例中變化為：

步驟403：以cDNA為模板，實(shí)時(shí)定量PCR，將選定基因在對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄mRNA的量定為1個(gè)基本單位，確定目標(biāo)表型癌細(xì)胞中相同基因的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。具體操作為：

分別以目標(biāo)表型癌細(xì)胞和對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞的cDNA為模板，對(duì)內(nèi)參基因和選定基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)試3次，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行實(shí)時(shí) 定量PCR檢測(cè)表達(dá)量，計(jì)算目標(biāo)表型癌細(xì)胞中選定基因的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。所述目標(biāo)表型癌細(xì)胞內(nèi)選定基因的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平計(jì)算方法為：將選定基因在對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄mRNA的量定為1個(gè)基本單位，并以此確定目標(biāo)表型癌細(xì)胞中相同基因的mRNA轉(zhuǎn)錄量。

實(shí)施例四

實(shí)施例一中步驟104提到，根據(jù)步驟103的計(jì)算結(jié)果定位目標(biāo)表型癌細(xì)胞的表型基因，定位目標(biāo)表型癌細(xì)胞的表型基因有多種方法，只要這些方法能計(jì)算選定基因的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平即不妨礙本發(fā)明發(fā)明目的的實(shí)現(xiàn)。比如可以比較目標(biāo)表型癌細(xì)胞各個(gè)基因mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，以目標(biāo)表型癌細(xì)胞中相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平最高的基因作為目標(biāo)表型癌細(xì)胞表型基因。這樣就構(gòu)成了本發(fā)明的實(shí)施例四，參考附圖5。實(shí)施例四與實(shí)施例一相比，除步驟104外，其他步驟均相同。實(shí)施例四的步驟104在本實(shí)施例中變化為：

步驟504：比較目標(biāo)表型癌細(xì)胞各個(gè)基因mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，以目標(biāo)表型癌細(xì)胞中相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平最高的基因作為目標(biāo)表型癌細(xì)胞表型基因。

以PANC-1細(xì)胞為例，附圖6提供了PANC-1中表達(dá)量最高的四種不同基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，通過比較四種不同基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平定，根據(jù)本實(shí)施例所提供的方法，篩選出了決定PANC-1細(xì)胞表型的表型基因?yàn)镾TAT5B基因。

STAT5B基因在PANC-1中mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到了正常HPC-Y5的54倍，而其它幾種基因的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平雖然較高，但是與STAT5B基因相比相對(duì)表達(dá)水平差距明顯，所以確定STAT5B基因?yàn)镻ANC-1的表型基因。STAT5B是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，能夠?qū)υS多細(xì)胞因子、激素和生長(zhǎng)因子產(chǎn)生影響，它通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的過程，影響細(xì)胞增殖的進(jìn)程。

實(shí)施例五

實(shí)施例一的方法還可以包括構(gòu)建癌細(xì)胞表型、表型基因和表型基因及癌細(xì)胞表型對(duì)應(yīng)關(guān)系三者的文庫，這就構(gòu)成了本發(fā)明的實(shí)施例五。參考附圖7，實(shí)施例五與實(shí)施例一相比，除增加了步驟705外，其他步驟均相同實(shí)施例一相同。

步驟705：構(gòu)建癌細(xì)胞表型、表型基因和表型基因及癌細(xì)胞表型對(duì)應(yīng)關(guān)系三者的文庫。具體操作步驟為：

根據(jù)實(shí)施例一步驟104得到的目標(biāo)表型癌細(xì)胞和表型基因?qū)?yīng)的結(jié)果，構(gòu)建癌細(xì)胞表型、表型基因和它們對(duì)應(yīng)關(guān)系三者的文庫。所述文庫具體為癌細(xì)胞表型、表型基因以及對(duì)應(yīng)關(guān)系三者的數(shù)據(jù)表格。表1為根據(jù)實(shí)施例四的結(jié)果構(gòu)建的文庫，可以在文庫中根據(jù)癌細(xì)胞的表型快速地找到對(duì)應(yīng)的表型基因以及對(duì)應(yīng)關(guān)系，為癌細(xì)胞的針對(duì)性治療提供便利。

表1細(xì)胞表型、表型基因以及它們對(duì)應(yīng)關(guān)系三者的文庫

以上僅為本申請(qǐng)的實(shí)施例而已，并不用于限制本申請(qǐng)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，本申請(qǐng)可以有各種更改和變化。凡在本申請(qǐng)的精神和原理之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。