具有增加產(chǎn)率的支鏈淀粉酶變體本申請是發(fā)明人于2007年8月21日提交的題為“具有增加產(chǎn)率的支鏈淀粉酶變體”的中國專利申請200780031317.X的分案申請。相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2007年2月23日提交的美國臨時申請US60/903,247和2006年8月23日提交的美國臨時申請US60/839,735的優(yōu)先權(quán)，其中每個通過全部引用并入本文。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及酶促肽支鏈淀粉酶的新型變體，編碼所述新型肽的基因序列，包括那些基因序列的表達載體以及表達新型支鏈淀粉酶變體的生物。而且，本發(fā)明涉及這些新型支鏈淀粉酶肽在紡織、發(fā)酵、食品和其它工業(yè)中的應(yīng)用。發(fā)明背景支鏈淀粉酶是在許多工業(yè)應(yīng)用，特別是在食品和飲料工業(yè)中被發(fā)現(xiàn)有用的酶。支鏈淀粉酶是淀粉脫支酶，并在淀粉水解產(chǎn)物的脫支(用于改進面團性質(zhì))、β-極限葡聚糖(β-limitdextrans)的脫支(用于釀造啤酒和強麥酒(ales))以及從例如玉米、馬鈴薯、小麥、木薯和水稻生產(chǎn)糖漿中是有效的。支鏈淀粉酶是分類為EC3.2.1.41的酶，并且這種酶的特征是它們水解例如支鏈淀粉和普魯分支葡聚糖中α-l,6-糖苷鍵的能力。支鏈淀粉酶是細菌，特別是芽孢桿菌屬的產(chǎn)物。用于工業(yè)應(yīng)用的支鏈淀粉酶的生產(chǎn)并非沒有問題。支鏈淀粉酶可被同樣由細菌產(chǎn)生的各種蛋白酶快速降解，從而使大量支鏈淀粉酶的回收低效且昂貴。本領(lǐng)域技術(shù)人員已經(jīng)設(shè)計了方法，以通過限制培養(yǎng)物中支鏈淀粉酶的降解來增加產(chǎn)量。例如，我們以前已經(jīng)示出，從支鏈淀粉酶生產(chǎn)菌株刪除AprL和Mpr基因(它們表達蛋白酶)對于經(jīng)濟表達活性支鏈淀粉酶是必要的。而且，發(fā)酵時間限制在51-60小時，以限制支鏈淀粉酶產(chǎn)物的蛋白水解性降解和活性損失。Svendsen設(shè)計了支鏈淀粉酶變體，所述支鏈淀粉酶變體改變酶的三維構(gòu)象，以增加酶的熱穩(wěn)定性或改變酶如何降解其底物(見美國專利6,350,599和6,838,257以及美國申請第2004/0082028號)。最近，我們已經(jīng)示出，支鏈淀粉酶降解的時間被測定，結(jié)果如下：在30和50小時之間，觀察全長支鏈淀粉酶分子部分剪切成分別缺少N-端98和102個氨基酸的截短的分子。剪切分別發(fā)生在谷氨酸殘基E99和E103的N-末端，并且可以通過HPLC可見。意料不到地，1-98和1-102被截短的支鏈淀粉酶分子保留支鏈淀粉酶活性，并且，甚至更意料不到的是，表明這種活性高于全長支鏈淀粉酶的活性。51小時后，支鏈淀粉酶分子進一步降解導(dǎo)致活性降低，最后所有活性消失。盡管如此，支鏈淀粉酶肽和編碼這些肽的核苷酸序列的設(shè)計仍有改進的余地。因此，所需要的是更高效地生產(chǎn)支鏈淀粉酶的化合物和方法，例如，通過限制蛋白水解性降解，增加發(fā)酵滴度(fermentationtiter)或增加支鏈淀粉酶活性。發(fā)明概述本發(fā)明涉及支鏈淀粉酶——一種肽酶——的新的和非顯而易見形式。本發(fā)明的支鏈淀粉酶包括新的修飾，所述新的修飾導(dǎo)致生產(chǎn)滴度和/或耐受降解(例如，由蛋白酶引起的酶促降解)方面的優(yōu)越性能和/或在靶向底物材料的分解中比親本(“野生型”)肽更具有活性。在這方面，本發(fā)明涉及肽SEQIDNO：2、SEQIDNO：4和SEQIDNO：6的支鏈淀粉酶，分別如圖7(b)、8(b)和9(b)所示。本發(fā)明還涉及編碼氨基酸序列SEQIDNOS：2、4和6的核苷酸序列。各自的核苷酸序列還分別作為SEQIDNOS：1、3和5在圖7(a)、8(a)和9(a)中示出。如本領(lǐng)域所熟知，遺傳密碼冗余，多個核苷酸密碼子編碼相同氨基酸。因此，本發(fā)明又涉及編碼肽SEQIDNOS：2、4和6的任何可選的核苷酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠基于本說明書和本領(lǐng)域知識的教導(dǎo)，確定編碼本發(fā)明肽序列的核苷酸序列。本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明肽的表達構(gòu)建物。本發(fā)明不限于任何特定的表達構(gòu)建物，只要其能夠表達本發(fā)明的肽。在這方面，合適的表達構(gòu)建物的非限制性實例示意地顯示在圖4-6的(a)部分。如在本說明書的詳述和實施例部分中的更詳細的解釋，在一種實施方式中，通過密碼子優(yōu)化技術(shù)來修飾編碼親本支鏈淀粉酶肽(來自Bacillusderamificans)的序列，以產(chǎn)生密碼子優(yōu)化的核苷酸序列[SEQIDNO：1]，所述優(yōu)化的核苷酸序列編碼野生型(即，親本)支鏈淀粉酶氨基酸序列[SEQIDNO：2]的復(fù)制品。編碼氨基酸序列[SEQIDNO：2]的核苷酸序列在兩個方向上被克隆至地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)整合載體pICatH的Xhol位點，產(chǎn)生表達構(gòu)建物的Oril(pICatH-PUL-Oril)和Ori2(pICatH-PUL-Ori2)形式。在另一種實施方式中，編碼親本支鏈淀粉酶肽的序列被修飾，以產(chǎn)生支鏈淀粉酶肽，其中N-端的104個氨基酸已被刪除。在一種實施方式中，編碼這種新型支鏈淀粉酶的核苷酸序列也是密碼子優(yōu)化的[SEQIDNO：3]。由該構(gòu)建物，PULm104表達的肽在SEQIDNO：4中給出(見，圖8(b))。編碼[SEQIDNO：4]的核苷酸序列在兩個方向上被克隆到地衣芽孢桿菌整合載體pICatH的XhoI位點，產(chǎn)生表達構(gòu)建物的Oril(pICatH-PULml04-Oril)和Ori2(pICatH-PULml04-Ori2)形式。在另一種實施方式中，編碼親本支鏈淀粉酶肽的序列被改變，以將99和103位上的氨基酸殘基從谷氨酸(E)置換為谷氨酰胺(Q)，從而使所產(chǎn)生的肽更能抵抗在這些位置的蛋白水解降解。在一種實施方式中，編碼這種新型支鏈淀粉酶的核苷酸序列也是密碼子優(yōu)化的[SEQIDNO：5]。由該核酸序列PUL_E99Q_E103Q表達的肽在SEQIDNO：6中給出。編碼[SEQIDNO：6]的核苷酸序列在兩個方向上被克隆到地衣芽孢桿菌整合載體pICatH的Xhol位點，產(chǎn)生表達構(gòu)建物的Oril(pICatH-PUL_E99Q_E103Q-Oril)和Ori2(plCat-PUL_E99Q_E103Q-Ori2)形式。本發(fā)明還涉及將本發(fā)明的表達構(gòu)建物轉(zhuǎn)染到適合的宿主生物。本發(fā)明不限于任何具體宿主生物。宿主生物可以是，例如，微生物、真核細胞或組織培養(yǎng)物、植物細胞或組織培養(yǎng)物、或真菌細胞或組織培養(yǎng)物。在優(yōu)選的實施方式中，宿主生物為微生物。優(yōu)選的宿主生物包括但不限于：芽孢桿菌種(Bacillussp.)(特別是枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)和B.deramificicans)，埃希氏大腸桿菌，里氏木霉，啤酒酵母或黑曲霉。在最優(yōu)選的實施方式中，宿主生物是地衣芽孢桿菌。本發(fā)明涉及從培養(yǎng)本發(fā)明的宿主生物的培養(yǎng)基中分離和純化本發(fā)明的肽。在這點上，本發(fā)明不限于任何特定的分離和純化技術(shù)，只要其產(chǎn)生10％的最低純度。在更優(yōu)選的實施方式中，分離和純化的肽的最低純度為25％，在甚至更優(yōu)選的實施方式中，分離和純化的肽的最低純度為50％。還在更優(yōu)選的實施方式中，分離和純化的肽的最低純度為75％。在最優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明分離和純化的肽的最低純度為90％。最低純度可通過總干重百分比或本領(lǐng)域已知的其它適合的方法測量。本發(fā)明不限于任何分離和純化本發(fā)明的肽的具體純化方法。本領(lǐng)域已知的任何肽純化方法都是適合的。合適的純化方法非限制性實例包括親和層析、沉淀、大小排阻層析、薄層層析、電泳、大小過濾等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認識到本發(fā)明的支鏈淀粉酶生物學(xué)活性片段可用于替代本發(fā)明上下文中的全長序列或等價物。“生物學(xué)活性片段”意圖包括本發(fā)明序列的任何類似物、模擬、平截、缺失和/或置換。本發(fā)明的支鏈淀粉酶的模擬肽和支鏈淀粉酶活性結(jié)構(gòu)域可應(yīng)用結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進行計算機設(shè)計，如本領(lǐng)域已知的。另外，在本發(fā)明一種實施方式中，考慮本發(fā)明支鏈淀粉酶核苷酸序列的類似物和突變可通過定向分子進化產(chǎn)生。