專利名稱：一種骨膠原凝膠液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學工程領(lǐng)域，是一種為進行雙相接種法構(gòu)建組織工程骨而制備骨膠原的方法，特別是一種骨膠原凝膠液的制備方法。
背景技術(shù)：
臨床工作中，多種疾病的治療如骨不連、骨缺損及各種骨融合手術(shù)均需要使用骨移植材料。目前，供臨床使用的骨移植材料種類很多，均存在不同程度的缺陷，因此，目前尚無理想的骨移植材料來源。組織工程的興起和發(fā)展為研制新型的、具有良好成骨活性的骨移植材料提供了新的思路和技術(shù)方法。經(jīng)過十余年的發(fā)展，骨組織工程在各主要環(huán)節(jié)取得了巨大進步。然而，在種子細胞與支架材料復合進行組織構(gòu)建時，種子細胞接種效率低下，嚴重影響了組織工程骨的質(zhì)量并造成種子細胞的大量浪費，是目前亟待解決的技術(shù)難題。有研究應用鼠尾膠原進行種子細胞雙相接種即先將種子細胞在適當條件下與膠原凝膠液均勻混合，在膠原凝聚前將混合物與組織工程支架復合，從而獲得了極高的種子細胞上架率，構(gòu)建成功了具有良好屬性的組織工程軟骨。但是，鼠尾膠原來源有限，并且存在倫理學障礙，難以應用于臨床，因此需要尋找一種來源豐富、成凝膠性好、有利于組織工程骨成熟的膠原凝膠來源。
膠原是脊椎動物和人體主要的結(jié)構(gòu)蛋白，占人體蛋白質(zhì)總量的25-30％，廣泛分布于骨骼、肌腱、皮膚、血管等各種組織和器官中。膠原的種類很多，其中I、II、III和IV型是最常用的四種膠原。有研究表明I型膠原對成骨細胞增殖及表型的表達具有促進作用，而其它類型的膠原是否對成骨產(chǎn)生負面影響目前尚不得而知。目前在各領(lǐng)域中應用的膠原主要來源于皮膚、肌腱等組織，但這些組織中除含有大量非膠原性成分外尚含有其它多種膠原成分，不易純化，提取成本高。骨組織是一個巨大的膠原庫，其膠原成分主要是I型膠原，并且含量高，占骨有機成分的90％以上。同時骨膠原來源于骨，且來源豐富，理論上其成分對成骨應無不利影響，因此骨是獲得進行組織工程骨構(gòu)建所需膠原凝膠液的較為理想的來源。
但是，與其它組織不同的是，骨膠原的交聯(lián)程度高，常用的酸溶解法、中性鹽法難以提取。堿溶法可用于提取骨膠原，有文獻Kemp，GD.Tristram，GR.The preparation of an alkali-collagen fromdemineralized bone.Biochem J，1971，124(5)915-919.其技術(shù)特征是將脫鈣骨基質(zhì)用5％NaOH20℃條件下作用48小時，然后用鹽酸將混合物的PH值調(diào)至4.0，有大量絮狀沉淀產(chǎn)生，經(jīng)過離心、溶解、鹽析、透析、凍干等過程獲得膠原。但是堿溶法提取的骨膠原，其溶液粘度低，成凝膠性差，在骨組織構(gòu)建中應用受到很大限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服前述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作簡單，提取效率高，膠原純度高，成凝膠性好的骨膠原凝膠液的制備方法。
