一種抗鴨病毒性肝炎山豆根多糖及其分子修飾物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抗鴨病毒性肝炎山豆根多糖及其分子修飾物，屬于中獸藥制備【技術(shù)領(lǐng)域】。提取了山豆根多糖不同醇沉部分，經(jīng)反復(fù)臨床試驗篩選出抗鴨病毒性肝炎(DVH)活性部位，再用正交法確定氯磺酸-吡啶硫酸化修飾山豆根多糖活性部位的最佳條件為：反應(yīng)溫度95℃，反應(yīng)時間2h，氯磺酸-吡啶配比1∶5，經(jīng)紅外光譜分析所得產(chǎn)物為山豆根多糖硫酸酯，其總糖含量達83.77％，硫酸根含量達39.33％，產(chǎn)物得率達117.33％。山豆根多糖硫酸酯抗DHV-1感染鴨胚肝細胞作用和對DVH的療效顯著強于山豆根多糖。本發(fā)明所獲得的抗DVH山豆根多糖活性部位硫酸酯具有較高的糖和磷酸根含量，及較高產(chǎn)物得率，對DVH有良好療效。
【專利說明】—種抗鴨病毒性肝炎山豆根多糖及其分子修飾物
一、【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗鴨病毒性肝炎山豆根多糖及其分子修飾物，屬于中獸藥制備【技術(shù)領(lǐng)域】。
二、【背景技術(shù)】
[0002]鴨病毒性肝炎是鴨肝炎病毒(DHV)感染引起的一種傳播迅速、高發(fā)病率、高致死性疫病。1949年首次分離到該病毒，目前已呈全世界范圍分布。DHV主要存在DHV-1及其變異株、Duck Astrovirus以及DHV-3三個血清型，其中DHV-1型毒性最強、分布最廣，主要侵染3周齡以內(nèi)的雛鴨，病死率高于80 %，甚至可高達100 %，是嚴重危害養(yǎng)鴨業(yè)主要病原
之一
[0003]目前，世界范圍內(nèi)臨床上還沒有有效的抗DHV-1藥物，主要通過對種鴨或雛鴨注射弱毒苗進行免疫防御。臨床病例一旦出現(xiàn),即造成難以挽回的損失。1958年Gerber等首先發(fā)現(xiàn)海藻多糖具有抗病毒作用，此后多種多糖及硫酸化多糖的抗病毒作用陸續(xù)被報道。近年來，本實驗室也發(fā)現(xiàn)了黃芪、香菇、當歸等多種中藥多糖能顯著抵抗新城疫、傳染性法氏囊病等病毒的感染。中藥化合物結(jié)構(gòu)修飾是提高其水溶性和生物活性的主要手段之一。許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，中藥多糖成分、皂苷等成分硫酸化或磷酸化修飾后，使其成酯化物，其水溶性普遍增加，免疫藥理作用明顯增強。
[0004]山豆根是一種經(jīng)典的清熱解毒用中藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，山豆根多糖是其主要有效成分之一，具有良好的抗氧化作用。雖然有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過硫酸化修飾的硫酸化山豆根多糖在體外對肝炎病毒表現(xiàn)出良好的抑制作用。但由于不同的藥物對同一種病毒的作用并不一致，同一種藥物對不同的病毒也表現(xiàn)出不同的作用。我們發(fā)現(xiàn)，按照不同的條件修飾中藥多糖所獲得的多糖成分修飾物也有所不同，其作用大相徑庭。為研究有效的抗鴨病毒性肝炎藥物，我們根據(jù)前期的預(yù)試驗，將分離獲得并經(jīng)在體試驗驗證有效的山豆根多糖采用氯磺酸吡啶法進行了修飾，并采用正交試驗比較優(yōu)化了其制備工藝，以進一步提高其生物活性和生物利用率。
