交聯(lián)的-e-賴氨酸顆粒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種交聯(lián)的聚-ε-賴氨酸聚合物。聚-ε-賴氨酸和交聯(lián)劑通過酰胺鍵連接并且交聯(lián)劑可具有能夠與聚-ε-賴氨酸的α碳胺反應(yīng)的至少兩個官能團。聚合物合適地在水和其他溶劑中是可溶的，并且是以顆粒的形式。本發(fā)明提供了顆粒狀支持物，其包括交聯(lián)的聚-ε-賴氨酸聚合物，并且聚合物提供了顆粒本身或包被在顆粒上，所述顆粒例如是二氧化硅。所述聚合物可用于廣泛的應(yīng)用，包括傷口處理，用作醫(yī)學(xué)診斷劑包括顆粒狀支持物和被支持物結(jié)合或保留的功能性材料，以及肽、寡核苷酸、寡糖的合成，物質(zhì)的固定化、細胞培養(yǎng)和色譜分離。
【專利說明】交聯(lián)的-E-賴氨酸顆粒
[0001]本發(fā)明涉及一種聚合物支持物(polymeric support),制備所述支持物的方法和所述支持物在固相過程中的用途。尤其是，本發(fā)明涉及一種含有交聯(lián)的聚-e -賴氨酸的聚合物支持物。所述支持物在廣泛的物理和化學(xué)過程中有用，特別是當(dāng)與底物的相互作用是例如固相合成、固相萃取、固相試劑、物質(zhì)的固定化、細胞培養(yǎng)、催化、色譜分析以及醫(yī)學(xué)診斷所需要的。
[0002]聚-ε-賴氨酸是一種由通過羧基和第五位(eε )氨基之間的酰胺鍵連接的氨基酸賴氨酸組成的自然發(fā)生的短鏈多分散的聚酰胺。這種結(jié)構(gòu)其不尋常在于所述酰胺鍵由羧基和賴氨酸的第五位(ε)氨基之間形成,而在肽的氨基酸之間并且傳統(tǒng)采用聚賴氨酸的正常肽鍵是在羧基和a氨基之間形成。在自然發(fā)生的聚-ε -賴氨酸的多分散性通常是在25-35個氨基酸之間。在傳統(tǒng)的市售聚賴氨酸中，肽具有更寬的可控性不佳的多分散性，其通常含有5-500個氨基酸的任意。
[0003]交聯(lián)的聚-ε -賴氨酸在結(jié)構(gòu)上具有比傳統(tǒng)的聚賴氨酸更有彈性的性質(zhì)，是由于酰胺鍵之間更大的鏈長。結(jié)構(gòu)上聚-eε-賴氨酸實際上是一種a-氨基的尼龍5。
[0004]目前，聚-賴氨酸是通過大規(guī)模的細菌發(fā)酵來制備用作食品防腐劑。其價格低廉并以商業(yè)數(shù)量隨時可得。在本發(fā)明中，我們描述了聚-ε-賴氨酸的交聯(lián)以形成不溶性聚合物支持物，其可應(yīng)用于廣泛的技術(shù)中。這些包括但不限于固相肽合成、固相寡核苷酸合成、固相萃取、固相試劑、物質(zhì)的固定化、細胞培養(yǎng)、催化、色譜分析、農(nóng)藥的緩釋、和藥品的緩釋、傷口護理、再生醫(yī)學(xué)和醫(yī)學(xué)診斷。
[0005]在固相合成過程中有用的固體支持材料是已知的。廣泛的物理和化學(xué)過程采用固體支持材料，包括例如有機分子尤其是肽和寡核苷酸的合成、物質(zhì)的固定化、催化劑的支持物、離子交換、從材料中提取物質(zhì)、診斷和色譜分析。
[0006]通常情況下，有機分子的多級合成涉及眾多的分離步驟以在進展到隨后階段之前分離在每個階段產(chǎn)生的中間體。這些進程往往費時、昂貴并可能對于產(chǎn)率來說是低效的。中間體通常需要純化以除去過量的試劑和反應(yīng)副產(chǎn)物，并且可采用例如沉淀、過濾、雙相溶劑萃取、固相萃取、結(jié)晶和色譜分析的步驟。
[0007]固相合成提供了超越液相合成的一些優(yōu)勢。例如，通過可逆地將目標分子附著于固體支持物可以在一定程度上避免液相合成中使用的分離步驟。通過過濾和洗滌固體支持物去除過量的試劑和一些副產(chǎn)物。目標分子可以在一些過程中以基本上定量的產(chǎn)率回收，這在液相合成中通常是特別困難的。此外，固體支持物上進行操作所需的時間通常遠小于在液相合成中進行相應(yīng)階段所需的時間。
