專利名稱：一種瓊脂糖4b微球的交聯(lián)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種瓊脂糖4B微球的交聯(lián)方法
背景技術(shù)：
層析是一種被廣泛使用的分離和純化大分子物質(zhì)的技術(shù)，而層析介質(zhì)在層析系統(tǒng)中處于最為關(guān)鍵的位置。以天然多糖瓊脂糖為母體的層析分離介質(zhì)是經(jīng)典的生物的分子分離材料，由于具有多孔性、親水性、電中性、易衍生性等其它生物材料不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，使得其廣泛應(yīng)用于各種生物活性大分子的分離和純化。但未交聯(lián)的瓊脂糖凝膠骨架結(jié)構(gòu)是由氫鍵固定，為軟基質(zhì)，應(yīng)用時(shí)易壓縮，柱床反壓較高，不能滿足高流速層析的要求。近年來，通過對(duì)瓊脂糖微球的化學(xué)改性，一定程度上提高了凝膠的機(jī)械穩(wěn)定性和通透性。有關(guān)瓊脂糖微球的交聯(lián)方法很多，目前所用交的聯(lián)劑一般都是2，3-二溴丙醇、環(huán)氧氯丙烷、1，4_ 丁二醇二縮水甘油醚以及雙官能團(tuán)化合物，且大都足一步交聯(lián)。然而2，3-二溴內(nèi)醇毒性較強(qiáng)，不宜大量使用；環(huán)氧氯丙烷和1，4_ 丁二醇二縮水甘油醚的壓力和流速關(guān)系的再現(xiàn)性很低，滿足不了凝膠基質(zhì)的剛性。因此很有必要對(duì)瓊脂糖微球的交聯(lián)試劑進(jìn)行改變，尋找既含雙官能團(tuán)又分子鏈長的交聯(lián)劑，以提高瓊脂糖微球的機(jī)械性能。不但使其適合于實(shí)驗(yàn)室工作，也滿足于工業(yè)需求的規(guī)模生產(chǎn)。由于瓊脂糖4B微球(瓊脂糖含量為4%)含水量高，孔徑大，可用于蛋白質(zhì)等大分子的純化分離，但機(jī)械強(qiáng)度比較差，使其應(yīng)用受到巨大限制。雖不少文獻(xiàn)報(bào)道了瓊脂糖4B微球的交聯(lián)方法，但仍不能滿足工業(yè)壓力和流速的需求。本發(fā)明采用二次交聯(lián)法，其一次交聯(lián)選用新的交聯(lián)劑季戊四醇縮水甘油醚，二次交聯(lián)采用環(huán)氧氯內(nèi)烷交聯(lián)，獲得了剛性更強(qiáng)、結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定的瓊脂糖微球，能夠耐受高溫、高壓、高流速等劇烈條件，明顯提高了瓊脂糖4B微球的應(yīng)用范圍。季戊四醇縮水甘油醚是一種含有等價(jià)雙官能團(tuán)、分子鏈相對(duì)很長的交聯(lián)劑，其用于瓊脂糖凝膠的第一步交聯(lián)，通過引入大分子鏈，將瓊脂糖鏈上的非共價(jià)作用變?yōu)楣矁r(jià)作用，增強(qiáng)結(jié)合力，穩(wěn)定凝膠的網(wǎng)絡(luò)相，再通過第二步環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)，進(jìn)一步在基體中引入化學(xué)鍵力，使瓊脂糖的剛性和穩(wěn)定性都得到相當(dāng)大的提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種瓊脂糖4B微球的交聯(lián)方法所述的瓊脂糖4B微球的交聯(lián)方法的步驟是(I)瓊脂糖4B微球的一次交聯(lián)將瓊脂糖4B微球和氫氧化鈉混勻靜止lOmin，依次二甲亞砜、無水乙醇、季戊四醇縮水甘油醚于30°C水浴搖床中攪拌，依次用20%的乙醇、丙酮、去離子水洗滌。(2)瓊脂糖4B微球的二次交聯(lián)將一次交聯(lián)的瓊脂糖4B微球和氫氧化鈉混勻靜止，后依次加入二甲亞砜、環(huán)氧氯丙烷，放到水浴搖床里，分別30°C、35°C、40°C各反應(yīng)2h，依次用20%的乙醇、丙酮、去離子水洗漆。