本發(fā)明采用了這樣的技術(shù)方案一種骨膠原凝膠液的制備方法，其特征在于采用如下的制備工藝步驟1)脫鈣骨基質(zhì)粉的制備；2)脫鈣骨基質(zhì)粉的非膠原雜質(zhì)的去除；3)去除非膠原雜質(zhì)的脫鈣骨基質(zhì)粉的膠原蛋白變性；4)膠原蛋白變性后的脫鈣骨基質(zhì)的膠原蛋白酶解；5)膠原蛋白純化；6)凝膠液制備。
脫鈣骨基質(zhì)粉的制備是取新鮮動物長骨，去除周圍軟組織及骨膜、骨端松質(zhì)骨，刮除骨髓，然后將皮質(zhì)骨辟成碎塊，經(jīng)清水沖冼后，加入1∶1的甲醇-氯仿脫脂12-72小時，再加入摩爾濃度為0.1-1.0M的鹽酸脫鈣3-14天，經(jīng)三蒸水漂洗后，再次經(jīng)1∶1的甲醇-氯仿脫脂12-72小時，經(jīng)組織粉碎機將已軟化的皮質(zhì)骨塊攪碎成脫鈣骨基質(zhì)粉，風干備用。
脫鈣骨基質(zhì)粉的非膠原雜質(zhì)的去除是取5份脫鈣骨基質(zhì)粉，加入150-250份濃度為0.01％-0.2％的NaOH溶液，置于4℃冰箱中作用12-72小時，然后取出過濾，過濾剩余物用三蒸水反復洗滌。
去除非膠原雜質(zhì)的脫鈣骨基質(zhì)粉的膠原蛋白變性是將去除非膠原雜質(zhì)后的脫鈣骨基質(zhì)粉加入50-100份含有摩爾濃度為2.0-6.0M的鹽酸胍且PH值為7.4的Tris-HCl溶液中，置于4℃冰箱中作用12-72小時，然后取出過濾，過濾剩余物用三蒸水反復洗滌去除鹽酸胍。
膠原蛋白變性后的脫鈣骨基質(zhì)粉的膠原蛋白酶解是將經(jīng)膠原蛋白變性后的脫鈣骨基質(zhì)加入200份-800份摩爾濃度為0.1-1.0M的醋酸溶液中，再加入0.05-2份胃蛋白酶，置于磁力攪拌器上，在5℃-25℃環(huán)境中連續(xù)攪拌24-96小時，獲得脫鈣骨基質(zhì)液。
膠原蛋白的純化是將經(jīng)過膠原蛋白酶解的脫鈣骨基質(zhì)液在2-10℃溫度下，在轉(zhuǎn)速為6000-20000rpm的離心機上離心10-60分鐘后，取其上清液，在上清液中加入NaCl晶體使上清液濃度達2M，在有大量紫狀沉淀產(chǎn)生時，再次在前述相同條件下離心，取沉淀物，加入100-200份摩爾濃度為0.1-1.0M的冰醋酸溶解并裝入透析袋，在摩爾濃度為10-20mM的Na2HPO4溶液中透析2-24小時滅活胃蛋白酶，再放入摩爾濃度為0.1-1.0M的冰醋酸溶液中透析24-72小時后，再重復上述鹽析、離心、溶解、透析操作一次，獲得的粘性膠原凝膠液裝入燒杯中凍干，取得純化的凍干骨膠原。
凝膠液制備及固化是將凍干骨膠原用摩爾濃度為0.1-1.0M的冰醋酸溶解，制成濃度為0.1-10％的骨膠原凝膠液。
