本發(fā)明涉及糞鏈球菌的檢測(cè)方法，具體涉及羽絨羽毛中糞鏈球菌的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

羽絨羽毛及其制品具有輕、柔、暖、抗潮等優(yōu)良特性，備受廣大消費(fèi)者青睞，具有其他產(chǎn)品不可替代的優(yōu)勢(shì)。隨著國(guó)家改革開(kāi)放和市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展，我國(guó)羽絨羽毛及其制品的進(jìn)出口規(guī)模也在不斷擴(kuò)大。與此同時(shí)，國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者對(duì)羽絨羽毛及其制品的要求不僅僅是美觀舒適，而且更注重衣服的安全性、衛(wèi)生性和環(huán)保性。特別是2004-2005年全球范圍內(nèi)禽流感疫情的發(fā)生，使羽絨羽毛及其制品作為動(dòng)物源性產(chǎn)品，其微生物指標(biāo)成為消費(fèi)者關(guān)注的問(wèn)題之一。

據(jù)相關(guān)資料表明，目前我國(guó)年可用毛絨約20萬(wàn)噸，占世界總產(chǎn)量的70％左右，已然成為世界羽絨羽毛原料的最大供應(yīng)國(guó)。我國(guó)也是世界上最大的羽絨羽毛及其制品出口大國(guó)，占世界同類(lèi)貿(mào)易量的50％以上。羽絨羽毛微生物檢測(cè)與消費(fèi)者的安全息息相關(guān)。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于羽絨羽毛微生物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)有FZ/T 80001-2002《水洗羽毛羽絨試驗(yàn)方法》、GB/T 10288-2003《羽絨羽毛檢驗(yàn)方法》、SN/T 0475-95《出口商品中糞鏈球菌群檢驗(yàn)方法》和EN 1884-1999《羽絨羽毛微生物狀態(tài)測(cè)定方法》等。涉及的羽絨羽毛微生物檢測(cè)指標(biāo)包括嗜溫性需氧菌、糞鏈球菌、還原亞硫酸梭狀芽胞桿菌、沙門(mén)氏菌等。

糞鏈球菌作為其中一項(xiàng)重要檢測(cè)指標(biāo)，是引起產(chǎn)品不合格的主要污染菌之一。糞鏈球菌(Enterococcus faecalis)廣泛存在于土壤、植物、乳制品等，為人、禽、動(dòng)物等胃腸道正常菌群之一，也是健康人體的上呼吸道，口腔或腸道的常居菌。但是當(dāng)其進(jìn)入人體血液或其他部位，可引起尿道、血液、心內(nèi)膜、腹腔、膽道等多部位感染。其中糞鏈球菌為條件致病菌，它來(lái)源于人和溫血?jiǎng)游锏募S便，偶爾出現(xiàn)于感染的尿道及急性心內(nèi)膜炎糞鏈球菌為條件致病菌，比沙門(mén)氏菌，致病性大腸桿菌抵抗性及存活率均高，能夠通過(guò)羽絨羽毛及其制品感染人類(lèi)。據(jù)有關(guān)研究報(bào)道，通過(guò)對(duì)來(lái)自生產(chǎn)企業(yè)送檢及市場(chǎng)銷(xiāo)售的羽絨羽毛及羽絨制品200批進(jìn)行微生物含量檢測(cè)，糞鏈球菌的不合格率為6.0％。因此，糞鏈球菌的檢測(cè)具有重要意義，可以直接或間接的表明送檢樣品的衛(wèi)生狀況以及受污染程度，并判斷出該樣品在使用上是否安全。

羽絨羽毛微生物檢測(cè)有別于其他產(chǎn)品檢測(cè)，它對(duì)檢測(cè)人員知識(shí)的全面性具有更高的要求，任何方面知識(shí)的欠缺都可能使檢測(cè)數(shù)據(jù)的真實(shí)性和準(zhǔn)確性大打折扣。上述標(biāo)準(zhǔn)中提及的方法都僅僅只是傳統(tǒng)的糞鏈球菌培養(yǎng)方法和確證試驗(yàn)。此類(lèi)試驗(yàn)缺乏一定的可操作性和準(zhǔn)確性，易引起試驗(yàn)的假陽(yáng)性或者假陰性。

