專利名稱：(1－3)－β－D－葡聚糖的精制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種(I — 3) — β — D —葡聚糖的精制方法。
背景技術(shù)：
侵襲性真菌感染越來(lái)越受到臨床醫(yī)生的重視，在腫瘤化療、骨髓/器官移植、AIDS 和危重病等免疫功能受損的患者中，其患病率和死亡率明顯上升。廣譜抗生素和有創(chuàng)性診療操作是導(dǎo)致侵襲性真菌感染發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素。由于侵襲性真菌感染缺乏特異性臨床表現(xiàn)，傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室涂片、培養(yǎng)等微生物學(xué)檢查耗時(shí)且陽(yáng)性率低，組織病理學(xué)檢查因有創(chuàng)傷加重患者病情而嚴(yán)重限制了臨床應(yīng)用，這些復(fù)雜的因素使受侵襲性真菌感染的診斷極其困難和滯后，也是死亡率增高的重要原因。真菌感染患者血漿中含有(I 一 3)— β 一 D—葡聚糖是目前關(guān)注較多的一種診斷方法，(I 一 3) — β 一 D—葡聚糖僅存在于真菌的細(xì)胞壁中， 細(xì)菌和人類細(xì)胞壁不存在(I 一 3) — β 一 D—葡聚糖，因此血漿(I 一 3) — β 一 D—葡聚糖陽(yáng)性具有特異性診斷深部真菌感染的價(jià)值。目前真菌葡聚糖檢測(cè)米用的標(biāo)準(zhǔn)品為(I— 3)— β — D —葡聚糖,現(xiàn)市販的(I — 3) - β 一 D—葡聚糖，純度較低或者價(jià)格較昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種(I 一 3)— β — D—葡聚糖的精制方法，制備的(I 一 3) - β 一 D—葡聚糖純度較高、成本較低。本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下
(O脫脂將茯苓粉末分別用無(wú)水乙醇、80%乙醇和水提取、過(guò)濾，濾渣經(jīng)脫水、干燥得到脫脂茯苓；
(2)粗制脫脂茯苓用水配制成重量比為O.8%-1. 2%的懸浮液，冷卻至0-4°C，邊攪拌邊加入5N NaOH溶解，然后4°C、IOOOOrpm離心15_30min除去不溶物，上清液置于0_4°C冰水浴中邊攪拌邊加入體積比為10%的醋酸進(jìn)行中和；4°C、IOOOOrpm離心15_30min收集膠狀沉淀；上述膠狀沉淀依次用水、酒精、乙醚洗滌、脫水；然后放入硫酸干燥器進(jìn)行減壓干燥，得到粗制(I 一 3) — β 一 D —葡聚糖；
(3)精制取粗制(I一 3) — β 一 D—葡聚糖加入二甲亞砜，在室溫下攪拌溶解；4°C、 IOOOOrpm離心15_30min，除去沉淀；上清液邊攪拌邊緩慢加入0_4°C冰水，直至沉淀不再增加，4°C、IOOOOrpm離心15_30min收集沉淀,沉淀依次用水、酒精、乙醚洗漆、脫水,然后放入硫酸干燥器進(jìn)行減壓干燥，得到精制(I 一 3) — β — D —葡聚糖。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)目前，國(guó)內(nèi)的多糖生產(chǎn)原料主要是真菌子實(shí)體發(fā)酵得到的菌絲體及發(fā)酵液等，本發(fā)明的原料直接采用子實(shí)體(茯苓子實(shí)體本身為塊狀，曬干后破碎研磨成粉末)，則來(lái)源廣泛且成本低；而工藝相比之下，熱水浸提法較費(fèi)時(shí)且收得率低，酶法及超聲波法又易破壞多糖的空間結(jié)構(gòu)及活性且成本較高，本工藝成本低，操作簡(jiǎn)單，收得率也較高，其產(chǎn)品純度高，性能也較穩(wěn)定。