本發(fā)明針對影響膠原溶解的兩個主要環(huán)節(jié)交聯(lián)的程度及其位置；特異性非膠原蛋白成分的存在而設(shè)計，首先用低濃度堿將特異性非膠原蛋白成分去除，再應用胃蛋白酶選擇性切斷交聯(lián)集中分布的膠原分子兩端的非螺旋區(qū)，從而使骨膠原由不溶變?yōu)榭扇?。方案中加入鹽酸胍這一強蛋白變性劑，通過其與膠原分子的氨基酸側(cè)鏈間形成氫鍵來破壞膠原分子間形成的氫鍵，并且阻斷膠原分子間疏水鍵的作用，從而增強骨膠原的可溶解性，提高骨膠原的提取效率。本發(fā)明具有操作簡便，提取效率高，膠原純度高，成凝膠性好等優(yōu)點。
具體實施例方式
下面將本發(fā)明應用于豬骨膠原的提取，來說明本發(fā)明的實施方案。一種骨膠原凝膠液的制備方法，其特征在于采用如下的制備工藝步驟1)脫鈣骨基質(zhì)粉的制備；2)脫鈣骨基質(zhì)粉的非膠原雜質(zhì)的去除；3)去除非膠原雜質(zhì)的脫鈣骨基質(zhì)粉的膠原蛋白變性；4)膠原蛋白變性后的脫鈣骨基質(zhì)的膠原蛋白酶解；5)膠原蛋白純化；6)凝膠液制備。
脫鈣骨基質(zhì)粉的制備取新鮮豬長骨，去除周圍軟組織及骨膜、骨端松質(zhì)骨，刮除骨髓，然后將皮質(zhì)骨劈成碎塊，大量清水沖洗后，加入1∶1的甲醇-氯仿中脫酯24小時，再加入摩爾濃度為0.6M的鹽酸脫鈣8天(每48小時更換脫鈣液一次)，大量三蒸水漂洗后，再次用1∶1的甲醇-氯仿脫酯24小時，組織粉碎機將已軟化的皮質(zhì)骨塊攪碎成脫鈣骨基質(zhì)粉，風干備用。
脫鈣骨基質(zhì)粉的非膠原性雜質(zhì)的去除稱取5.0克脫鈣骨基質(zhì)粉，加入150克濃度為0.1％NaOH溶液，置于4℃冰箱中作用24小時，然后過濾，過濾剩余物用三蒸水反復洗滌。
去除非膠原雜質(zhì)的脫鈣骨基質(zhì)粉的膠原蛋白變性去除非膠原雜質(zhì)的脫鈣骨基質(zhì)粉加入100克含摩爾濃度為4.0M鹽酸胍且PH值為7.4的Tris-HCl的溶液中，置于4℃冰箱中繼續(xù)作用24小時，然后過濾，過濾剩余物用三蒸水反復洗滌去除鹽酸胍。
膠原蛋白變性后的脫鈣骨基質(zhì)的膠原蛋白酶解經(jīng)膠原蛋白變性后的脫鈣骨基質(zhì)加入500克摩爾濃度為0.5M的醋酸溶液中，再加入0.5克胃蛋白酶(Sigma公司)，置于磁力攪拌器上，在10℃-20℃環(huán)境中連續(xù)攪拌48小時，獲得脫鈣骨基質(zhì)液。
膠原蛋白的純化經(jīng)過膠原蛋白酶解后的脫鈣骨基質(zhì)液在4℃、10000rpm條件下離心20分鐘，取上清液加入NaCl晶體使其濃度達到2M，此時有大量紫狀沉淀產(chǎn)生，再次在前述相同條件下離心，取沉淀物，加入100克濃度為0.5M冰醋酸溶解并裝入透析袋，在濃度為20mM的Na2HPO4溶液中透析8小時滅活胃蛋白酶，再放入濃度為0.175M冰醋酸溶液中透析48小時(每8小時更換一次透析液)，重復上述鹽析、離心、溶解、透析操作一次，最后得粘性膠原溶液，將膠原溶液裝入大燒杯中凍干，最后得純化的凍干骨膠原。
凝膠液制備將凍干骨膠原用摩爾濃度為0.5M冰醋酸溶解，得濃度為4％的骨膠原凝膠液。將該膠原凝膠液置入冰浴中，用濃度為1M的NaOH和0.1M的NaOH將溶液的PH值調(diào)節(jié)至7.35-7.45，然后迅速加入到六孔板中，置37℃水浴中孵育30分鐘，形成膠原凝膠。