所述定向分子進化的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的(見，例如，Stemmer等人的美國專利第5,605,793號或Short的美國專利第6,537,776號，其通過引用在此并入)。與本發(fā)明的肽相比，由定向分子進化產(chǎn)生的蛋白質(zhì)將具有更小、更大或相同的作為支鏈淀粉酶起作用的能力。在本發(fā)明另一種實施方式中，本發(fā)明的肽被用作融合蛋白，其具有例如，其它的結(jié)構(gòu)性或功能性肽結(jié)構(gòu)域。這種結(jié)構(gòu)域可以，例如，賦予融合蛋白其它的酶促能力或?qū)㈦南薅ㄔ诒砻?。本發(fā)明的肽還包括那些由于存在多個基因、可選的轉(zhuǎn)錄事件、可選的RNA剪接事件和可選的翻譯和翻譯后事件而出現(xiàn)的肽。多肽可在體系例如培養(yǎng)的細胞中表達，當(dāng)表達的支鏈淀粉酶在天然細胞中表達時所述體系導(dǎo)致出現(xiàn)基本上相同的翻譯后修飾，或在這樣的體系中表達，當(dāng)在天然細胞中表達時所述體系導(dǎo)致出現(xiàn)的翻譯后修飾刪除。本發(fā)明還包括組合物，所述組合物包括一種或多種支鏈淀粉酶肽(或編碼它的核酸)和一種或多種另外的成分，例如：載體、稀釋劑或溶劑。所述另外的成分可以是使組合物可用于體外、體內(nèi)、制藥或獸醫(yī)應(yīng)用的成分。在另一方面，本發(fā)明提供基本上純的核酸，所述核酸具有或包括編碼肽的核苷酸序列，其氨基酸序列包括或者是本發(fā)明支鏈淀粉酶肽的序列。在優(yōu)選的實施方式中，本主題支鏈淀粉酶核酸將包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，例如，轉(zhuǎn)錄啟動子或轉(zhuǎn)錄增強子序列中的至少一個，其可操作地連接至支鏈淀粉酶基因序列，例如使支鏈淀粉酶基因序列適合用作表達載體。而在進一步優(yōu)選的實施方式中，編碼本發(fā)明支鏈淀粉酶肽的核酸，在嚴格條件下與核酸探針雜交，所述核酸探針對應(yīng)于SEQIDNOS：1、3或5的至少12個連續(xù)核苷酸，更優(yōu)選地對應(yīng)于SEQIDNO：1、3或5的至少20個連續(xù)核苷酸。本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式提供本文描述的支鏈淀粉酶在多種工業(yè)裝置中的應(yīng)用。例如，本發(fā)明涉及本發(fā)明的新型支鏈淀粉酶變體在食品原料(包括，但不限于各種生面團和糖漿)、飲料(包括且不限于各種釀造飲料，如啤酒和強麥酒)、生物乙醇和眾多本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它產(chǎn)品的生產(chǎn)中的應(yīng)用。附圖簡述圖1顯示在本方案中設(shè)計的支鏈淀粉酶方法和支鏈淀粉酶變體的示意圖。圖2示出存在于本發(fā)明制造的支鏈淀粉酶表達菌株中的構(gòu)建體的分子結(jié)構(gòu)，其與菌株BMP139中的支鏈淀粉酶表達構(gòu)建物相比較。圖3示出pICatH載體的示意圖。pICatH載體包含溫度敏感的復(fù)制起點(oripE194，用于在芽孢桿菌(Bacillus)中復(fù)制)、oripBR322(用于在大腸桿菌(E.coli)中擴增)、用于篩選的新霉素抗性基因和具有重復(fù)的天然地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)氯霉素抗性基因(cat)——用于篩選、染色體整合和盒擴增。圖4示出pICatH-PULOril構(gòu)建物的示意圖。圖5示出pICatH-PULml04Oril構(gòu)建物的示意圖。圖6示出pICatH-PUL_E99Q_E103QOri構(gòu)建物的示意圖。圖7A-B示出密碼子優(yōu)化的“野生型”支鏈淀粉酶(PUL)的(a)核酸序列[SEQIDNO：1]和(b)氨基酸序列[SEQIDNO：2]。圖8A-B示出PULm104支鏈淀粉酶的(a)核酸序列[SEQIDNO：3]和(b)氨基酸序列[SEQIDNO：4]。圖9A-B示出PUL_E99Q_E103Q支鏈淀粉酶的(a)核酸序列[SEQIDNO：5]和(b)氨基酸序列[SEQIDNO：6]。定義部分應(yīng)當(dāng)注意，如本說明書和所附權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式“一”(a)、“一”(an)和“該”(“the”)包括復(fù)數(shù)指代物，除非上下文另外明確說明。因此，例如，提及含有“化合物”(“acompound”)的組合物包括兩種或多種化合物的混合物。還應(yīng)注意，術(shù)語“或”通常使用的意義包括“和/或”，除非上下文另有明確說明。術(shù)語“支鏈淀粉酶”是指一種特定種類的葡聚糖酶，降解普魯分支葡聚糖的淀粉分解內(nèi)酶。它是由例如克雷伯菌屬(Klebsiella)的革蘭氏陰性細菌作為細胞外的細胞表面錨定脂蛋白產(chǎn)生的。但是，革蘭氏陽性細菌產(chǎn)生支鏈淀粉酶作為分泌蛋白。I型支鏈淀粉酶特定地攻擊α-1,6鍵，而II型支鏈淀粉酶也能夠水解α-1,4鍵。它還可由某些其它細菌和古細菌產(chǎn)生。支鏈淀粉酶在生物技術(shù)中用作去污劑。支鏈淀粉酶(EC3.2.1.41)還被稱為普魯分支葡聚糖-6-葡聚糖水解酶(脫支化酶)。普魯分支葡聚糖被認為是由α-l,6-糖苷鍵連接的麥芽三糖單位的鏈。支鏈淀粉酶水解切割普魯分支葡聚糖(α-葡聚糖多糖)。術(shù)語“密碼子優(yōu)化”是指提高表達水平的技術(shù)，其通過用編碼相同氨基酸但被宿主生物更有效處理的密碼子置換編碼序列中的核苷酸密碼子進行。不同物種之間的密碼子偏好性可顯著不同。為提高外源蛋白在特定表達系統(tǒng)(細菌、真菌、酵母、昆蟲、植物或哺乳動物細胞)中的表達水平，很重要的是調(diào)整外源蛋白密碼子的頻率，以匹配宿主表達系統(tǒng)密碼子的頻率。一個典型的實例是GFP(綠色熒光蛋白，greenfluorescentprotein)，其被優(yōu)化以在哺乳動物細胞中獲得高水平表達。因此，可將密碼子優(yōu)化用于在多種宿主生物中表達本發(fā)明蛋白——在所述宿主生物中這種序列可能不能有效表達，如果進行表達的話。術(shù)語“表達載體”如本文使用是指重組DNA分子，其含有所期望的編碼序列和適合的核酸序列，它們對于可操作連接的編碼序列在具體宿主生物中表達是必需的。原核生物表達所必需的核酸序列包括啟動子，任選地，操作子序列，核糖體結(jié)合位點和可能的其它序列。如本文使用的“異源啟動子”是指天然地不與基因或純化的核酸連接的啟動子。術(shù)語“啟動子”、“啟動子元件”或“啟動子序列”如本文使用是指當(dāng)連接至感興趣的核苷酸序列時，能夠控制感興趣的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA的DNA序列。啟動子典型地，雖然不是必要地，位于感興趣的核苷酸序列的5’(即上游)，啟動子控制到mRNA的轉(zhuǎn)錄并提供用于RNA聚合酶特異結(jié)合的位點和用于轉(zhuǎn)錄起始的其它轉(zhuǎn)錄因子。應(yīng)用于調(diào)控元件的術(shù)語“細胞類型特異的”或“宿主生物特異的”或等同術(shù)語是指這樣的調(diào)節(jié)元件，其能夠指導(dǎo)感興趣的核苷酸序列在特定類型的細胞或生物中選擇性表達——所述相同的感興趣核苷酸序列在不同類型細胞或生物中、相同組織內(nèi)相對地沒有表達。當(dāng)被應(yīng)用于調(diào)節(jié)元件時，術(shù)語“細胞類型特異的”或“宿主生物特異的”也指這樣的調(diào)控元件，其能夠促進感興趣的核苷酸序列分別在單一組織或生物內(nèi)的區(qū)域中選擇性表達。肽的“分離”、“純化制備”或“基本上純的制備物”如本文使用是指這樣的多肽，其已被鑒定并從至少一種通常與其天然狀態(tài)結(jié)合或從其實際來源獲得的污染物中分離。所述至少一種其它污染物可以是，例如，與其一起天然發(fā)生的其它蛋白、脂肪和核酸。優(yōu)選地，多肽還從例如抗體或凝膠基質(zhì)的物質(zhì)分離，所述凝膠基質(zhì)例如聚丙烯酰胺，用于純化所述多肽。優(yōu)選地，多肽占純化制備物干重的至少10、20、50、70、80或95％。優(yōu)選地，制備物包含：足夠的多肽用于蛋白測序；至少1、10或100毫克的多肽；至少1、10或100毫克的多肽?！凹兓募毎苽湮铩比绫疚氖褂檬侵冈谥参锘騽游锛毎那闆r下，細胞的體外制備物而不是全部完整的植物或動物。在培養(yǎng)的細胞或微生物細胞的情況下，其由至少10％和更優(yōu)選地50％的目標(biāo)細胞制備物組成?！盎旧霞兊暮怂帷保?，基本上純的DNA，是指這樣的核酸，其是如下的一種或兩種：不與一個或兩個序列例如編碼序列直接鄰近，其與所述編碼序列在核酸所來源的生物的天然發(fā)生的基因組中直接鄰近(即，一個在5'端而一個在3'端)；或其基本上沒有這樣的核酸序列——其在所述核酸來源的生物中存在。術(shù)語包括，例如，重組DNA，其整合到載體中，例如，整合到自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《局?