二次交聯(lián)后的瓊脂糖4B微球裝柱(柱內(nèi)徑lcm，裝柱高度3cm)，連接到AktaPurifier層析系統(tǒng)，隨流速增加，柱壓逐漸增大，當(dāng)流速為400cm/h時(shí),瓊脂糖微球達(dá)到耐受極限柱壓0.1MPa，變化趨勢(shì)緩慢且呈良好的線性關(guān)系，說明合成的瓊脂糖微球可在高流速下操作。二次交聯(lián)后的瓊脂糖4B微球經(jīng)121°C、20min高溫滅菌后，粒徑和球形度都沒有變化，損失率小于2. 0%，這說明二次交聯(lián)后的瓊脂糖4B微球耐高溫高壓。本發(fā)明在制備工藝上采用兩步交聯(lián)法，所開發(fā)的交聯(lián)瓊脂糖4B微球可進(jìn)一步化學(xué)衍生，制得具有多種功能基團(tuán)的色譜介質(zhì)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于一次交聯(lián)后的瓊脂糖4B微球即可承受一定的高溫、高壓，二次交聯(lián)后的微球交聯(lián)程度更高，適應(yīng)于高壓力、高流速的分析型色譜的操作要求；制備工藝簡(jiǎn)單，易于控制和放大；成本低廉，環(huán)境污染小。


圖1是本發(fā)明的瓊脂糖4B微球的整體外觀顯微鏡照片。圖2是本發(fā)明的二次交聯(lián)后的瓊脂糖4B微球整體外觀顯微鏡照片。圖3是本發(fā)明的二次交聯(lián)后的瓊脂糖4B微球經(jīng)高溫滅菌后的整體外觀顯微鏡照片。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述實(shí)施例1取40g瓊脂糖4B微球于500mL的具塞三角燒瓶中，加入60mL、l. OmoI/L的NaOH溶液，30°C靜止lOmin，再依次加入32mL 二甲亞砜、6mL無水乙醇和IOmL季戊四醇縮水甘油醚，300C，170rpm的水浴搖床中反應(yīng)6h，依次用20%的乙醇、丙酮、去離子水洗滌。取一次交聯(lián)的微球40g于500mL的具塞三角燒瓶中，加入60mL、3. OmoI/L的NaOH溶液，30°C靜止IOmin,再依次加入32mL 二甲亞砜和IOmL環(huán)氧氯丙燒,放到170rpm的水浴搖床中，分別30 V、35°C、40°C各2h，用20 %的乙醇、丙酮、去離子水洗滌。經(jīng)高溫滅菌后，損失率約1. 5%。二次交聯(lián)后的瓊脂糖4B微球裝柱(柱內(nèi)徑1cm，裝柱高度3cm)，連接到AKTAPurifier層析系統(tǒng)，隨流速增加，柱壓逐漸增大，當(dāng)流速為380cm/h時(shí)，達(dá)到耐受極限柱壓0.1MPa0實(shí)施例2取40g瓊脂糖4B微球于500mL的具塞三角燒瓶中，加入60mL、l. OmoI/L的NaOH溶液，30°C靜止lOmin，再依次加入34mL 二甲亞砜、6mL無水乙醇和8mL季戊四醇縮水甘油醚，30°C，170rpm的水浴搖床中反應(yīng)6h，依次用20%的乙醇、丙酮、去離子水洗滌。取一次交聯(lián)的微球40g于500mL的具塞三角燒瓶中，加入60mL、3. OmoI/L的NaOH溶液，30°C靜止IOmin,再依次加入34mL 二甲亞砜和8mL環(huán)氧氯丙燒,放到170rpm的水浴搖床中，分別30 V、35°C、40°C各2h，用20 %的乙醇、丙酮、去離子水洗滌。經(jīng)高溫滅菌后，損失率約1.6%。二次交聯(lián)后的瓊脂糖4B微球裝柱(柱內(nèi)徑1cm，裝柱高度3cm)，連接到AKTAPurifier層析系統(tǒng)，隨流速增加，柱壓逐漸增大，當(dāng)流速為390cm/h時(shí)，達(dá)到耐受極限柱壓0.1MPa0實(shí)施例3取40g瓊脂糖4B微球于500mL的具塞三角燒瓶中，加入50mL、l. OmoI/L的NaOH溶液，30°C靜止lOmin，再依次加入32mL 二甲亞砜、6mL無水乙醇和15mL季戊四醇縮水甘油醚，30°C, 170rpm的水浴搖床中反應(yīng)5h,依次用20%的乙醇、丙酮、去離子水洗漆。