專利名稱：一種納米碳量子點-聚乙烯亞胺復(fù)合轉(zhuǎn)基因載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因載體及其制備方法，更具體地說，涉及一種納米碳量子點與高聚物相結(jié)合的轉(zhuǎn)基因載體及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因治療是指將人的正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導(dǎo)入人體靶細胞以糾正、補償基因的缺陷或異常，從而達到治療目的的方法?；蜉d體是將基因?qū)氚屑毎闹饕ぞ?，分為病毒載體(viral vector)和非病毒載體(nonviral vector)兩種?？刹捎玫牟《据d體有反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒伴隨病毒等。病毒載體在基因治療中已取得了一些突破性進展，但是在臨床應(yīng)用過程中，其導(dǎo)向性差、攜帶能力低、免疫原性和潛在致癌性等仍然是其難以克服的重大隱患。而非病毒載體作為基因遞送的另一條途徑，逐漸引起人們的廣泛研究，其主要包括裸DNA、脂質(zhì)體、陽離子高聚物等。陽離子高聚物作為非病毒載體的一部分，它除了存在非病毒載體的特點(低毒性，低免疫原性和低致癌性)以外，還有自身的優(yōu)勢，即易制備和攜帶目的基因能力高，這些更加有利于其作為轉(zhuǎn)基因載體的應(yīng)用。常見的陽離子高聚物能夠通過強靜電作用有效縮合DNA，形成較穩(wěn)定的聚電解質(zhì)復(fù)合物(PECs)。這些PECs易于細胞內(nèi)化，從內(nèi)涵體中逃逸， 并能有效保護DNA免受DNA酶的降解。但是陽離子高聚物作為基因載體應(yīng)用時，仍呈現(xiàn)出了一些問題，例如生物相容性差、有毒性、以及轉(zhuǎn)染效率低等。目前在生物分析中常用的標(biāo)記物主要有酶或底物、化學(xué)或生物發(fā)光體系和熒光物質(zhì)。早期應(yīng)用廣泛的放射性同位素，因其對環(huán)境和人體的損害，現(xiàn)已不常用。酶免疫分析法雖然不具有放射性污染的問題，但酶本身容易失活。化學(xué)和生物發(fā)光分析法的靈敏度雖然很高，但易受外部環(huán)境的影響，穩(wěn)定性也比較差，瞬間的化學(xué)反應(yīng)后，樣品的發(fā)光無法再現(xiàn)， 結(jié)果的重復(fù)性差。雖然熒光探針克服了以上缺點，但是現(xiàn)在常用的有機熒光染料卻存在著發(fā)光譜窄、發(fā)射光譜寬且不對稱、熒光穩(wěn)定性差的缺點，要進行多組分同時檢測還存在很多困難。而利用量子點作為生物熒光探針就能較好地解決上述問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種納米碳量子點與高聚物相結(jié)合的陽離子聚合物，作為非病毒載體，可有效地復(fù)合DNA，具有非常好的轉(zhuǎn)基因能力，同時還能通過光學(xué)實現(xiàn)對于轉(zhuǎn)染過程的跟蹤。本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種制備上述陽離子非病毒基因載體的方法。本發(fā)明的上述目的通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)。首先將聚乙烯亞胺均勻分散在磷酸鹽溶液中，然后微波處理上述溶液與甘油的均勻混合液，最后將反應(yīng)后的產(chǎn)物冷卻、稀釋、進行透析，除去鹽分及未反應(yīng)的甘油、PEI，凍干即得納米碳量子點-聚乙烯亞胺復(fù)合轉(zhuǎn)基因載體。其中聚乙烯亞胺(PEI)通過化學(xué)鍵鍵接到納米碳量子點上，具有雙重功效，其一是用于碳量子點的表面鈍化劑，其二是肩負陽離子聚合物性能，承載DNA。本發(fā)明技術(shù)方案的制備方法通過附