，或到原核生物或真核生物的基因組DNA中，或作為獨立于其它DNA序列的單獨分子(例如，由PCR或限制內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)存在。另外，術(shù)語“分離的”，當(dāng)用于涉及核酸時，如在“分離的核酸序列”中是指這樣的核酸序列，其被鑒定并從至少一種通常與其以天然狀態(tài)結(jié)合或從其實際來源獲得的污染物核酸中分離。分離的核酸是以不同于在自然中發(fā)現(xiàn)的形式或設(shè)置存在的核酸。相反地，未分離的核酸是指核酸例如DNA和RNA，它們以天然狀態(tài)存在。例如，給定的DNA序列(例如，基因)在宿主細胞染色體上發(fā)現(xiàn)，與比鄰基因(neighboringgene)相鄰；RNA序列，如編碼特定蛋白的特定mRNA序列，在細胞中發(fā)現(xiàn)，作為與眾多編碼眾多蛋白質(zhì)的其它mRNA一起的混合物。然而，包含例如SEQIDNO:1的分離的核酸序列包括，例如，在細胞中的核酸，所述細胞通常含有SEQIDNO:1，其中所述核酸序列在不同于天然細胞的染色體內(nèi)或染色體外位置，或另外地，由與在自然中發(fā)現(xiàn)的核酸序列不同的核酸序列側(cè)翼。分離的核酸序列可以單鏈或雙鏈形式存在。當(dāng)分離的核酸序列被用于表達蛋白質(zhì)時，所述核酸序列將包含(最少)有義或編碼鏈的至少一部分(即，核酸序列可以是單鏈的)。可選地，它可包含有義和反義鏈(即，核酸序列可以是雙鏈的)?！巴础比绫疚氖褂檬侵竷蓚€多肽分子之間或兩個核酸分子之間的序列相似性。當(dāng)兩個對比序列的一個位置被相同堿基或氨基酸單體亞單位占據(jù)時，例如，如果兩個DNA分子中的每個DNA分子的一個位置被腺嘌呤占據(jù)，那么，在那個位置上分子同源。兩個序列之間的同源性百分比是兩個序列共有的匹配或同源位置的數(shù)目除以對比位置的數(shù)目×100的函數(shù)。例如，如果在兩個序列中10分之6的位置匹配或同源，那么兩個序列是60％同源。例如，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％同源性。通常，比較在比對兩個序列時進行，以給出最大同源性。術(shù)語“肽(一個或多個)”、“蛋白(一種或多種)”和“多肽(一種或多種)”于此可互換使用。術(shù)語“蛋白酶”是指蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的多肽結(jié)構(gòu)域或多肽，它們源于微生物例如真菌、細菌，或源于植物或動物，并且具有催化蛋白骨架上一個或多個不同位置上的肽鍵的切割的能力。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的支鏈淀粉酶蛋白是分離的或純化的。純化或分離的意思是由于將支鏈淀粉酶從某些或所有自然發(fā)生的、與其自然結(jié)合的組分中分離，支鏈淀粉酶蛋白從其自然狀態(tài)發(fā)生改變。這種分離或純化的完成可以通過本領(lǐng)域公認的分離技術(shù)，例如離子交換層析、親和層析、疏水分離、透析、蛋白酶處理、硫酸銨沉淀或其它蛋白質(zhì)鹽沉淀、離心、大小排阻層析、過濾、微過濾、在梯度上的凝膠電泳或分離進行，從而去除在最終組合物中不期望的完整細胞、細胞碎片、雜質(zhì)、外來蛋白或酶。進一步可能的是隨后將組分加入到含有支鏈淀粉酶的組合物，這可提供額外優(yōu)勢，例如，活化劑、抗抑制劑、希望的離子、控制pH的化合物或其它酶。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的支鏈淀粉酶蛋白通過重組方法產(chǎn)生。如本文使用的“微生物”是指細菌、真菌、病毒、原生動物和其它微生物或微小生物。在本發(fā)明中，微生物用作外源肽表達的宿主。如本文使用的“衍生物”、“變體”或“修飾的肽、多肽或蛋白質(zhì)”表示來源于前體蛋白(例如天然蛋白)的蛋白質(zhì)，其是通過在C-和N-端的任一端或兩端加入一個或多個氨基酸，在氨基酸序列的一個或多個不同位點置換一個或多個氨基酸，在蛋白質(zhì)任一端或兩端或者在氨基酸序列中的一個或多個位點缺失一個或多個氨基酸，或在氨基酸序列中的一個或多個位點插入一個或多個氨基酸而得到。優(yōu)選地如下獲得支鏈淀粉酶衍生物制備物：修飾編碼天然蛋白的DNA序列，將該DNA序列轉(zhuǎn)化至適合的宿主，并且表達修飾的DNA序列以形成支鏈淀粉酶衍生物。本發(fā)明的“衍生物”包括肽，其包括與前體氨基酸序列(例如野生型或天然狀態(tài)的支鏈淀粉酶)相比改變了的氨基酸序列，其中所述肽保留前體支鏈淀粉酶特有的支鏈淀粉酶性質(zhì)，但是在某些具體方面具有改變的性質(zhì)。例如，支鏈淀粉酶衍生物可具有增加的最適pH，對酶促降解或其它降解增加的抗性，增加的酶促有效性，增加的溫度或氧化穩(wěn)定性，但保留其特有的酶促修飾活性。類似地，根據(jù)本發(fā)明的衍生物包括蛋白質(zhì)、或其它底物、結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其已被添加或修飾以改變其底物結(jié)合能力?？煽紤]的是根據(jù)本發(fā)明的衍生物源于編碼支鏈淀粉酶衍生物的DNA片段，其中表達的支鏈淀粉酶衍生物的功能性活性被保留。衍生物進一步包括改變支鏈淀粉酶特性的化學(xué)修飾。通常地，支鏈淀粉酶衍生物將具有至少約50％、70％或85％氨基酸序列同一性，優(yōu)選地至少約85％氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約90％氨基酸序列同一性，甚至更優(yōu)選地至少約95％氨基酸序列同一性，還更優(yōu)選地98％氨基酸序列同一性。優(yōu)選地，任何氨基酸置換是使用L-氨基酸的“保守氨基酸置換”，其中一種氨基酸被另一種生物學(xué)相似的氨基酸置換。保守氨基酸置換是保持被取代氨基酸的通常的電荷、疏水性/親水性、和/或空間排列體積(stericbulk)的那些置換。保守置換的實例是在下列組之間的那些：GIy/Ala，Val/Ile/Leu，Lys/Arg，Asn/Gln，GIu/Asp，Ser/Cys/Thr和Phe/Trp/Tyr。衍生物可例如只有1至10個氨基酸殘基不同，如6-10個，只有5個、只有4、3、2或甚至1個氨基酸殘基不同。表1于此示例性說明在本領(lǐng)域公認的氨基酸置換。如在此使用的，支鏈淀粉酶的“天然序列”或支鏈淀粉酶的“野生型”序列包括多肽，其具有與源于天然的親本菌株的支鏈淀粉酶相同的氨基酸序列，或與來自從其制備修飾或衍生支鏈淀粉酶的支鏈淀粉酶相同的氨基酸序列，例如，由本發(fā)明的親本菌株B.deramificans(BMP139)表達的支鏈淀粉酶。這種天然序列的支鏈淀粉酶可從自然界分離或可通過重組或合成方法產(chǎn)生。在一種實施方式中，術(shù)語“野生型”或“天然序列”的支鏈淀粉酶是指這樣的支鏈淀粉酶肽，其中本發(fā)明變體從其衍生，并且為圖7b中的SEQIDNO：2。如此處使用的，關(guān)于此處鑒定的氨基酸或核苷序列的“百分比(％)序列同一性”被定義為候選序列中與支鏈淀粉酶序列中的氨基酸殘基或核苷相同的氨基酸殘基或核苷的百分比，如有必要，在經(jīng)過比對序列和引入空位(gap)后，以獲得最大百分比序列同一性，并且不考慮將任何保守置換作為序列同一性的部分。進行序列比對和確定序列同一性的方法是普通技術(shù)人員已知的，其可以進行而無不適當(dāng)?shù)膶嶒?，并且同一性?shù)值的計算可以明確獲得。參見，例如，Ausubel等人，eds.(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology,第19章(GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork)；和ALIGN程序(Dayhoff(1978)inAtlasofProteinSequenceandStructure5:Suppl.3(NationalBiomedicalResearchFoundation,Washington,D.C.)。許多算法可用于對比序列和確定序列同一性，并且包括，例如同源性比對算法，Needleman等人，(1970)J.MoI.Biol.48:443；局部同源性算法，Smith等人，(1981)Adv.Appl.Math.2:482；搜索相似方法，Pearson等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444；Smith-Waterman算法(Meth.MoI.Biol.70:173-187(1997)；以及BLASTP、BLASTN和BLASTX算法(見Altschul等人，(1990)J.MoI.Biol.215:403-410)。使用這些算法的計算程序也是可用的，包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件，或WU-BLAST-2(Altschul等人，Meth.Enzym.,266:460-480(1996))；或GAP、BESTFIT、BLAST(Altschul等)，見上文，F(xiàn)ASTA和TFASTA，可獲自GeneticsComputingGroup(GCG)package,Version8,Madison,Wis.,USA；和Intelligenetics,MountainView,Calif的PC/Gene程序中的CLUSTAL。