[0008]在一系列過程中的物質(zhì)固定化也是已知的。例如，在傳統(tǒng)的有機化學(xué)包括化學(xué)催化和生物催化中使用的催化劑的固定化通常使用聚合物支持物。也可以采用固定化的酶進行有機化學(xué)反應(yīng)或手性拆分，例如固定化的青霉素酰胺酶用于仲醇的拆分(E.Baldaro等人Tet.Asym.4，1031，(1993))，以及固定化的青霉素G酰胺酶也可用于在制備阿莫西林中節(jié)青霉素的水解(Carleysmith, S.W.和 Lilly, M.D.Biotechnol.Bioeng., 21,1057-73,1979)。[0009]固體支持物也可用于在醫(yī)療和診斷應(yīng)用中固定化生物大分子。這包括蛋白質(zhì)、單克隆和多克隆抗體的固定化。細胞培養(yǎng)通常在固體支持物上進行，具有特定的表面特性和形態(tài)。在支持物上的固定化的酶也可用作傳感器來產(chǎn)生信號。一個實例是通過葡萄糖氧化酶/過氧化物酶偶聯(lián)酶系統(tǒng)檢測葡萄糖，其中葡萄糖的存在產(chǎn)生過氧化氫，而這又是過氧化物酶的底物，所述過氧化物酶用于氧化廣泛多樣的底物來提供的顏色、熒光或冷光信號。
[0010]其熒光對特定的陽離子或陰離子敏感的各種熒光劑可用于指示特定離子的濃度，包括用于PH測量的氫離子。
[0011]聚合顆粒通常用于色譜分析，其中固體支持物被稱為穩(wěn)定相。在特定模式的色譜分析中，穩(wěn)定相的成本可能是限制性的。在其他模式中，穩(wěn)定相的物理性質(zhì)可能降低技術(shù)的效率。例如，親和、離子交換和凝膠滲透色譜分析中常用的軟聚合物因為顆粒的可變形性質(zhì)不能在高流速下使用。用于許多其他模式的色譜分析的剛性大孔聚合物往往是機械易碎的并由此遭受短的使用期的困擾。[0012]在色譜分離中固體支持物或固定相的應(yīng)用是非常廣泛的，例如用于制藥和生物技術(shù)行業(yè)的復(fù)雜的高科技分離和用于采礦業(yè)的較大規(guī)模的過程。制藥行業(yè)的一些最有價值的藥物是通過制備色譜進行純化，并且改良的色譜分離會是技術(shù)上有益的并在經(jīng)濟上有利的。在采礦和貴重金屬回收行業(yè)中，世界上大部分的鈀可使用固定化的冠醚進行精煉(refine)，鈀是廣泛的工業(yè)應(yīng)用和過程中的關(guān)鍵組分，包括催化轉(zhuǎn)換器和高價值產(chǎn)品的制造(Traczyk, F.P.;Bruening, R.L.; Izatt, N.E.〃The Application of MolecularRecognition Technology(MRT)for Removal and Recovery of Metal 1ns from AqueousSolutions"; In Fortschritte in der Hydrometallurgie; 1998, Vortrage beim34.Metallurgischen Seminar des Fachausschusses fuer Metallurgische Aus—undWeiterbildung der GDMB;18-20Novemberl998;Goslar)0
[0013]聚合顆粒在固相萃取和固相試劑制備中的用途在化學(xué)、制藥和生物技術(shù)行業(yè)也是已知的。
[0014]已知的固相支持物一般包括滿足所述應(yīng)用的具有特定大小和物理性質(zhì)的聚合物顆粒。為了方便使用，這些聚合物顆粒通常是球形，并具有確定的粒度分布。顆粒的的球形性質(zhì)促進聚合物的流動和過濾的特性。盡管使用固體支持物具有操作性的優(yōu)勢，固相法也有缺點。
[0015]在肽合成中，聚苯乙烯被廣泛用作聚合物支持物來支持增長中的肽，并且其相對廉價、非常便于獲得，而且在肽合成中提供可接受的性能。肽和寡核苷酸的固相合成中常用的其它市售的支持物可能是昂貴的，例如由于復(fù)雜的制造流程。一般使用微孔聚合物和大孔聚合物。微孔聚合物具有相對低水平的交聯(lián)劑，其允許聚合物顆粒在合適的溶劑中溶劑化并因而膨脹。大孔聚合物通常在聚合物基質(zhì)中具有高水平的交聯(lián)劑并包含大孔。這些聚合物顆粒通常是剛性的并具有良好的流動特性，而且適于在填充柱中使用。