圖1所示的紅外光譜(紅外儀器型號Nicolet 380spectrometer (Thermo, America))予以證實圖一中曲線 a 為原料 PEI25K(美國 sigma 公司的聚乙烯亞胺PEI25K，重均分子量為25000)的紅外圖譜，曲線b為反應(yīng)5min制得的碳量子點-聚乙烯亞胺復(fù)合轉(zhuǎn)基因載體(⑶-PEI-A)的紅外圖譜，曲線c為反應(yīng)IOmin制得的碳量子點-聚乙烯亞胺復(fù)合轉(zhuǎn)基因載體(⑶-PEI-B)的紅外圖譜，曲線d為反應(yīng)15min制得的碳量子點-聚乙烯亞胺復(fù)合轉(zhuǎn)基因載體(⑶-PEI-C)的紅外圖譜。b、c、d三條曲線在波數(shù)1645cm—1處均存在C = O鍵的吸收峰，而曲線a在此波數(shù)處無吸收峰，可以看出聚乙烯亞胺已成功地接枝到了納米碳量子點表面。而且隨著微波處理時間的增加，C = 0鍵的吸收峰逐漸加強，而在1570CHT1處的N-H鍵的吸收峰顯示出下降的趨勢。如下表一的化學(xué)元素分析可知，樣品CD-PEI-A、CD-PEI-B、CD-PEI-C除具有碳、氫和氧外，還具有高含量的氮， 說明聚乙烯亞胺已成功地接枝到了納米碳量子點的表面上。可以推知，在加熱過程中，甘油可能被氧化，形成帶有羧基的一種化合物，與聚乙烯亞胺的氨基形成酰胺鍵，從而使聚乙烯亞胺鍵接在納米碳量子點的表面上，因此在一般情況下可以選擇聚乙烯亞胺稍微過量。如下表1的化學(xué)元素分析(化學(xué)元素分析儀Vanio-EL (Elementar Analysensysteme GmbH, Germany))可知，樣品CD-PEI-A、CD-PEI-B、CD-PEI-C除具有碳、氫和氧外，還具有高含量的氮，說明聚乙烯亞胺已成功地接枝到了納米碳量子點的表面上。表1不同樣品的化學(xué)元素分析表(質(zhì)量百分數(shù))
權(quán)利要求
1.一種納米碳量子點-聚乙烯亞胺復(fù)合轉(zhuǎn)基因載體，其特征在于，按照下述方法將聚乙烯亞胺通過化學(xué)鍵鍵接到納米碳量子點上首先將聚乙烯亞胺均勻分散在磷酸鹽溶液中，然后微波處理上述溶液與甘油的均勻混合液，最后將反應(yīng)后的產(chǎn)物冷卻、稀釋、進行透析，除去鹽分及未反應(yīng)的原料，凍干即得納米碳量子點-聚乙烯亞胺復(fù)合轉(zhuǎn)基因載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種納米碳量子點-聚乙烯亞胺復(fù)合轉(zhuǎn)基因載體，其特征在于，所述鍵接到納米碳量子點上的聚乙烯亞胺具有雙重功效，其一是用于碳量子點的表面鈍化劑，其二是肩負陽離子聚合物性能，承載DNA。
3.一種制備納米碳量子點-聚乙烯亞胺復(fù)合轉(zhuǎn)基因載體的方法，其特征在于，按照下述步驟進行首先將聚乙烯亞胺均勻分散在磷酸鹽溶液中，然后微波處理上述溶液與甘油的均勻混合液，最后將反應(yīng)后的產(chǎn)物冷卻、稀釋、進行透析，除去鹽分及未反應(yīng)的原料，凍干即得納米碳量子點-聚乙烯亞胺復(fù)合轉(zhuǎn)基因載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種制備納米碳量子點-聚乙烯亞胺復(fù)合轉(zhuǎn)基因載體的方法，其特征在于，在所述制備方法中，聚乙烯亞胺具有雙重功效，其一是用于碳量子點的表面鈍化劑，其二是肩負陽離子聚合物性能，承載DNA。
5.如權(quán)利要求1所述的納米碳量子點-聚乙烯亞胺復(fù)合轉(zhuǎn)基因載體作為非病毒類轉(zhuǎn)基因載體的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種納米碳量子點與高聚物相結(jié)合的轉(zhuǎn)基因載體及其制備方法，具體來說，就是利用一步成型法將聚乙烯亞胺鍵接到碳量子點上，形成納米碳量子點-聚乙烯亞胺復(fù)合轉(zhuǎn)基因載體，用于基因轉(zhuǎn)染。本發(fā)明的優(yōu)點在于碳量子點的成型及表面鈍化可同時完成，工藝簡單，綠色環(huán)保，且制備出的載體可以非常有效地復(fù)合并壓縮DNA，在保護DNA免受核酸酶降解的同時獲得非常好的轉(zhuǎn)染效率，并能通過光學(xué)方法實現(xiàn)對轉(zhuǎn)染過程的跟蹤。
文檔編號C08G73/04GK102492724SQ20111041019
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者劉文廣, 劉長軍, 張鵬, 李詠懋 申請人:天津大學(xué)