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可確定用于測定比對的適合參數(shù)，包括為獲得被比較的序列長度上的最大比對所需的算法。優(yōu)選地，使用由程序確定的默認參數(shù)測定序列同一性。具體地，可通過Smith-Waterman同源性搜索算法測定序列同一性(Meth.MoI.Biol.70:173-187(1997))，如使用仿射間隙搜索在MSPRCH程序(OxfordMolecular)中執(zhí)行的，所述仿射間隙搜索具有下列搜索參數(shù)：間隙開放罰分(gapopenpenalty)為12并且間隙延伸罰分(gapextensionpenalty)為1。優(yōu)選地，成對氨基酸比較可使用GeneticsComputerGroup,Inc.,Madison,Wis.的GCG序列分析軟件包的GAP程序進行，使用blosum62氨基酸置換矩陣，其間隙量為12并且長度量為2。對于兩個氨基酸序列的最適比對，變體氨基酸序列的連續(xù)片段相對于參考氨基酸序列可具有額外的氨基酸殘基或缺失的氨基酸殘基。用于與參考氨基酸序列比較的連續(xù)片段包括至少20個連續(xù)的氨基酸殘基，并可以是30、40、50或更多個氨基酸殘基。與衍生物的氨基酸序列中包括空位有關(guān)的增加的序列同一性的修正可通過指定空位罰分進行。如本文使用，“表達構(gòu)建物”(或“表達載體”)是指DNA構(gòu)建物，其包括被可操作連接到適合的控制序列的DNA序列，所述適合的控制序列能夠影響DNA在合適宿主內(nèi)的表達。這種控制序列可包括：影響轉(zhuǎn)錄的啟動子、任選的控制轉(zhuǎn)錄的操作子序列、編碼mRNA上合適的核糖體結(jié)合位點的序列以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。本發(fā)明不限于使用任何具體表達構(gòu)建物。不同細胞類型優(yōu)選地使用不同的表達載體。例如，用于枯草芽孢桿菌的載體的優(yōu)選啟動子是AprE啟動子；用于Bacillusderamificans的載體的優(yōu)選啟動子是amyL啟動子；用于大腸桿菌(E.coli)的優(yōu)選啟動子是Lac啟動子；用于啤酒酵母的優(yōu)選啟動子是PGKl；用于黑曲霉的優(yōu)選啟動子是glaA；以及用于里氏木霉的優(yōu)選啟動子是cbhI。載體可以是質(zhì)粒、噬菌體?；騼H僅是可能的基因組插入。一旦被轉(zhuǎn)化(或轉(zhuǎn)染)至適合的宿主，表達構(gòu)建物可不依賴于宿主基因組進行復(fù)制和發(fā)揮功能，或者可以在適合的條件下，整合到宿主本身的基因組中。在本說明書中，術(shù)語“質(zhì)?！?、“載體”和“表達構(gòu)建物(一種或多種)”有時互換使用。然而，本發(fā)明意圖包括其它形式的表達載體，其發(fā)揮等同功能并且其是或成為本領(lǐng)域已知的。因此，大量的宿主/表達載體組合可用于表達本發(fā)明的DNA序列。本說明書的其它地方未提及的對本發(fā)明有用的表達載體，例如，可由染色體片段、非染色體和合成的DNA序列組成，例如各種已知的SV40衍生物和已知的細菌質(zhì)粒，例如，來自大腸桿菌(E.coli)的質(zhì)粒，其包括colEl、pCRl、pBR322、pMb9、pUC19和其衍生物；更寬宿主范圍的質(zhì)粒，例如RP4；噬菌體DNA，例如噬菌體λ的眾多衍生物，例如NM989；其它DNA噬菌體，例如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體；酵母質(zhì)粒，例如2υ質(zhì)?；蚱溲苌?，用于真核細胞的載體，例如用于動物細胞的載體和源于質(zhì)粒和噬菌DNA組合的載體，如被修飾從而使用噬菌體DNA或其它表達控制序列的質(zhì)粒。使用本發(fā)明表達載體的表達技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并通常描述在，例如Sambrook等人，MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，第二版，ColdSpringHarborPress(1989)。通常，包括本發(fā)明DNA序列的這種表達載體被轉(zhuǎn)化至單細胞宿主，其通過整合事件直接插入至特定物種的基因組中進行(參見，例如Bennett&Lasure，MOREGENEMANIPULATIONSINFUNGI，AcademicPress，SanDiego，pp.70-76(1991)和其引用的描述靶向基因組插入到真菌宿主的文章)。術(shù)語“可操作連接”、“可操作組合”和“可操作順序”如本文使用是指連接核酸序列，以使它們發(fā)揮它們預(yù)期的功能。例如，可操作連接啟動子序列至感興趣的核苷酸序列是指連接啟動子序列和感興趣的核苷酸序列，以使啟動子序列能夠指導(dǎo)感興趣的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或感興趣的核苷酸序列編碼的多肽的合成的方式進行。類似地，將具有年齡-相關(guān)調(diào)節(jié)活性的核酸序列可操作連接到啟動子序列和到感興趣的核苷酸序列是指，連接具有年齡-相關(guān)調(diào)節(jié)活性的核酸序列、啟動子序列和感興趣的核苷酸序列，以使具有年齡-相關(guān)調(diào)節(jié)活性的核酸序列能夠在一段時間改變感興趣的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄至mRNA的水平和/或由感興趣的核苷酸序列編碼的多肽的合成的方式進行。如本文使用“宿主生物”、“宿主菌株”或“宿主細胞”是指對于包括根據(jù)本發(fā)明DNA的表達載體適合的宿主。用于本發(fā)明的宿主細胞通常是原核或真核宿主，其包括任何可轉(zhuǎn)化的微生物，其中可獲得表達。在本發(fā)明的內(nèi)容中，例如，宿主菌株可以是枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、Bacillusderamiftcans(或其它芽孢桿菌種)、埃希氏大腸桿菌(Escherichiacoli)、里氏木霉(Trichodermareesei)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或黑曲霉(Aspergillusniger)。以應(yīng)用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的載體來轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞。這種轉(zhuǎn)化的宿主細胞能夠復(fù)制編碼支鏈淀粉酶和其衍生物或變體(突變體)的載體或表達所期望的肽產(chǎn)物或二者兼有。術(shù)語“培養(yǎng)”或“培養(yǎng)條件(一種或多種)”當(dāng)用于生長宿主生物群體時，是指培養(yǎng)容器、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，其適合宿主生物的生長，并且在用本發(fā)明核苷酸序列及其變體轉(zhuǎn)染的宿主生物的情況下，適合產(chǎn)生本發(fā)明的支鏈淀粉酶。本發(fā)明不限于任何具體培養(yǎng)或培養(yǎng)條件，只要前述是令人滿意的。如本文使用，“功能性附著”或“可操作連接”是指調(diào)節(jié)區(qū)，例如啟動子、終止子、分泌信號或增強子區(qū)，其附著到或連接至結(jié)構(gòu)基因并控制該基因的表達。如本文使用，物質(zhì)(例如多核苷酸或蛋白質(zhì))“源自”微生物是指該物質(zhì)是該微生物本身的?！澳久?Trichoderma)”或“木霉種(Trichodermasp.)”是指任何真菌菌株，其以往被分類為木霉(Trichoderma)或目前被分類為木霉(Trichoderma)。優(yōu)選地，該物種是長柄木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或綠色木霉(Trichodermaviride)。在本發(fā)明中，木霉種可作為本發(fā)明的宿主生物使用。如本文所述，本發(fā)明的一個方面以“基本上純的”(或重組的)核酸和/或這種核酸的等價物為特征，所述核酸包括編碼支鏈淀粉酶多肽的核苷酸序列。術(shù)語核酸如本文使用可包括片段和等價物。術(shù)語“等價物”是指編碼功能上等同的多肽或功能上等同的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。等同的核苷酸序列包括由于一個或多個核苷酸置換、添加或缺失而不同的序列，例如等位變體，并且包括與SEQIDNO：1中示出的支鏈淀粉酶的核苷酸序列不同的序列，原因在于遺傳密碼的簡并性。除非另有所述，本發(fā)明實踐采用細胞生物學(xué)、細胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，其在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍之內(nèi)。這種技術(shù)描述于文獻中。于此引用的所有出版物、專利和專利申請通過引用為所有目的全部引入于此。