取一次交聯(lián)的微球40g于500mL的具塞三角燒瓶中，加入50mL、3. OmoI/L的NaOH溶液，30°C靜止IOmin,再依次加入32mL 二甲亞砜和15mL環(huán)氧氯丙燒,放到170rpm的水浴搖床中，分別30 V、35°C、40°C各2h，用20 %的乙醇、丙酮、去離子水洗滌。經(jīng)高溫滅菌后，損失率約1. 8%。二次交聯(lián)后的瓊脂糖4B微球裝柱(柱內(nèi)徑lcm，裝柱高度3cm)，連接到AKTAPurifier層析系統(tǒng)，隨流速增加，柱壓逐漸增大，當(dāng)流速為390cm/h時(shí)，達(dá)到耐受極限柱壓0.1MPa0實(shí)施例4取40g瓊脂糖4B微球于500mL的具塞三角燒瓶中，加入45mL、l. OmoI/L的NaOH溶液，30°C靜止lOmin，再依次加入36mL 二甲亞砜、6mL無水乙醇和IOmL季戊四醇縮水甘油醚，300C，170rpm的水浴搖床中反應(yīng)6h，依次用20%的乙醇、丙酮、去離子水洗滌。取一次交聯(lián)的微球40g于500mL的具塞三角燒瓶中，加入45mL、3. OmoI/L的NaOH溶液，30°C靜止IOmin,再依次加入36mL 二甲亞砜和IOmL環(huán)氧氯丙燒,放到170rpm的水浴搖床中，分別30 V、35°C、40°C各2h，用20 %的乙醇、丙酮、去離子水洗滌。經(jīng)高溫滅菌后，損失率約1. 8%。二次交聯(lián)后的瓊脂糖4B微球裝柱(柱內(nèi)徑lcm，裝柱高度3cm)，連接到AKTAPurifier層析系統(tǒng)，隨流速增加，柱壓逐漸增大，當(dāng)流速為400cm/h時(shí)，達(dá)到耐受極限柱壓0.1MPa0實(shí)施例5取40g瓊脂糖4B微球于500mL的具塞三角燒瓶中，加入45mL、l. OmoI/L的NaOH溶液，30°C靜上lOmin，再依次加入36mL 二甲亞砜、6mL無水乙醇和15mL季戊四醇縮水甘油醚，300C，170rpm的水浴搖床中反應(yīng)6h，依次用20%的乙醇、丙酮、去離子水洗滌。取一次交聯(lián)的微球40g于500mL的具塞三角燒瓶中，加入45mL、3. OmoI/L的NaOH溶液，30°C靜止IOmin,再依次加入36mL 二甲亞砜和15mL環(huán)氧氯丙燒,放到170rpm的水浴搖床中，分別30 V、35°C、40°C各2h，用20 %的乙醇、丙酮、去離子水洗滌。經(jīng)高溫滅菌后，損失率約2. 0%。二次交聯(lián)后的瓊脂糖4B微球裝柱(柱內(nèi)徑1cm，裝柱高度3cm)，連接到AKTAPurifier層析系統(tǒng)，隨流速增加，柱壓逐漸增大，當(dāng)流速為400cm/h時(shí)，達(dá)到耐受極限柱壓0.1MPa0基于本發(fā)明精神或主要特征的具體形式并不僅限于上述實(shí)施例，還可有多種組合或變化，如氫氧化鈉的濃度、反應(yīng)時(shí)間、水浴搖床的轉(zhuǎn)速、試劑種類和添加量等均可在一定程度上進(jìn)行調(diào)整，因此，無論從哪一點(diǎn)來看，本發(fā)明的上述實(shí)施方式都只能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的說明而不能限制本發(fā)明，在與本發(fā)明權(quán)利要求書相當(dāng)?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何變化，都應(yīng)認(rèn)為是包括在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種瓊脂糖4B微球的交聯(lián)方法，其特征在于瓊脂糖4B微球依次經(jīng)過季戊四醇縮水甘油醚和環(huán)氧氯丙烷兩步交聯(lián)，形成交聯(lián)瓊脂糖4B微球，其機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性都有較大提聞。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種瓊脂糖4B微球的交聯(lián)方法，其特征在于所用的瓊脂糖 4B微球?yàn)槭惺圻M(jìn)口或國產(chǎn)瓊脂糖微球，凝膠含量為4%，粒徑范圍65-135 μ m。