[0016]仍然需要找到一種可選的或改進的并符合成本效益的聚合物適合在廣泛的應(yīng)用中用作支持物。我們現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一種交聯(lián)的聚-e -賴氨酸聚合物提供了極好的特性組合，可根據(jù)所需的屬性通過適當(dāng)?shù)剡x擇交聯(lián)劑來量身定做，并可以符合成本效益地用在廣泛的應(yīng)用。
[0017]在第一方面中，本發(fā)明提供一種交聯(lián)的聚-e -賴氨酸聚合物。[0018]交聯(lián)的聚-e-賴氨酸聚合物對于為廣泛應(yīng)用提供支持物是特別有用的，尤其是其中交聯(lián)提供一種不溶于水和其它溶劑的聚合物。當(dāng)采用較低水平的交聯(lián)，聚合物可溶于水而且這提供了如下所述在某些應(yīng)用中的優(yōu)勢。適宜地，聚合物包括聚-e -賴氨酸和通過酰胺鍵連接的交聯(lián)劑。
[0019] 所述聚合物可以是任何合適的形式，包括非顆粒的宏觀形式例如片、物品、纖維，或以顆粒形式。
[0020]交聯(lián)的聚-e -賴氨酸中的聚-e _賴氨酸組分是交聯(lián)的聚合物的主成分。交聯(lián)劑作用于將聚-e -賴氨酸聚合物連接在一起從而聚-e -賴氨酸聚合物提供一種結(jié)構(gòu)，例如用于一系列應(yīng)用中的格架，所述應(yīng)用包括支持例如多肽和多核苷酸的有機分子合成，色譜分析，用作如下文所述的功能性材料的支持物。
[0021]聚-e -賴氨酸聚合物通過反應(yīng)的交聯(lián)劑適當(dāng)?shù)亟宦?lián)，所述交聯(lián)劑具有至少兩個官能團，優(yōu)選地兩個或更多個羧酸基團，能與聚-e-賴氨酸聚合物中的游離a氨基反應(yīng)。交聯(lián)劑可以具有三個或更多個官能團連接到相同數(shù)量的聚-e -賴氨酸聚合物鏈，或更少的鏈但具有多個連接到一個或多個所述鏈。交聯(lián)劑可以含有其它官能團，其不參與交聯(lián)反應(yīng)，并在使用交聯(lián)的聚合物時保持可用于和其他物質(zhì)的反應(yīng)。
[0022]聚合物支持物中的交聯(lián)水平可用來控制最終的交聯(lián)的聚-e -賴氨酸的物理形態(tài)和化學(xué)反應(yīng)性。引進高水平的交聯(lián)會產(chǎn)生適合用于制備大孔聚合物支持物的剛性結(jié)構(gòu)，而低水平的交聯(lián)會產(chǎn)生更軟更多微孔材料。氨基功能性高與低水平的交聯(lián)相伴隨，其可以容易地通過控制加帽來量身定制。處理、溶劑化和物理性質(zhì)也可以通過引入不同的交聯(lián)劑被定義。
[0023]適宜地，交聯(lián)劑包括特定的化合物或化合物組。交聯(lián)劑可以包括重復(fù)單元并是多分散的，然而多分散性是窄的以確保適當(dāng)?shù)目刂平宦?lián)時形成的格架結(jié)構(gòu)。所述交聯(lián)劑包括至少兩個能與聚-e-賴氨酸的a碳氨基反應(yīng)的官能團。適合于此目的的常見的官能團的實例包括羧酸。
[0024]酰胺鍵是可生物降解的，并且本發(fā)明所述交聯(lián)的聚合物以及包含其的支持物在生物可降解性尤為重要的一些應(yīng)用中是特別有用的。另外，酰胺鍵可被代謝例如通過酶包括蛋白酶，也可被生物降解并在醫(yī)療應(yīng)用中的使用特別有優(yōu)勢，而且特別是在人體或動物體中的醫(yī)療應(yīng)用。本發(fā)明所述聚合物和支持物在醫(yī)療應(yīng)用中提供益處，其中聚合物或支持物隨著時間的推移適當(dāng)?shù)亟到?，因而不需要在其功能完成之后去除支持物的流程?br> [0025]在一個特別優(yōu)選的實施方案中，交聯(lián)劑和聚-e -賴氨酸之間的鍵包括酰胺鍵，優(yōu)選地至少1%的e氨基被交聯(lián)，更優(yōu)選至少50%，所需地至少90%，特別是幾乎所有的鍵是酰胺鍵。