見例如：MolecularCloningALaboratoryManual,2ndEd.,Sambrook,Fritsch和Maniatis編輯(ColdSpringHarborLaboratoryPress:1989)；DNACloning,VolumesI或II(D.N.Glover編輯,1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gaited.,1984)；Mullis等，美國專利號：4,683,195；NucleicAcidHybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins編輯，1984)；TransformationAndTranslation(B.D.Hames和S.J.Higgins編輯，1984)；CultureOfAnimalCells(R.I.Freshney,AlanR.Liss,Inc.,1987)；ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress,1986)；B.Perbal,APracticalGuideToMolecularCloning(1984)；thetreatise,MethodsInEnzymology(AcademicPress,Inc.,N.Y.)；GeneTransferVectorsForMammalianCells(J.H.MillerandM.P.Calos編輯,1987,ColdSpringHarborLaboratory)；MethodsInEnzymology,VoIs.154and155(Wu等人,編輯),ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(Mayer和Walker編輯,AcademicPress,London,1987)；HandbookOfExperimentalImmunology,VolumesI-IV(D.M.WeirandC.C.Blackwell,編輯,1986)；ManipulatingtheMouseEmbryo,(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1986)。同樣，關(guān)于蛋白酶的制備、表達、分離和使用方法的信息可通過美國專利第6,768,001號獲得，其于此通過引用完整引入。在下列具體描述和權(quán)利要求中，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢將明顯可見。發(fā)明詳述本發(fā)明現(xiàn)僅使用下述定義和實例，通過引用方式詳述于此。所有專利和出版物，包括在這些專利和出版物內(nèi)公開的所有序列，于此明確地通過引用而并入。除非于此另外定義，如本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。Singleton等人的DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY，2DED.，JohnWiley和Sons，NewYork(1994)和Hale&Marham，THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY，HarperPerennial，NY(1991)提供給技術(shù)人員在本發(fā)明中使用的許多術(shù)語的通用字典。雖然任何類似或等同于那些在此所述的方法和材料可在本發(fā)明的實踐或測試中使用，但是優(yōu)選的方法和材料被描述。數(shù)值范圍包括定義該范圍的數(shù)值。除非另有所述，分別地，核酸以5'至3'方向從左向右書寫；氨基酸序列以氨基至羧基的方向從左向右書寫。對本領(lǐng)域的定義和術(shù)語，專業(yè)人員可具體注意Sambrook等人，1989和AusubelFM等人，1993。應(yīng)該理解本發(fā)明不限于所描述的具體方法、方案和試劑，因為這些可變化。數(shù)值范圍包括定義該范圍的數(shù)值。除非另有所述，分別地，核酸以5'至3'方向從左向右書寫；氨基酸序列以氨基至羧基的方向從左向右書寫。本文提供的標(biāo)題不限制本發(fā)明的各個方面或?qū)嵤┓绞剑淇赏ㄟ^作為整體參考說明書而理解。因此，緊接在下面定義的術(shù)語通過作為整體參考說明書而被更充分地定義。分子生物學(xué)在一種實施方式中，本發(fā)明提供在amyL啟動子控制下異源基因的表達。因此，本發(fā)明依賴于重組遺傳領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。公開用于本發(fā)明的普通方法的基本文本包括Sambrook等人，MolecularCloning，ALaboratoryManual(2nded.1989)；Kriegler，GeneTransferandExpression:ALaboratoryManual(1990)和Ausubel等人編輯,CurrentProtocolsinMolecularBiology(1994))。包括絲狀真菌的纖維素酶基因啟動子序列的異源基因，在被轉(zhuǎn)化到里氏木霉細胞用于復(fù)制和/或表達之前，通常被克隆到中間載體中。這些中間載體典型地是原核載體，例如質(zhì)?；虼┧筝d體。為了獲得克隆基因的高水平表達，異源基因優(yōu)選地位于與自然發(fā)生纖維素酶基因距啟動子的距離大約相同的距離上。但是，如本領(lǐng)域已知的，該距離的一些變化可允許而不損失啟動子功能。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可意識到自然啟動子可通過置換、取代、添加或去除一種或多種核苷而不改變其功能來修飾。本發(fā)明實踐包括并不限于這種對啟動子的改變。表達載體/構(gòu)建物典型地包含轉(zhuǎn)錄單位或表達盒，所述轉(zhuǎn)錄單位或表達盒包含所有異源序列表達所需的附加元件。因此，典型的表達盒包含可操作地連接至異源核酸序列的啟動子和轉(zhuǎn)錄物有效多聚腺嘌呤化作用所需的信號，核糖體結(jié)合位點和翻譯終止。所述盒的附加元件可包括增強子和，如果基因組DNA用作結(jié)構(gòu)基因，具有功能性剪接供體和受體位點的內(nèi)含子。本發(fā)明的實踐不受遺傳構(gòu)建物中啟動子的選擇的限制。但是，示例性啟動子是里氏木霉cbhl、cbh2、egl、eg2、eg3、eg5、xln1和xln2啟動子。除啟動子序列之外，表達盒還應(yīng)包含結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)下游，以提供有效終止。終止區(qū)可從與啟動子序列相同的基因獲得，或可從不同基因獲得。雖然任何真菌終止子在本發(fā)明中可能具有功能，但優(yōu)選的終止子包括：來自構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)trpC基因的終止子(Yelton,M.等人，(1984)PNASUSA81:1470-1474；Mullaney,E.J.等人，(1985)MGG199:37-45)，泡盛曲霉(Aspergillusawamori)或黑曲霉(Aspergillusniger)葡糖淀粉酶基因(Nunberg,J.H.等(1984)Mol.CellBiol.4:2306,Boel,E.等(1984)EMBOJ.3:1581-1585)和米黑毛霉(Mucormiehei)羧基蛋白酶基因(EPO公開號0215594)。用于將遺傳信息傳遞到細胞中的具體表達載體不是特別重要。任何用于在真核或原核細胞中表達的常規(guī)載體均可使用。標(biāo)準(zhǔn)細菌表達載體包括細菌噬菌體λ和Ml3，以及質(zhì)粒如基于pBR322的質(zhì)粒、pSKF、pET23D，和融合表達系統(tǒng)，例如MBP、GST和LacZ。表位標(biāo)記也可以被加到重組蛋白中，以提供方便的分離方法，例如c-myc。通常包括在表達載體中的元件還包括復(fù)制子、編碼抗生素抗性的基因，以允許篩選含有重組質(zhì)粒的細菌、和質(zhì)粒的非重要區(qū)中的獨特的限制位點，以允許異源序列的插入。所選擇的特定抗生素抗性基因不重要，任何本領(lǐng)域已知的許多抗性基因都是適合的。原核序列被優(yōu)選地選擇，因為它們不干擾里氏木霉DNA的復(fù)制或整合。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法可引起轉(zhuǎn)化載體的全部或部分穩(wěn)定整合到絲狀真菌基因組中。但是，也考慮導(dǎo)致維持自我復(fù)制的染色體外轉(zhuǎn)化載體的轉(zhuǎn)化。許多標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染方法可用于產(chǎn)生表達大量異源蛋白的里氏木霉細胞系。