[0005]本發(fā)明首次將山豆根多糖抗鴨病毒性肝炎有效部位進行硫酸化分子修飾，并采用正交法優(yōu)化了抗鴨病毒性肝炎山豆根多糖活性部位硫酸化分子修飾條件，發(fā)現(xiàn)硫酸化分子修飾能顯著增加山豆根多糖抗鴨病毒性肝炎效果，提高其生物利用度，并獲得較高的產(chǎn)物得率。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]技術(shù)問題本發(fā)明針對世界范圍內(nèi)臨床上還沒有有效的抗鴨病毒性肝炎藥物問題，提供一種山豆根多糖抗鴨病毒性肝炎有效部位的硫酸化分子修飾方法，所獲得的山豆根多糖硫酸酯(SBSRPS65)總糖含量達83.77%，硫酸根含量為39.33%，產(chǎn)物得率達117.33%,且對鴨病毒性肝炎的治療作用明顯提高，可望最終應(yīng)用于鴨病毒性肝炎的臨床防治。
[0007]技術(shù)方案[0008]采用水煎醇沉法，收集不同醇沉部位山豆根多糖，經(jīng)數(shù)次臨床試驗發(fā)現(xiàn)山豆根多糖乙醇濃度65%醇沉部分(BSRPS65)對鴨病毒性肝炎有較理想的治療效果，再用正交試驗法對BSRPS65的硫酸化分子修飾方法進行優(yōu)化。經(jīng)優(yōu)化后的山豆根多糖抗鴨病毒性肝炎有效部位的硫酸化分子修飾方法為:將帶有攪拌裝置的三頸燒瓶置于冰中，加入無水吡啶20mL，劇烈攪拌，使之充分冷卻，按氯磺酸-吡啶的配比為1: 5的比例將氯磺酸逐滴緩慢加入，冷卻后于65~95°C水浴鍋上融化成淡黃色液體。精密稱取抗鴨病毒性肝炎山豆根多糖活性部位(BSRPS65) 300mg，加入酯化試劑，95°C反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后立即加入IOOmL冰水，用飽和氫氧化鈉溶液(20.0mol / L)調(diào)pH至7后放入透析袋中,用自來水流水透析2d、蒸餾水流水透析ld，將透析袋中的硫酸化多糖濃縮并冷凍干燥后得硫酸化山豆根多糖。經(jīng)Nicolet FT-1R200型傅立葉變換紅外光譜儀分析為山豆根多糖硫酸酯(SBSRPS65)。按此方法制備的山豆根多糖硫酸酯總糖含量達83.77%，硫酸根含量為39.33%，產(chǎn)物得率達117.33%，入水即溶。對體外培養(yǎng)的鴨胚肝細胞的毒性顯著降低。
[0009]有益效果
[0010]病毒性疾病已經(jīng)成為目前人類和動物健康的最大威脅之一，并造成了巨大的社會經(jīng)濟損失。近年來肆虐人類的禽流感、甲流、艾滋病、非典、流感、腸道病毒EV71型等等，肆虐動物的禽流感、新城疫、藍耳病、圓環(huán)病毒2型、偽狂犬病、細小病毒病、鴨病毒性肝炎等等，都使人類和動物生命健康遭受了嚴重的威脅。病毒性疾病肆虐人畜的一個重要原因是人類對于這些烈性病毒目前尚沒有臨床特效的藥物。曾今的抗流感病毒特效藥“達菲”現(xiàn)在對H5N1、H7N9卻不再那么有效。雖然三氮唑核苷、鹽酸金剛乙胺、無環(huán)鳥苷等抗病毒藥對病毒病也有一定的臨床療效，但是其引起的惡心、精神紊亂、腹瀉、肝腎功能損傷、眩暈等等不良反應(yīng)和藥物殘留，這些醫(yī)源性、藥源性疾病的不斷增加使得人們開始拒絕這些抗病毒西藥，轉(zhuǎn)而選擇毒副作用小的中草藥，目前已有40%以上的消費者選擇了中藥或中西結(jié)合治療。而在養(yǎng)殖業(yè)中，病毒性疾病仍然是目前養(yǎng)禽業(yè)危害最大的疫病之一，隨著金剛烷胺、利巴韋林等抗病毒西藥的全面被禁用，動物藥品市場上治療動物病毒病的西藥出現(xiàn)了空檔。由于世界范圍內(nèi)臨床上尚還沒有有效的抗DHV-1藥物，主要通過對種鴨或雛鴨注射弱毒苗進行免疫防御。臨床病例一旦出現(xiàn)3周齡以內(nèi)的感染雛鴨，其病死率往往高于80%，甚至可高達100%，造成的損失難以估量。
[0011]山豆根多糖是山豆根的主要藥效成分之一，具有良好的抗病毒、抗氧化等作用，對肝炎病毒體外感染肝細胞有良好的抑制作用。獸醫(yī)臨床試驗也發(fā)現(xiàn)，山豆根對鴨病毒性肝炎有一定的療效。為研制有效的抗鴨病毒性肝炎治療用藥，并提高其生物利用度，本發(fā)明采用氯磺酸-吡啶法硫酸化分子修飾山豆根多糖抗鴨病毒性肝炎有效部位，所形成的山豆根多糖硫酸酯不僅硫酸根和糖含量高，產(chǎn)物得率亦很高，臨床試驗發(fā)現(xiàn)其對鴨病毒性肝炎的療效明顯增強，且水溶性良好，制劑使用更為方便。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明優(yōu)點如下:
[0013]1.山豆根多糖硫酸化分子修飾的方法國內(nèi)雖有報道[張玉，蔣小豐，張名洋，等.山豆根 多糖硫酸化修飾及體外抗HBV活性測定[J].中國臨床藥學(xué)雜志，2011，20(3):151-154]，但該文并沒有對最佳修飾條件進行優(yōu)化，其反應(yīng)條件與本發(fā)明提供的條件大相徑庭，且其提供的山豆根多糖為75%乙醇醇沉部位，雖對乙肝病毒感染體外培養(yǎng)的2215細胞有一定的抑制作用，但經(jīng)臨床試驗驗證，對鴨病毒性肝炎的臨床療效并不理想。而本發(fā)明提供了優(yōu)化的山豆根多糖硫酸化分子修飾條件，且本發(fā)明所用山豆根多糖為抗鴨病毒性肝炎有效部位(BSRPS65),目前國內(nèi)外尚未見相似研究。
[0014]2.通過本發(fā)明實施所獲得的山豆根多糖硫酸酯糖含量達83.77%，硫酸根含量為39.33 %，產(chǎn)物得率達117.33 %，而且具有良好的水溶性，入水即溶，制劑使用方便。
[0015]3.通過本發(fā)明實施所獲得的山豆根多糖硫酸酯不僅對鴨肝炎病毒DHV-1感染體外培養(yǎng)的鴨胚肝細胞作用顯著優(yōu)于未修飾山豆根多糖(BSRPS65)，且對DHV-1攻毒感染鴨的治療作用也優(yōu)于未修飾的山豆根多糖(BSRPS65)。
四、【具體實施方式】
[0016]1.山豆根多糖的提取及有效部位篩選
[0017]稱取1000g山豆根，加10倍量水浸泡3h，加熱煮沸l(wèi)h，收集煎煮液，反復(fù)3次；合并收集的煎煮液，煮沸濃縮至1000mL,用高速離心機離心，取上清。緩慢向濃縮液中加入不同體積分數(shù)為95 %的乙醇，使溶液中乙醇含量分別為50 %、65 %、75 %、80 %，靜置過夜，分別離心收集沉淀。經(jīng)流水透析后，真空濃縮，3000rpm / min,離心20min,上清再次加入不同體積分數(shù)95%乙醇沉淀，重復(fù)透析、濃縮、離心后，60°C真空干燥，碾碎，分別得到山豆根多糖不同醇沉部位 BSRPS5Q、BSRPS65, BSRPS75, BSRPS80 和總多糖 BSRPSt。
[0018]3日齡非免櫻桃谷鴨隨機均分7組，每組31羽，分別為空白對照組、攻毒對照組和5個不同醇沉部位山豆根多糖組。除空白對照組外，其余6組鴨分別肌肉注射鴨肝炎病毒DHV-10.2mL /羽后，Ih后各多糖組分別于飲水中添加多糖飲喂,5mg /羽.天,連續(xù)3天,每天觀察記錄各組鴨死亡情況 ，死亡鴨及時逐只剖檢觀察病變，剔除無病變雛鴨，待全群鴨停止死亡時，統(tǒng)計各組存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山豆根多糖不同醇沉部位BSRPS5tl、BSRPS65、BSRPS75、BSRPS80和總多糖BSRPSt及攻毒對照組各組存活率依次為16.13 %、35.48 %、22.58 %、16.13%、19.35%和0%。其中65%醇沉部位BSRPS65的存活率顯著高于攻毒對照組，并遠高于其他醇沉部位。
[0019]2.山豆根多糖硫酸化分子修飾及條件優(yōu)化
[0020]采用氯磺酸-吡啶法硫酸化分子修飾山豆根多糖(BSRPS65)。根據(jù)單因素預(yù)試驗結(jié)果，反應(yīng)溫度、試劑比例，反應(yīng)時間對多糖硫酸化修飾的影響較大，采用正交試驗設(shè)計方法，選取反應(yīng)溫度(A)、氯磺酸與吡啶的配比(B)和反應(yīng)時間(C)為因素，確定三個水平，按照正交表L9 (34)(表1)設(shè)計正交試驗。