3.按照權(quán)利要求1所述的一種瓊脂糖4B微球的交聯(lián)方法，其特征在于第一交聯(lián)劑選用大分子鏈的季戊四醇縮水甘油醚，第二交聯(lián)劑選用短分子鏈的環(huán)氧氯丙烷，兩者在空間和位置上形成了互補(bǔ)，交聯(lián)后微球形成了網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)結(jié)構(gòu)。
4.按照權(quán)利要求1所述的一種瓊脂糖4B微球的交聯(lián)方法，其特征在于交聯(lián)步驟如下1)瓊脂糖4B微球的一次交聯(lián)取40-50g瓊脂糖6B微球于250mL的具塞三角燒瓶中，加入40_60mL、1. OmoI/L的NaOH 溶液，30°C靜止lOmin，再依次加入32_40mL 二甲基亞砜、5_10mL無水乙醇和10_20mL季戊四醇縮水甘油醚，30°C，170rpm的水浴搖床中反應(yīng)6h，依次用20 %的乙醇、丙酮、去離子水洗滌。2)瓊脂糖4B微球的二次交聯(lián)取一次交聯(lián)后的微球40-50g于250mL的具塞三角燒瓶中，加入40_60mL、3. OmoI/L的 NaOH溶液，30°C靜止lOmin，再依次加入32_40mL 二甲基亞砜和5_15mL環(huán)氧氯丙烷，放到 170rpm的水浴搖床中，分別30°C、35°C、40°C各2h，依次用20 %的乙醇、丙酮、去離子水洗滌。
5.按照權(quán)利要求4所述的一種瓊脂糖4B微球的交聯(lián)方法，其特征在于一次交聯(lián)體系的催化劑選用O. 5-1. 2mol/L的NaOH溶液，二次交聯(lián)體系的催化劑選用2. 5-3. 5mol/L的NaOH 溶液。
6.按照權(quán)利要求4所述的一種瓊脂糖4B微球的交聯(lián)方法,其特征在于一次交聯(lián)體系中弓I入水溶性有機(jī)溶劑二甲基亞砜和無水乙醇，二次交聯(lián)體系中就怕引入水溶性有機(jī)溶劑二甲基亞砜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種瓊脂糖4B微球的交聯(lián)方法。以瓊脂糖4B微球?yàn)椴牧希约疚焖拇伎s水甘油醚和環(huán)氧氯丙烷為交聯(lián)劑進(jìn)行兩步交聯(lián)。具體步驟如下1)瓊脂糖4B微球的一次交聯(lián)，將瓊脂糖4B微球、氫氧化鈉和二甲亞砜、無水乙醇和季戊四醇縮水甘油醚于具塞三角燒瓶中，放入水浴搖床震蕩，機(jī)械攪拌一定時(shí)間，獲得一次交聯(lián)的瓊脂糖4B微球。2)瓊脂糖4B微球的二次交聯(lián)，將一次交聯(lián)后的瓊脂糖4B微球與氫氧化鈉溶液混勻靜止，然后依次加入二甲亞砜和環(huán)氧氯丙烷，水浴搖床震蕩，獲得二次交聯(lián)后的瓊脂糖4B微球。本發(fā)明所開發(fā)的上述交聯(lián)微球，具有球形度好、耐高溫高壓、良好的流體力學(xué)性能、化學(xué)穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于作為生物大分子層析分離的基質(zhì)。
文檔編號(hào)C08L5/12GK102989400SQ201210411208
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月25日
發(fā)明者夏海鋒, 鄭夢(mèng)杰, 吳璞強(qiáng) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)