某些已公開的、用于將DNA構(gòu)建物引入到生產(chǎn)纖維素酶的木霉(Trichoderma)菌株的方法包括：Lorito,Hayes,DiPietro和Harman,1993,Curr.Genet.24:349-356；Goldman,VanMontagu和Herrera-Estrella,1990,Curr.Genet.17:169-174；Penttila,Nevalainen,Ratto,Salminen和Knowles,1987,Gene6:155-164,用于曲霉(Aspergillus),Yelton,Hamer和Timberlake,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474,用于鐮刀菌屬(Fusarium)，Bajar；Podila和Kolattukudy,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8202-8212,用于鏈霉菌(Streptomyces)，Hopwood等,1985,TheJohnInnesFoundation,Norwich,UK和用于芽孢桿菌(Bacillus)，Brigidi,DeRossi,Bertarini,Riccardi和Matteuzzi,1990,FEMSMicrobiol.Lett.55:135-138)。但是，可使用任何用于將外源核苷酸序列引入到宿主細胞的熟知方法。這些方法包括使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染、凝聚胺(polybrene)、原生質(zhì)體融合、電轉(zhuǎn)化、生物射彈、脂質(zhì)體、顯微注射、原生質(zhì)載體(plasmavector)、病毒載體和任何其它熟知的方法，用于將克隆的基因組DNA、cDNA、合成的DNA或其它外源遺傳物質(zhì)引入至宿主細胞(見，例如，Sambrook等人，上文)。還使用的是農(nóng)桿菌(Agrobacterium)-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，其在美國專利第6,255,115號中描述。僅僅必需的是使用的特定遺傳工程方法能夠成功地將至少一個基因引入到能夠表達異源基因的宿主細胞中。本發(fā)明還涉及由微生物異源產(chǎn)生的支鏈淀粉酶。合適的細菌的實例是革蘭氏陽性細菌，例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)或鉛青鏈霉菌(Streptomyceslividans)或鼠灰鏈霉菌(Streptomycesmurinus)、或革蘭氏陰性細菌，例如大腸桿菌(E.coli)。細菌的轉(zhuǎn)化可通過例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或以已知方式本身使用感受態(tài)細胞來實現(xiàn)。通常，本發(fā)明包括通過表達摻入表達系統(tǒng)的DNA——其已被轉(zhuǎn)化至宿主細胞——來生產(chǎn)支鏈淀粉酶的方法。多種宿主/表達載體組合可以被用于表達本發(fā)明的DNA序列。許多原核和真核表達載體是商業(yè)上可得的。適合的表達載體的選擇在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)。載體可以是質(zhì)粒、噬菌粒、或僅僅是可能的基因組插入。一旦轉(zhuǎn)化至適合的宿主，載體可不依賴于宿主基因組進行復(fù)制和作用，或可以，在某些情況下，整合到宿主本身的基因組中。在本說明書中，質(zhì)粒和載體有時可互換使用，因為質(zhì)粒是目前載體最經(jīng)常使用的形式。但是，本發(fā)明意圖包括這種表達載體的其它形式，其發(fā)揮相等的功能并且是或成為本領(lǐng)域已知的。有用的表達載體例如包括染色體、非染色體和合成的DNA序列的片段，例如對于此目的有用的各種已知的質(zhì)粒和噬菌體。另外，任何的各種表達控制序列通常被用于這些載體。在本發(fā)明中有用的宿主細胞通常是原核的或真核的宿主，包括在其中可獲得根據(jù)本發(fā)明的支鏈淀粉酶表達的任何可轉(zhuǎn)化的微生物。以使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞。這種轉(zhuǎn)化的宿主細胞能夠復(fù)制編碼支鏈淀粉酶和其變體(突變體)的載體或表達所期望的支鏈淀粉酶。這些宿主可包括熟知的真核和原核宿主，例如埃希氏大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌(Pseudomonas)、芽孢桿菌(Bacillus)、鏈霉菌(Streptomyces)、各種真菌、酵母的菌株和動物細胞。優(yōu)選地，所述宿主在細胞外表達本發(fā)明的支鏈淀粉酶便于純化和下游過程。在一些實施方式中，宿主細胞是芽孢桿菌屬的成員；而在某些實施方式中，感興趣的芽孢桿菌(Bacillus)菌株是工業(yè)芽孢桿菌(Bacillus)菌株。工業(yè)芽孢桿菌(Bacillus)菌株的實例包括，但不限于地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、遲緩芽孢桿菌(B.lentus)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。在另外的實施方式中，芽孢桿菌(Bacillus)宿主菌株選自遲緩芽孢桿菌(B.lentus)、短芽孢桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)、嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.cirulans)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)、克勞氏芽孢桿菌(B.clausii)和巨大芽孢桿菌(B.megaterium)，以及芽孢桿菌(Bacillus)屬的其它生物，如上所述。在某些實施方式中，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)被使用。在其它實施方式中，使用地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)。例如，美國專利第5,264,366和4,760,025(RE34,606)號，和US2002/0182734(國際公開號WO02/14490)描述了各種芽孢桿菌(Bacillus)宿主菌株，它們在本發(fā)明中有用，盡管其它適合的菌株被考慮用于本發(fā)明。優(yōu)選地，使用蛋白酶陰性的芽孢桿菌(Bacillus)菌株(基因缺失的，例如△apr或△npr等)。轉(zhuǎn)化芽孢桿菌(Bacillus)種的各種方法是已知的。實際上，用于改變包含質(zhì)粒構(gòu)建物的芽孢桿菌(Bacillus)的染色體和將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌的方法是熟知的。在大多數(shù)方法中，質(zhì)粒隨后從大腸桿菌中分離并被轉(zhuǎn)化到芽孢桿菌(Bacillus)中。然而，使用這種間插微生物例如大腸桿菌不是必須的，并且，在某些實施方式中，DNA構(gòu)建物通過原生質(zhì)體或感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化，被直接轉(zhuǎn)化到感受態(tài)芽孢桿菌宿主中。本發(fā)明的突變體支鏈淀粉酶的表達和純化可以通過本領(lǐng)域公認的用于進行這種過程的方法來實現(xiàn)。在表達載體被引入細胞后，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細胞，其培養(yǎng)條件是有助于在蛋白酶基因啟動子序列控制下的基因表達。大量轉(zhuǎn)化的細胞可如下述實施例所述進行培養(yǎng)。最后，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)物中回收產(chǎn)物。因此，本發(fā)明于此提供所期望多肽的表達和增強分泌，其表達是在基因啟動子序列控制下進行，包括自然發(fā)生淀粉酶基因、融合DNA序和各種異源構(gòu)建物的表達。本發(fā)明還提供用于表達和分泌高水平的這種所期望的肽的方法。蛋白質(zhì)表達本發(fā)明蛋白質(zhì)的生產(chǎn)通過培養(yǎng)用表達載體轉(zhuǎn)化的細胞進行，其中表達載體含有在淀粉酶基因啟動子序列控制下表達的基因。本發(fā)明特別適用于加強蛋白質(zhì)的細胞內(nèi)和/或細胞外產(chǎn)生。蛋白質(zhì)可以是同源的或異源的?？捎杀景l(fā)明生產(chǎn)的蛋白質(zhì)包括但不限于：激素、酶、生長因子、細胞因子、抗體以及類似物。酶包括但不限于：水解酶，例如蛋白酶、酯酶、脂肪酶、酚氧化酶、透酶、淀粉酶、支鏈淀粉酶、纖維素酶、葡萄糖異構(gòu)酶、漆酶和蛋白二硫鍵異構(gòu)酶。適合表達所述基因的條件包括提供給培養(yǎng)物誘導(dǎo)飼養(yǎng)組合物，見例如US-2004-0121446。蛋白質(zhì)產(chǎn)生的最適條件根據(jù)宿主細胞的選擇和待表達的蛋白質(zhì)的選擇而變化。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將通過常規(guī)實驗或優(yōu)化容易確定這些條件。感興趣的蛋白，例如此處所述的支鏈淀粉酶，通常在表達后純化或分離。感興趣的蛋白可以用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種方法分離或純化，這取決于在樣本中存在的其它組分。