[0021]將帶有攪拌裝置的三頸燒瓶置于冰中，加入無水吡啶20mL，劇烈攪拌，使之充分冷卻，按表1氯磺酸-吡啶的配比將氯磺酸逐滴緩慢加入，冷卻后于65~95°C水浴鍋上融化成淡黃色液體。稱取抗鴨病毒性肝炎山豆根多糖活性部位(BSRPS65) 300mg，加入酯化試劑，按表1設(shè)計的反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間分別在恒溫水浴振蕩器上反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后立即加入IOOmL冰水,用飽和氫氧化鈉溶液(20.0mol / L)調(diào)pH至7后放入透析袋中,用自來水流水透析2d、蒸餾水流水透析ld，將透析袋中的硫酸化多糖濃縮并冷凍干燥后得硫酸化山豆根多糖。
[0022]表1因素和水平
[0023]
【權(quán)利要求】
1.一種抗鴨病毒性肝炎山豆根多糖硫酸化分子修飾方法，采用氯磺酸-吡啶法硫酸化分子修飾山S?根多糖。 (1)采用水煎醇沉法，收集不同醇沉部位山豆根多糖，以其添加于飲水中治療鴨肝炎病毒DHV-1攻毒鴨，數(shù)次臨床試驗發(fā)現(xiàn)山豆根多糖酒精濃度65%醇沉部分(BSRPS65)對鴨病毒性肝炎有較理想的治療效果。 (2)將帶有攪拌裝置的三頸燒瓶置于冰中，加入無水吡啶20mL，劇烈攪拌，使之充分冷卻，按氯磺酸-吡啶的配比將氯磺酸逐滴緩慢加入，冷卻后于65~95°C水浴鍋上融化成淡黃色液體。稱取抗鴨病毒性肝炎山豆根多糖活性部位(BSRPS65) 300mg，加入酯化試劑，在一定溫度下反應(yīng)適當時間。反應(yīng)結(jié)束后立即加入IOOmL冰水,用飽和氫氧化鈉溶液(20.0mol.L—1)調(diào)pH至7后放入透析袋中，用自來水流水透析2d、蒸餾水流水透析ld，將透析袋中的硫酸化多糖濃縮并冷凍干燥后得硫酸化山豆根多糖。 (3)上述方法硫酸化分子修飾山豆根多糖的條件為:反應(yīng)溫度65°C~95°C、反應(yīng)時間I~3h、氯磺酸-吡啶的配比為1: 5~9。 (4)按照上述方法硫酸化分子修飾山豆根多糖的最佳條件為:反應(yīng)溫度95°C、反應(yīng)時間2h、氯磺酸-吡啶的配比為1: 5。 (5)在最佳條件下硫酸化分子修飾山豆根多糖，其產(chǎn)物中山豆根多糖硫酸酯總糖含量為83.77%，硫酸根含量為39.33%，產(chǎn)物得率為117.33%。 (6)在最佳條件下硫酸化分子修飾山豆根多糖，其產(chǎn)物的紅外光譜圖基本形狀與修飾前一致，未發(fā)生根本性改變，均具有多糖特征吸收峰，除多糖母體特征峰得到保留之外，在1248CHT1處出現(xiàn)的吸收峰是由不對稱S=O伸縮振動引起的，在8 McnT1處左右出現(xiàn)了 C-O-SO3相關(guān)的對稱性C-O-S吸收峰，表明本法中硫酸化分子修飾山豆根多糖產(chǎn)物為山豆根多糖硫酸酯。 (7)在最佳條件下制備的山豆根多糖硫酸酯對鴨肝炎病毒DHV-1感染體外培養(yǎng)的鴨胚肝細胞具有良好的抑制作用，且優(yōu)于未修飾的山豆根多糖。 (8)在最佳條件下制備的山豆根多糖硫酸酯對鴨肝炎病毒DHV-1攻毒感染引起的鴨病毒性肝炎具有良好的治療作用，其作用優(yōu)于未修飾的山豆根多糖。 (9)在山豆根多糖(BSRPS65)及其硫酸酯治療鴨病毒性肝炎的治療劑量分別為4mg/羽和2mg /羽，添加于飲水中，連用3天。
2.權(quán)利要求1所述方法獲得的山豆根多糖硫酸酯能夠明顯提高山豆根多糖抗鴨病毒性肝炎活性部位(BSRPS65)的抗病效果，并具有較高的糖和磷酸根含量高以及產(chǎn)物得率。
【文檔編號】C08B37/00GK103739733SQ201410009323
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月9日
【發(fā)明者】劉家國, 陳云, 熊文, 曾玲, 徐美云, 王德云, 胡元亮, 武毅, 黃兵, 馬秀麗 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)