面對(duì)我國(guó)羽絨羽毛及其制品中糞鏈球菌檢測(cè)存在的問(wèn)題，有必要建立一套科學(xué)合理、準(zhǔn)確可靠、方便的糞鏈球菌檢測(cè)方法。以此規(guī)范羽絨羽毛及其制品市場(chǎng)作用明顯，不僅保障了我國(guó)消費(fèi)者的安全利益，也順應(yīng)全球消費(fèi)發(fā)展趨勢(shì)，有利于推進(jìn)中國(guó)羽絨羽毛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，具有相當(dāng)顯著的經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種羽毛羽絨中糞鏈球菌的檢測(cè)方法，以滿(mǎn)足相關(guān)領(lǐng)域應(yīng)用的需要。

所述的羽毛羽絨中糞鏈球菌的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

(1)用重量濃度為0.1％的蛋白胨生理鹽水(蛋白胨生理鹽水的pH為6.9～7.1)，從羽絨羽毛中提取糞鏈球菌；

該提取方法為常規(guī)的，采用GB/T10288-2003《羽絨羽毛檢驗(yàn)》的方法；

(2)用KF鏈球菌培養(yǎng)基，初步培養(yǎng)步驟(1)提取的的糞鏈球菌；

所述的KF鏈球菌培養(yǎng)基的組分、配比和制備方法，在SN/T0475-95《出口商品中糞鏈球菌群檢驗(yàn)方法》中有詳細(xì)的報(bào)道；

具體的制備方法如下：將71.5gKF鏈球菌瓊脂溶解在1000mL水中，分裝每瓶100mL，于121℃滅菌15min，滅菌后的培養(yǎng)基pH為7.2±0.2；

冷卻至50℃左右，每100mL中添加1％(重量)TTC溶液1支，4h之內(nèi)，混勻后制成平板，置(4-10)℃儲(chǔ)存，3周內(nèi)可使用。

所述的KF鏈球菌瓊脂可采用北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，牌號(hào)為KF鏈球菌瓊脂基礎(chǔ)產(chǎn)品；

所述的TTC溶液的化學(xué)名稱(chēng)為2.3.5-氯化三苯基四氮唑，可采用北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司的產(chǎn)品，1支的重量為1.0101g；

(3)再用疊氮化鈉葡萄糖肉湯，對(duì)初步培養(yǎng)的糞鏈球菌進(jìn)行增菌純化培養(yǎng)；培養(yǎng)方法如下：

從濾膜上刮去典型暗紅色小菌落，將其接種于具塞的250mL裝有100mL疊氮化鈉葡萄糖肉湯培養(yǎng)基的錐形瓶中，在35℃生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行液體培養(yǎng)，得到一代種子菌液。

取0.5mL種子液接種于，100mL疊氮化鈉葡萄糖肉湯培養(yǎng)基的具塞錐形瓶中，在35℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

所述的疊氮化鈉葡萄糖肉湯的詳細(xì)信息，在SN/T0475-95《出口商品中糞鏈球菌群檢驗(yàn)方法》中有詳細(xì)的報(bào)道；具體的制備方法如下：

將34.7g疊氮化鈉葡萄糖，將其溶解在1000mL蒸餾水中，完全溶解后，分裝每瓶100mL，于121℃滅菌15min，滅菌后的培養(yǎng)基pH為7.2±0.2，現(xiàn)配現(xiàn)用；

(4)對(duì)純化培養(yǎng)的糞鏈球菌進(jìn)行鏡檢、API以及分子生物學(xué)的方法鑒定，獲得結(jié)果；

所述的鏡檢為革蘭氏陽(yáng)性鏈球菌，分子生物學(xué)的方法鑒定結(jié)果與API 20strep鑒定結(jié)果相同，能準(zhǔn)確鑒別出糞鏈(腸)球菌和屎腸球菌；

術(shù)語(yǔ)“API 20strep”指的是一個(gè)結(jié)合各方面的20個(gè)生化試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化方法。該系統(tǒng)能鑒定醫(yī)學(xué)細(xì)菌中絕大多數(shù)鏈球菌的種或群；