標(biāo)準(zhǔn)純化方法包括電泳技術(shù)、分子技術(shù)、免疫技術(shù)和層析技術(shù)，包括離子交換、疏水、親和以及反相HPLC層析和聚焦層析。例如，感興趣的蛋白可以使用標(biāo)準(zhǔn)抗感興趣蛋白的抗體柱純化。超濾和滲濾技術(shù)，與蛋白濃度聯(lián)合也是有效的。對適合純化技術(shù)的一般指導(dǎo)，見Scopes,ProteinPurification(1982)。必需的純化程度將依賴于感興趣蛋白的用途而變化。在某些情況下，純化不是必需的。本發(fā)明支鏈淀粉酶的類似物類似物可以在氨基酸序列或以不涉及序列的方式，或以此兩種方式不同于“野生型”親本支鏈淀粉酶或天然發(fā)生的支鏈淀粉酶。非序列修飾包括支鏈淀粉酶的體內(nèi)或體外化學(xué)衍生。非序列修飾包括在乙?；⒓谆?、磷酸化、羧化或糖基化中的改變。優(yōu)選的類似物包括支鏈淀粉酶(或其生物學(xué)活性片段)，其序列不同于“野生型”序列或自然序列，有一個或多個保守氨基酸置換或有一個或多個非保守氨基酸置換、缺失或插入，這些不同不破壞支鏈淀粉酶的生物學(xué)活性。保守置換典型地包括用一種氨基酸置換另一種具有相似性質(zhì)的氨基酸，例如在下列組中的置換：纈氨酸，甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸；以及苯丙氨酸，酪氨酸。可根據(jù)例如下表進行保守置換，所述表描述了普遍接受的維恩圖(Venndiagram)氨基酸分組。表1其它保守置換可從下表獲得。表2保守氨基酸替換本發(fā)明中的其它類似物是帶有增加肽穩(wěn)定性的修飾的那些；這種類似物可含有，例如在肽序列中一個或多個非-肽鍵(其替換肽鍵)。還包括：這樣的類似物，其包括除了天然存在的L-氨基酸之外的殘基，例如D-氨基酸或非天然存在或合成的氨基酸，例如，α或β氨基酸類似物和環(huán)狀類似物。其它實施方式本發(fā)明包括的是：等位變異；自然突變體；誘導(dǎo)突變體；由DNA編碼的蛋白質(zhì)，所述DNA在高或低嚴謹性條件下與編碼SEQIDNO:1的多肽的核酸雜交(對高和低嚴謹性的定義見CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork,1989,6.3.1-6.3.6，通過引用并入于此)；和多肽，其通過抗血清特異性地結(jié)合支鏈淀粉酶，特別是通過抗血清結(jié)合于支鏈淀粉酶活性位點或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的核酸和多肽包括不同于在此公開的序列，原因在于公開序列中的測序錯誤。本發(fā)明還包括片段，優(yōu)選地支鏈淀粉酶的生物學(xué)活性片段或類似物。生物學(xué)活性片段或類似物是具有任何體內(nèi)或體外活性的物質(zhì)，其特征在于SEQIDNOS：2、4和6中示出的支鏈淀粉酶或其它天然存在的支鏈淀粉酶，例如，在此所述的生物學(xué)活性的一種或多種。特別優(yōu)選的是這樣的片段，其存在于體內(nèi)，例如從轉(zhuǎn)錄后加工產(chǎn)生的或從可選地剪切RNA的翻譯產(chǎn)生的片段。片段包括表達在天然或內(nèi)源細胞的那些，例如，翻譯后加工的結(jié)果，例如，去除氨基-端信號序列的結(jié)果以及在表達系統(tǒng)例如CHO細胞中制造的那些。特別優(yōu)選的片段是這樣的片段，例如活性片段，其由蛋白水解切割或可選的剪接事件產(chǎn)生。由于肽例如支鏈淀粉酶通常表現(xiàn)出一定范圍的生理性質(zhì)，并且由于這種性質(zhì)可歸因于分子的不同部分，所以有用的支鏈淀粉酶片段或支鏈淀粉酶類似物是在對支鏈淀粉酶活性的任何生物學(xué)分析中顯示出生物學(xué)活性的物質(zhì)。最優(yōu)選地，片段或類似物在任何體內(nèi)或體外的支鏈淀粉酶分析中，具有10％、40％、60％、70％、80％或至少90％的支鏈淀粉酶活性(SEQIDNOS：2、4和6)。一種制造這種支鏈淀粉酶類似物的方法包括通過定向分子進化合成支鏈淀粉酶類似物，如下所述。支鏈淀粉酶片段可用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生。顯示支鏈淀粉酶生物學(xué)活性的候選片段的能力可以通過如本文所述的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法進行評估。還包括的支鏈淀粉酶肽含有這樣的殘基，其對于肽的生物學(xué)活性是不需要的或由可選的mRNA剪接或可選的蛋白加工事件產(chǎn)生。為了獲得支鏈淀粉酶肽，編碼支鏈淀粉酶的DNA可被引入到表達載體中，載體被引入適合所期望的蛋白表達的細胞，并通過現(xiàn)有技術(shù)方法回收和純化肽?？闺暮偷鞍椎目贵w可通過免疫動物，例如兔或小鼠，以及通過現(xiàn)有技術(shù)方法回收抗-支鏈淀粉酶抗體來制備。發(fā)明的工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明在工業(yè)中具有許多實際應(yīng)用，正如本文可考慮的，這種描述的意圖是示例性的而非包含性的。在幾種實施方式中，本發(fā)明考慮用于乙醇生產(chǎn)、烘焙、果汁生產(chǎn)、釀造、蒸餾、造酒、皮革、油類和脂肪、造紙和紙漿和動物飼料生產(chǎn)。在其它實施方式中，本發(fā)明考慮用作去垢劑和清潔產(chǎn)品的活性“生物學(xué)”組分。這里，蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶被用于分解蛋白、淀粉和脂肪污點。本發(fā)明的實施方式包括測試酶與去污劑成分的相容性，其通過進行穩(wěn)定性研究和在多種配方中測試它們而進行。在另一種實施方式中，本發(fā)明考慮用于紡織工業(yè)中，主要織物和衣物的整理。主要應(yīng)用包括：從編織后織物的絲線中脫漿、去除漿(即，去除纖維的硬成分)；生物拋光過程(Bio-polishing-aprocess)，用于降低起球傾向，并給予織物更加平滑和光澤的外觀；生物磨石過程(Bio-stoning-aprocess)，其中小劑量的酶可代替用于石洗粗斜紋棉布以獲得用舊外觀的傳統(tǒng)浮石。而在另一種實施方式中，本發(fā)明考慮酶促用途，用于將淀粉液化和糖化為葡萄糖并異構(gòu)化為果糖。本發(fā)明可用于將大量的玉米和其它谷物轉(zhuǎn)換為甜料，如高果糖玉米糖漿和麥芽糖糖漿。實施例在下列實驗性公開中，應(yīng)用下列縮寫詞：eq(當(dāng)量)；M(摩爾濃度)；μM(微摩爾濃度)；N(當(dāng)量濃度)；mol(摩爾數(shù))；mmol(毫摩爾數(shù))；μmol(微摩爾數(shù))；nmol(納摩爾數(shù))；g(克)；mg(毫克)；kg(千克)；μg(微克)；L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(納米)；℃(攝氏度)；h(小時)；min(分鐘sec(秒)；msec(微秒)；TLC(薄層層析)；nt(核苷酸)；Q(谷氨酰胺)；E(谷氨酸)；CAP(choloroamphenicol氯霉素)。本發(fā)明在下列實施例中進一步描述，其不以任何方式試圖限制本發(fā)明要求保護的范圍。附圖表示被認為是本發(fā)明的說明書和描述的組成部分。于此引用的所有文獻具體地通過引用如同于此描述。下列實施例被提供用于說明，但不限制所要求保護的發(fā)明。實施例1支鏈淀粉酶變體的設(shè)計設(shè)計下列支鏈淀粉酶變體(見圖1)。“PUL”這是“野生型”B.deramificans支鏈淀粉酶，與BMPl39表達的分子相同?；蛞驯幻艽a子優(yōu)化，由amyL(LAT)啟動子驅(qū)動，并具有amyL信號序列。這種構(gòu)建與存在于BMP139中的構(gòu)建的差別如下(見圖2)。首先，與BMP139中的天然編碼序列相比，該新構(gòu)建具有密碼子優(yōu)化的編碼區(qū)。第二，相對于BMP139中大約800nt，該新構(gòu)建具有較短的100nt的amyL啟動子區(qū)。第三，該新構(gòu)建具有amyL終止子，而BMP139具有B.deramificans支鏈淀粉酶終止子。新和舊的構(gòu)建都具有amyL信號序列并都表達相同的支鏈淀粉酶分子。雖然由這種新構(gòu)建表達的分子與目前產(chǎn)物相同，但其可以具有產(chǎn)生滴度方面的優(yōu)勢，這是密碼子優(yōu)化的結(jié)果?！癙ULmlO4”這是B.deramificans支鏈淀粉酶，其N-端104個氨基酸已被去除。該構(gòu)建包括amyL啟動子、amyL信號序列、密碼子優(yōu)化的支鏈淀粉酶編碼區(qū)，其缺乏編碼成熟支鏈淀粉酶N-端104個氨基酸的序列，和amyL終止子。截短的支鏈淀粉酶PULm104類似PULm98和PULm102分子，所述PULm98和PULm102分子由在E99和E103進行N-端剪切全長支鏈淀粉酶產(chǎn)生。支鏈淀粉酶被刪除可達氨基酸104，以獲得amyL信號序列和支鏈淀粉酶序列ASA-A之間理想的信號肽酶靶共有序列。支持這種截短的支鏈淀粉酶變體的基本原因是遵循之前意料不到的觀察結(jié)果——與全長分子相比，在剪切的支鏈淀粉酶變體中可見較高的特異性活性?！