[0026]在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述聚合物是輕微交聯(lián)的，并且從1%上至50 %、1-20%以及1-10%的e氨基被交聯(lián)。本發(fā)明的輕度交聯(lián)的聚合物和支持物在有機物質(zhì)(例如肽和核苷酸序列)合成以及在遞送活性物質(zhì)(例如藥物活性劑)中特別有用。
[0027]因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，交聯(lián)劑包括兩個或更多個羧酸基團和連接兩個或更多個的基團的脂肪鏈。交聯(lián)劑可以包括多元酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，交聯(lián)劑包括分子式為X[C02H]n的化合物，其中n為2或更大，優(yōu)選2-6，更優(yōu)選為2_4，并且X是疏水性或親水性的連接基團，優(yōu)選脂肪族的。適當(dāng)?shù)?，基團X具有的分子量為14-250，更優(yōu)選為28-140，不包括連接基團上的任何功能取代基。
[0028]X可以包含雜原子例如氧和氮作為連接基團的骨架的部分，并且可以包含官能團用于在使用交聯(lián)的聚-e -賴氨酸期間與其他物質(zhì)反應(yīng)。
[0029]連接酸性基團的脂族鏈可以是親水的，優(yōu)選雙-羧基-聚亞烷基二醇，例如雙-羧基-聚乙二醇，或脂族鏈可以是疏水的提供疏水性交聯(lián)劑，例如癸二酸提供更親脂性的支持物。交聯(lián)劑可以衍生自前體材料，例如酸酐。其它合適的交聯(lián)劑的例子包括次氮基三乙酸、戊二酸和 hoocch2ch2conhch2ch2och2ch2och2ch2och2ch2nhcoch2ch2cooh。適宜地，交聯(lián)劑的選擇是根據(jù)它的溶劑化特性，從而在與聚-e -賴氨酸聚合物反應(yīng)時，聚合物和交聯(lián)劑都包含在分散相中，所述分散相含有用于交聯(lián)劑和聚-S-賴氨酸分布在不混溶的連續(xù)相中的溶劑。
[0030]在一個優(yōu)選的實施方案中，X包括烴基并且僅包括氫和碳原子，優(yōu)選為2-14個，更優(yōu)選3-12個，而且特別是5-8個碳原子。所述烴基可以是直鏈或支鏈的，優(yōu)選為直鏈。所述烴基可以是飽和的或不飽和的，優(yōu)選為飽和的。優(yōu)選的交聯(lián)劑的實例包括具有8-12個碳
原子的二羧酸，如癸二酸、十二烷酸和壬二酸。
[0031]聚-e -賴氨酸可在交聯(lián)之前衍生化或被修飾以允許本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的其他交聯(lián)化學(xué)。聚-e-賴氨酸可以使用氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)被交聯(lián)。交聯(lián)的聚-e -賴氨酸在這種情況下僅在降解時只生成天然存在的氨基酸。例如與胱氨酸反應(yīng)，將產(chǎn)生以類似的方式交聯(lián)的聚合物，但在這種情況下結(jié)構(gòu)中將包含半胱氨酸二硫鍵，其在降解時也會產(chǎn)生天然存在的氨基酸。
[0032]優(yōu)選的交聯(lián)劑的例子包括谷氨酸、胱氨酸、EDTA (乙二胺四乙酸)、己二酸、十二烷二酸、合成肽(特別是基于天然膠原蛋白結(jié)構(gòu)的肽)、含有三肽序列-Arg-Gly-Asp-的合成肽、纖維蛋白原和其他天然蛋白質(zhì)中的細胞結(jié)合肽、含有多個羧酸基團的天然存在的聚合物包括明膠、特別適合用于金屬螯合和色譜分析的具有多個羧酸基團的藻酸和冠醚。其它合適的例子如下:
[0033]
【權(quán)利要求】