圖I為Dextran-40的高效液相色譜圖。圖2為精制BG的高效液相色譜圖。圖3為Dextran-40純品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4為精制BG的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5為在0-4°C冰箱保存7天后的精制BG的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
(一)脫脂
①原料、試劑及器具的準(zhǔn)備
②取茯苓粉末500g放入3L的燒杯中，加入2L酒精，用錫箔紙覆蓋，室溫下攪拌30min。 然后用63目的砂芯漏斗進(jìn)行抽濾。③以上②的操作重復(fù)兩次。④濾取的茯苓粉末加入80%酒精，用磁力攪拌器攪拌30min (室溫)。⑤用G3砂芯漏斗抽濾。⑥按④⑤的操作重復(fù)兩次。⑦濾取的茯苓粉末加入4L水用磁力攪拌器攪拌30min。⑧用G3砂芯漏斗抽濾。⑨按⑦⑧的操作重復(fù)兩次。⑩將得到的茯苓粉末放入G3砂芯漏斗，用藥勺一邊攪拌，一邊加入酒精脫水， 之后用40°C真空干燥，這樣500g茯苓能得到400g脫脂茯苓。(二)粗制(1-3) - β-glucan (BG)
①取脫脂茯苓12g放入2L三角燒瓶，加水1080ml，用磁力攪拌器攪拌，使其分散，呈懸浮狀。②在冷卻條件下(0-4°C)，邊攪拌邊加入5N NaOH 120ml，溶解。③移入離心管，4°C UOOOOrpm、20min，離心除去少量不溶物。④將上清液倒入2L燒杯，置于冰水浴(0-4°C )中邊攪拌邊加入10%醋酸，使溶液中和。⑤4°C、IOOOOrpm、20min ,離心收集膠狀沉淀。⑥沉淀洗滌上述膠狀沉淀加400ml水，用藥勺攪拌，同步驟⑤離心收集沉淀，沉淀中再加入250ml酒精，同樣操作兩次。最后加入乙醚200ml，同樣兩次操作洗滌，脫水。⑦將洗凈后的沉淀放入硫酸干燥器進(jìn)行減壓干燥。這樣原材料12g，粗制后約得 Hg。(三)精制BG制備
①取粗制BGlOg加入2L三角燒瓶，加入I. 2L 二甲亞砜(DMS0)，蓋上錫箔紙，在室溫下攪拌溶解。②4°C、IOOOOrpm 離心 20min,除去沉淀。
③將離心的上清液倒入5L燒杯，邊攪拌邊緩慢加入0-4°C冰水，直至沉淀不再增加。④離心,4°C、10000rpm、20min,收集沉淀。⑤沉淀依次加入400ml的水，200ml的酒精，150ml的乙醚，按順序洗滌、脫水。⑥沉淀放入硫酸干燥器，進(jìn)行減壓干燥，這樣利用IOg粗制BG得到了 9g精制BG， 收得率約為85%。高效液相色譜指紋圖顯示峰I為β -葡聚糖,如圖2所示。(四)精制BG效價(jià)測(cè)定 ①效價(jià)測(cè)定
1)ΜΤ_1Β型檢測(cè)試劑盒！Associates of CAPE COD Incorporated(美國(guó))，Kit Number GD11007,55Test Endpoint Assay Kit。2) Dextran-40 (作為葡聚糖純品)Wako (日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社)，和光一級(jí)，平均分子量=32000-45000，純度為99%，裝量為50g，Lot為DCK2746。3)葡聚糖純品曲線的制作
a> lmg/ml dextran-40 的配制準(zhǔn)確稱取 0. 5g dextran -40 (MW40000)加入到裝有 500ml水的燒杯里，用磁力攪拌器攪拌，在室溫下使之完全溶解，再加入IOg活性炭，在室溫下攪拌30min。將以上溶液，每100ml用D-GS (0. 22 μ m)過(guò)濾器過(guò)濾。后合并500ml裝入 500ml瓶中4°C保存。b、稀釋取上述a的溶液少量,用水準(zhǔn)確稀釋成40pg/ml、20pg/ml、10pg/ml、5pg/ ml，每種濃度約1ml。C、主試劑的復(fù)溶及分裝MT_1B型檢測(cè)試劑主試劑(Contains freeze-dried chromogenic glucan detection reagent)按裝量先用 0. 