癙UL_E99Q_E103Q”這是B.deramificans支鏈淀粉酶，其中在E99和E103的蛋白酶靶基序已被修飾為Q99和Q103，目的是使支鏈淀粉酶分子可抵抗在E99和E103的剪切。而且，在51h之后的支鏈淀粉酶降解依賴于在E99和El03的起始剪切的情況下，這種修飾可被期望防止51h后的降解和活性降低。實施例2質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)化合成兩種密碼子優(yōu)化的支鏈淀粉酶構(gòu)建物，一種編碼“野生型”支鏈淀粉酶蛋白，另一種編碼E99Q_E103Q變體。兩種都包括具有amyL啟動子(以前已證明允許在E.coli中克隆；較長的啟動子延伸是致死的)、amyL信號序列、密碼子優(yōu)化的支鏈淀粉酶(變體)序列和amyL終止子的57個核苷酸。這些構(gòu)建物用作上述三種支鏈淀粉酶構(gòu)建的PCR-構(gòu)建的模板：“PUL”下列引物被用于從合成的“野生型”支鏈淀粉酶構(gòu)建物擴增“野生型”支鏈淀粉酶構(gòu)建(XhoI位點為粗體)：Plat5-XhoI_FW：cccccgctcgaggcttttcttttggaagaaaatatagggaaaatggtacttgttaaaaattcggaatatttatacaatatcatatgtttacattgaaagggg[SEQIDNO.:7].Tlat-XhoI_RV：tggaatctcgaggttttatcctttaccttgtctcc[SEQIDNO.:8].“PULml04”用于截短的支鏈淀粉酶的表達盒通過融合PCR產(chǎn)生。下列兩個片段從合成的“野生型”支鏈淀粉酶構(gòu)建物中擴增，并隨后融合：覆蓋amyL啟動子和amyL信號序列的片段。覆蓋截短的支鏈淀粉酶編碼序列和amyL終止子的片段。AdA)下列引物用于擴增amyL啟動子和信號序列：Plat5-XhoI_FW[SEQIDNO:7](見上文)。ssLAT-PULmlO4_RV：gcgttgctgactgccggtttagcagctgctgaagctgcagaatgaggcagc[SEQIDNO:9](融合引物；反向支鏈淀粉酶序列，其起始于密碼子105，標(biāo)為粗體)。AdB)下列引物用于擴增支鏈淀粉酶編碼序列和amyL終止子：ssLAT-PULmlO4_FW：gctgcctcattctgcagcttcagcagctgctaaaccggcagtcagcaacgc[SEQIDNO:10](融合引物:支鏈淀粉酶序列，其起始于密碼子105，標(biāo)為粗體)。Tlat-XhoI_RV：[SEQIDNO:8](見上文)。融合引物各自包含兩個序列段，其在模板序列中分開312nt(代表N-端104個氨基酸)。A)和B)所述的兩個PCR片段在使用引物Plat5-XhoI_FW和Tlat-XhoI_RV的PCR反應(yīng)中融合?！癙UL_E99Q_E103Q”E99Q_E103Q支鏈淀粉酶變體的構(gòu)建與“野生型”支鏈淀粉酶的構(gòu)建物相同(見上文1)，采用E99Q_E103Q合成構(gòu)建物作為模板。產(chǎn)生的片段在兩個方向被克隆到地衣芽孢桿菌整合載體pICatH的XhoI位點(圖3)。這樣產(chǎn)生六個構(gòu)建物：pICatH-PUL-Ori1(圖4)、pICatH-PUL-Ori2、pICatH-PULml04-Ori1(圖5)、pICatH-PULmlO4-Ori2、pICatH-PUL_E99Q_E103Q-Oril(圖6)和pICatH-PUL_E99Q_E103Q-Ori2。Ori1和Ori2構(gòu)建物相對于氯霉素-抗性(catH)基因具有相反方向的支鏈淀粉酶基因。圖4、5和6示出三個Oril構(gòu)建物的質(zhì)粒圖譜。所有六種構(gòu)建物被轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌中，并對在AZCL-普魯分支葡聚糖(Megazyme)覆蓋物(0.1％在100mMNaAcpH5中，1％瓊脂)暈形成進行篩選。pICatH-PULm104轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生比任何一種全長支鏈淀粉酶的轉(zhuǎn)化子都大的暈。構(gòu)建物被測序驗證并使用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化將其轉(zhuǎn)化到地衣芽孢桿菌宿主菌株BML612和BML780中。實施例3整合到地衣芽孢桿菌基因組轉(zhuǎn)化后，在含有5μg/ml氯霉素和10μg/ml新霉素的最低再生平板(minimalregenerationplate)篩選轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子被影印鋪板至含有相同抗生素的兩個心浸液瓊脂(HeartInfusion-agar)平板(本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的)，其中一個用AZCL-普魯分支葡聚糖覆蓋，以篩選支鏈淀粉酶陽性的轉(zhuǎn)化子。與枯草芽孢桿菌的情況類似，PULm104轉(zhuǎn)化子顯示出最大的暈。質(zhì)粒被整合進地衣芽孢桿菌染色體上的catH基因座。因此，如表2所示，繼續(xù)進行下列整合，進一步用于去除/擴增：表2質(zhì)粒去除和盒擴增如下進行。無外源DNA的菌株(“免除菌株”)的獲得是通過去除載體序列(“環(huán)出”)，只留下整合進染色體的catH-支鏈淀粉酶表達盒。隨后，通過將所述菌株置于逐步增加的氯霉素濃度(5、25、50、75μg/ml)來擴增表達盒。在每個擴增步驟后，通過用AZCL-普魯分支葡聚糖覆蓋影印平板來監(jiān)控支鏈淀粉酶的產(chǎn)生。對每種菌株，獲得四個擴增水平：CAP5、CAP25、CAP50和CAP75。實施例4評價地衣芽孢桿菌支鏈淀粉酶菌株在所有擴增水平的菌株都被挑取至單個大的含有5μg/ml氯霉素的心浸液瓊脂(HeartInfusion-agar)平板，每個菌株挑取2個，并在37℃生長過夜。支鏈淀粉酶產(chǎn)生菌株BMP139被包括作為基準(zhǔn)。用AZCL-普魯分支葡聚糖瓊脂覆蓋平板來顯現(xiàn)支鏈淀粉酶活性。覆蓋物在37℃溫育8h，隨后在室溫溫育16h。結(jié)果概括于下表3。表3菌株CAP5CAP25CAP50CAP75BML612PULOri1+++++BML612PULOri2+++++BML612PULml04Ori1++++++++BML612PULml04Ori2++++++++菌株CAP5CAP25CAP50CAP75BML612PUL_E99Q_E103QOril++++++BML612PUL_E99Q_E103QOri2++++++BML780PULOri1+++++BML780PULOri2++++++BML780PULmlO4Ori1++++++++++++BML780PULml04Ori2++++++++++++BML780PUL_E99Q_E103QOri1++++++++BML780PUL_E99Q_E103QOri2++++++++BMP139++圖例：+＝暈直徑7-9mm++＝暈直徑10-12mm+++＝暈直徑13-15mm++++＝暈直徑16-18mm+++++＝暈直徑19-2lmm從評價可見，明顯的是擴增導(dǎo)致滴度和/或性能的提高。更具體的結(jié)論是：1)N-端截短的PUL菌株(PULm104)具有非常顯著的優(yōu)于全長支鏈淀粉酶菌株的性能。BML780PULm104CAP75菌株產(chǎn)生的暈比BMP139菌株和BML780PULCAP75菌株的暈，具有增加2.5倍的表面(直徑增加多于1.5倍)。這表明較短的分子在較高的滴度產(chǎn)生，或其活性相對于全長支鏈淀粉酶分子增加。2)PUL_E99Q_E103Q變體可略優(yōu)于“野生型”PUL。BML780PUL_E99Q_E103Q菌株產(chǎn)生的暈稍微大于BML780PUL菌株產(chǎn)生的暈。3)BMPl39產(chǎn)生菌株顯示出與CAP75擴增的“野生型”PUL菌株相同的性質(zhì)。因此，基于平板評價，密碼子優(yōu)化未產(chǎn)生增加的性能。4)BML780菌株通常具有比BML612菌株更好的性質(zhì)。這種觀察與以往在BML612背景下支鏈淀粉酶的降解數(shù)據(jù)相符。事實是此處構(gòu)建的BML612支鏈淀粉酶菌株還顯示合理的AZCL-清除，表明在平板上，支鏈淀粉酶甚至在BML612背景下也是相對穩(wěn)定的。5)在Oril和Ori2支鏈淀粉酶菌株之間未觀察到明顯的性質(zhì)差異。本說明書提到的所有專利和公開都通過引用被并入于此。對本發(fā)明所記載的方法和系統(tǒng)的各種修改和改變對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將是顯而易見的，并不背離本發(fā)明的范圍和精神。雖然本發(fā)明已聯(lián)系具體優(yōu)選的實施方式進行描述，但是應(yīng)當(dāng)理解，所保護的本發(fā)明不應(yīng)不適當(dāng)?shù)叵抻谶@些具體的實施方式。實際上，對進行本發(fā)明的所描述模式的各種修改，其對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的，意圖在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。