本發(fā)明的原理：本方法通過(guò)對(duì)羽絨羽毛中糞鏈球菌進(jìn)行初步選擇性培養(yǎng)，再進(jìn)行增菌純化培養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)行鏡檢及API和分子生物學(xué)基因測(cè)序進(jìn)行鑒定，從而達(dá)到準(zhǔn)確分離鑒定，避免假陽(yáng)性。

本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，通過(guò)API 20strep系統(tǒng)鑒定以及分子生物學(xué)的基因鑒定可以準(zhǔn)確快速判斷其菌屬，以免造成假陽(yáng)性，具有良好的應(yīng)用前景。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。

以下實(shí)施例中，羽絨羽毛中糞鏈球菌的分離鑒定情況。

實(shí)施例1

(1)用重量濃度為0.1％的蛋白胨生理鹽水(蛋白胨生理鹽水的pH為6.9～7.1)，從羽絨羽毛中提取糞鏈球菌；

提取方法如下：

戴消毒手套取出樣品并制備試樣，取兩個(gè)約12g的羽絨試樣，分別稱(chēng)量，精確至0.1g，將每個(gè)試樣分別放入2000mL的錐形瓶中加入1200mL的0.1％蛋白胨生理鹽水，室溫機(jī)械攪動(dòng)3h；通過(guò)消毒紗布過(guò)濾溶液，然后將兩個(gè)原始濾液在無(wú)菌條件下混合，即為原始濾液。取200mL澄清的原始濾液，用作糞鏈球菌檢驗(yàn)。

(2)用KF鏈球菌培養(yǎng)基，初步培養(yǎng)步驟(1)提取的的糞鏈球菌；

提取方法如下：

用0.45μm濾過(guò)膜100mL原始濾液，并將濾膜放在KF鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基上，倒置平皿(35±2)℃培養(yǎng)24h-48h，觀察濾膜上是否有暗紅色小菌落。

具體的制備方法如下：將71.5gKF鏈球菌瓊脂溶解在1000mL水中，分裝每瓶100mL，于121℃滅菌15min，滅菌后的培養(yǎng)基pH為7.2±0.2；

冷卻至50℃左右，每100mL中添加1％(重量)TTC溶液1支，4h之內(nèi)，混勻后制成平板，置(4-10)℃儲(chǔ)存，3周內(nèi)可使用。

所述的KF鏈球菌瓊脂可采用北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，牌號(hào)為KF鏈球菌瓊脂基礎(chǔ)產(chǎn)品；

所述的TTC溶液的化學(xué)名稱(chēng)為2.3.5-氯化三苯基四氮唑，可采用北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司的產(chǎn)品，1支的重量為1.0101g；

(3)再用疊氮化鈉葡萄糖肉湯，對(duì)初步培養(yǎng)的糞鏈球菌進(jìn)行增菌純化培養(yǎng)；培養(yǎng)方法如下：

從濾膜上刮去典型暗紅色小菌落，將其接種于具塞的250mL裝有100mL疊氮化鈉葡萄糖肉湯培養(yǎng)基的錐形瓶中，在35℃生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行液體培養(yǎng)，得到一代種子菌液。

取0.5mL種子液接種于，100mL疊氮化鈉葡萄糖肉湯培養(yǎng)基的具塞錐形瓶中，在35℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

疊氮化鈉葡萄糖肉湯的制備方法如下：

將34.7g疊氮化鈉葡萄糖，將其溶解在1000mL蒸餾水中，完全溶解后，分裝每瓶100mL，于121℃滅菌15min，滅菌后的培養(yǎng)基pH為7.2±0.2，現(xiàn)配現(xiàn)用；

(4)對(duì)純化培養(yǎng)的糞鏈球菌進(jìn)行鏡檢、API以及分子生物學(xué)的方法鑒定，獲得結(jié)果；

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用API技術(shù)和分子生物學(xué)的方法作為鏡檢后的驗(yàn)證試驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)的鏡檢篩查作為初步確認(rèn)試驗(yàn)，而驗(yàn)證試驗(yàn)?zāi)苊鞔_鑒定出糞鏈球菌與其同屬不同種菌株。

API 20strep試驗(yàn)條是由20個(gè)含干燥底物的小管所組成。(生物梅里埃公司)