1.交聯(lián)的聚-e-賴氨酸聚合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的聚合物，其包含通過酰胺鍵連接的聚-e-賴氨酸和交聯(lián)劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的聚合物，其中所述聚合物是與交聯(lián)劑交聯(lián)的，所述交聯(lián)劑包含能夠與聚-e-賴氨酸的a碳胺反應(yīng)的至少兩個官能團。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的聚合物，其中所述交聯(lián)劑包含兩個或更多個羧酸基團和連接兩個或更多個的基團的脂肪鏈。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的聚合物，其在水和其他溶劑中是可溶的。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的聚合物，其是以顆粒的形式。
7.一種顆粒狀支持物，其包括根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的交聯(lián)的聚-e -賴氨酸聚合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的顆粒狀支持物，其中所述交聯(lián)的聚-e-賴氨酸支持物是球形、橢球形或不規(guī)則顆粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或權(quán)利要求8的顆粒狀支持物，其中所述交聯(lián)的聚-e-賴氨酸支持物用于直接或間接包被顆粒。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一項的顆粒狀支持物，其中所述交聯(lián)的聚-e-賴氨酸支持物用于包被顆粒和與顆粒共價結(jié)合。
11.根據(jù)權(quán)利要求7-10中任一項的顆粒狀支持物，其中所述交聯(lián)的聚-e-賴氨酸用于包被有機聚合物顆粒。
12.根據(jù)權(quán)利要求7-10中任一項的顆粒狀支持物，其中所述交聯(lián)的聚-e-賴氨酸用于包被無機聚合物顆粒。`
13.根據(jù)權(quán)利要求7-12中任一項的顆粒狀基于交聯(lián)的聚-e-賴氨酸的支持物，其中所述交聯(lián)的聚-e -賴氨酸是功能化的以提供包含下述的材料:催化劑、用于肽合成的引發(fā)劑物質(zhì)、用于寡核苷酸合成的引發(fā)劑物質(zhì)、用于固相有機合成的引發(fā)劑物質(zhì)、藥物活性物質(zhì)、農(nóng)藥活性物質(zhì)、用于色譜分離的表面、促進細胞培養(yǎng)或分化的物質(zhì)、蛋白質(zhì)或其他生物大分子。
14.傷口處理產(chǎn)品，其包括根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的聚合物或根據(jù)權(quán)利要求7-13中任一項的顆粒狀支持物和用于治療傷口的組分和/或治療劑。
15.醫(yī)學(xué)診斷劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求7-13中任一項的顆粒狀支持物并包含被所述支持物結(jié)合或保留的功能性材料。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的醫(yī)學(xué)診斷劑，其中所述功能性材料包含被所述支持物支持的酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求7-13中任一項的顆粒狀支持物在選自下述的方法中的用途:肽、寡核苷酸、寡糖的固相合成；固相萃取；固相有機合成；選自固相試劑、金屬和其他催化劑、生物催化劑、酶、蛋白質(zhì)、包括多克隆和單克隆抗體的抗體、完整細胞和聚合物的物質(zhì)的固定化；細胞培養(yǎng)；用于色譜分析的穩(wěn)定相的制備；或用作吸收劑或用作受控釋放產(chǎn)品的可生物降解載體。
【文檔編號】C08J3/24GK103597011SQ201280028453
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月20日
【發(fā)明者】D·威靈斯 申請人:斯菲瑞技術(shù)有限公司