2M Tris-Hcl 緩沖劑 /PH8. O 復(fù)溶，之后在酶標(biāo)板上選取10個(gè)孔，布成2排5行，往每孔加入50 ul主試劑。剩余的主試劑放入0—4 °C冰箱保存。d、加樣往第I行的兩孔各加入50ul的水作為空白，從第2行開始，按濃度從低到高往平行的兩孔各加入50ul的葡聚糖純品溶液，加好后，在微量振蕩儀上振蕩30s，再放入 37± I°C的恒溫水浴鍋里反應(yīng)30min，之后用重氮化試劑進(jìn)行顯色。e、檢測(cè)將上述酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，在545nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，記錄數(shù)據(jù)。4)精制BG曲線的制作
a、精制BG溶液的制備及稀釋將精制BG3-4mg移至試管中，用0. IN NaOH配成濃度為I. Omg/mL·并用0. IN NaOH以10倍稀釋法逐步稀釋至100pg/ml，再用0. OlN NaOH分別稀釋為 40pg/ml, 20pg/ml, 10pg/ml, 5pg/ml。b、主試劑的分裝從冰箱里取出剩余的主試劑，以步驟3) c中相同的方式分裝主試劑。剩余樣品放入0—4°C冰箱保存。C、加樣往第I行的平行兩孔各加入50ul的0. OlN NaOH作為空白，其余操作不變。剩余樣品放入0-4°C冰箱保存，一周后以同樣操作再標(biāo)定一次。d、檢測(cè)同樣將上述酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，在545nm波長(zhǎng)檢測(cè)，記錄數(shù)據(jù)。②結(jié)果
I)Dextran-40
表I為Dextran-40純品的檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種(I 一 3) — β — D —葡聚糖的精制方法，其特征在于所述精制方法包括以下步驟(O脫脂將茯苓粉末分別用無(wú)水乙醇、80%乙醇和水提取、過(guò)濾，濾渣經(jīng)脫水、干燥得到脫脂茯苓；(2)粗制脫脂茯苓用水配制成重量比為O.8%-1. 2%的懸浮液，冷卻至0-4°C，邊攪拌邊加入5N NaOH溶解，然后4°C、IOOOOrpm離心15_30min除去不溶物，上清液置于0_4°C冰水浴中邊攪拌邊加入體積比為10%的醋酸進(jìn)行中和；4°C、IOOOOrpm離心15_30min收集膠狀沉淀；上述膠狀沉淀依次用水、酒精、乙醚洗滌、脫水；然后放入硫酸干燥器進(jìn)行減壓干燥，得到粗制(I 一 3) — β 一 D —葡聚糖；(3)精制取粗制(I一 3) — β 一 D—葡聚糖加入二甲亞砜，在室溫下攪拌溶解；4°C、 IOOOOrpm離心15_30min，除去沉淀；上清液邊攪拌邊緩慢加入0_4°C冰水，直至沉淀不再增加，4°C、IOOOOrpm離心15_30min收集沉淀,沉淀依次用水、酒精、乙醚洗漆、脫水,然后放入硫酸干燥器進(jìn)行減壓干燥，得到精制(I 一 3) — β — D —葡聚糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種(1－3)－β－D－葡聚糖的精制方法。該方法包括茯苓粉末的脫脂、加堿反應(yīng)粗制、加入二甲亞砜精制，本發(fā)明的原料直接采用子實(shí)體，則來(lái)源廣泛且成本低；本發(fā)明工藝成本低，操作簡(jiǎn)單，收得率也較高，其產(chǎn)品純度高，性能也較穩(wěn)定。
文檔編號(hào)C08B37/02GK102603916SQ201210076069
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月21日
發(fā)明者丁友玲, 陳曉佳 申請(qǐng)人:丁友玲