準(zhǔn)備一個(gè)培養(yǎng)盒(具有盤(pán)和蓋子)，取約3mL的蒸餾水或者去離子水，倒入盤(pán)子的蜂窩凹中，造成濕室。

從包裝中取出API 20strep試驗(yàn)條，將其置于盤(pán)中。用無(wú)菌接種環(huán)取已接種好的平板培養(yǎng)物(待測(cè)菌種，是為步驟3的產(chǎn)物)，放入無(wú)雜質(zhì)2mL無(wú)菌蒸餾水管內(nèi)，制得大于4McFarland(麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)渾濁度)菌懸液，作為接種物。其中，在試驗(yàn)條的前一半(由VP 至ADH)用無(wú)菌吸管接種該菌懸液。VP到LAP測(cè)定，每管接入100μl菌懸液。對(duì)ADH測(cè)定，只充滿(mǎn)管的部分；試驗(yàn)條的后一半(由RIB至GLYG)開(kāi)啟API GP培養(yǎng)基的安瓿，并將菌懸液搖勻轉(zhuǎn)入。對(duì)ADH到GLYG測(cè)定，將石蠟油覆蓋在上面，形成一個(gè)凸面。為避免試驗(yàn)條產(chǎn)生氣泡，需將試驗(yàn)條前傾，并將吸管頂部靠至小管內(nèi)緣加液體。用準(zhǔn)備的蓋子蓋住培養(yǎng)盒，在(36±1)℃培養(yǎng)4h得到第一次結(jié)果，繼續(xù)培養(yǎng)至24h讀第二次結(jié)果。

經(jīng)過(guò)孵育后，所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物顏色通過(guò)自然產(chǎn)生或加入試劑而改變。按照說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)的指示劑。4h后，VP測(cè)定：加入VP1和VP2各1滴。HIP測(cè)定：滴加2滴茚三酮(NIN)。而PYRA、α-GAL、β-GUR、β-GAL、PAL和LAP測(cè)定：都分別加ZYM A和ZYM B各1滴。過(guò)10min讀取結(jié)果；24h后，再讀ESC、ADH以及RIB至GLYG的反應(yīng)結(jié)果。

將所有的結(jié)果參照讀表表格進(jìn)行讀表，將得到的陽(yáng)性或者陰性結(jié)果記錄于報(bào)告單上。得出7位數(shù)字編碼后，應(yīng)用鑒定軟件包，通過(guò)輸入7位編碼得到菌種名稱(chēng)和鑒定率。本試驗(yàn)將初步篩選為陽(yáng)性糞鏈球菌的10株菌株做API鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 AI strep鑒定菌種名稱(chēng)

通過(guò)表1可見(jiàn)，通過(guò)傳統(tǒng)方法分離出的10株陽(yáng)性糞鏈球菌里有糞鏈(腸)球菌Enterococcus faecalis和屎腸球菌Enterococcus faecium。均屬腸球菌屬，同源不同種。通過(guò)API 20strep系統(tǒng)鑒定可以準(zhǔn)確快速判斷其菌屬，以免造成假陽(yáng)性，以達(dá)到正確發(fā)出報(bào)告及鑒定基礎(chǔ)。

實(shí)施例2

對(duì)微生物DNA進(jìn)行測(cè)序，是當(dāng)前生命科學(xué)領(lǐng)域上的一項(xiàng)重要研究。DNA測(cè)序技術(shù)穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高；所得數(shù)據(jù)為直接的基因組序列，準(zhǔn)確、數(shù)據(jù)可重復(fù)性好，被公認(rèn)為國(guó)際金標(biāo)準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用分子生物學(xué)鑒定分離菌種。其基本過(guò)程包括：基因組提取及電泳檢測(cè)，PCR反應(yīng)和DNA瓊脂糖切膠純化及測(cè)序。通過(guò)對(duì)API鑒定有代表性的4株菌株做DNA測(cè)序，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 DNA鑒定結(jié)果

分子生物學(xué)的方法鑒定結(jié)果與API 20strep鑒定結(jié)果相同。

通過(guò)API 20strep系統(tǒng)鑒定以及分子生物學(xué)的基因鑒定可以準(zhǔn)確快速判斷其菌屬，以免造成假陽(yáng)性，以達(dá)到正確發(fā)出報(bào)告及鑒定基礎(chǔ)。