權(quán)利要求
1.一種骨膠原凝膠液的制備方法，其特征在于采用如下的制備工藝步驟1)脫鈣骨基質(zhì)粉的制備；2)脫鈣骨基質(zhì)粉的非膠原雜質(zhì)的去除；3)去除非膠原雜質(zhì)的脫鈣骨基質(zhì)粉的膠原蛋白變性；4)膠原蛋白變性后的脫鈣骨基質(zhì)的膠原蛋白酶解；5)膠原蛋白純化；6)凝膠液制備。
2.按權(quán)利要求1所述的骨膠原凝膠液的制備方法，其特征在于所說的脫鈣骨基質(zhì)粉的制備是取新鮮動物長骨，去除周圍軟組織及骨膜、骨端松質(zhì)骨，刮除骨髓，然后將皮質(zhì)骨辟成碎塊，經(jīng)清水沖冼后，加入1∶1的甲醇-氯仿脫脂12-72小時，再加入摩爾濃度為0.1-1.0M的鹽酸脫鈣3-14天，經(jīng)三蒸水漂洗后，再次經(jīng)1∶1的甲醇-氯仿脫脂12-72小時，經(jīng)組織粉碎機將已軟化的皮質(zhì)骨塊攪碎成脫鈣骨基質(zhì)粉，風干備用。
3.按權(quán)利要求1所述的骨膠原凝膠液的制備方法，其特征在于所說的脫鈣骨基質(zhì)粉的非膠原雜質(zhì)的去除是取5份脫鈣骨基質(zhì)粉，加入150-250份濃度為0.01％-0.2％的NaOH溶液，置于4℃冰箱中作用12-72小時，然后取出過濾，過濾剩余物用三蒸水反復洗滌。
4.按權(quán)利要求1所述的骨膠原凝膠液的制備方法，其特征在于所說的去除非膠原雜質(zhì)的脫鈣骨基質(zhì)粉的膠原蛋白變性是將去除非膠原雜質(zhì)后的脫鈣骨基質(zhì)粉加入50-100份含有摩爾濃度為2.0-6.0M的鹽酸胍且PH值為7.4的Tris-HCl溶液中，置于4℃冰箱中作用12-72小時，然后取出過濾，過濾剩余物用三蒸水反復洗滌去除鹽酸胍。
5.按權(quán)利要求1所述的骨膠原凝膠液的制備方法，其特征在于所說的膠原蛋白變性后的脫鈣骨基質(zhì)粉的膠原蛋白酶解是將經(jīng)膠原蛋白變性后的脫鈣骨基質(zhì)加入200份-800份摩爾濃度為0.1-1.0M的醋酸溶液中，再加入0.05-2份胃蛋白酶，置于磁力攪拌器上，在5℃-25℃環(huán)境中連續(xù)攪拌24-96小時，獲得脫鈣骨基質(zhì)液。
6.按權(quán)利要求1所述的骨膠原凝膠液的制備方法，其特征在于所說的膠原蛋白的純化是將經(jīng)過膠原蛋白酶解的脫鈣骨基質(zhì)液在2-10℃溫度下，在轉(zhuǎn)速為6000-20000rpm的離心機上離心10-60分鐘后，取其上清液，在上清液中加入NaCl晶體使上清液濃度達2M，在有大量紫狀沉淀產(chǎn)生時，再次在前述相同條件下離心，取沉淀物，加入100-200份摩爾濃度為0.1-1.0M的冰醋酸溶解并裝入透析袋，在摩爾濃度為10-20mM的Na2HPO4溶液中透析2-24小時滅活胃蛋白酶，再放入摩爾濃度為0.1-1.0M的冰醋酸溶液中透析24-72小時后，再重復上述鹽析、離心、溶解、透析操作一次，獲得的粘性膠原凝膠液裝入燒杯中凍干，取得純化的凍干骨膠原。
7.按權(quán)利要求1所述的骨膠原凝膠液的制備方法，其特征在于凝膠液制備是將凍干骨膠原用摩爾濃度為0.1-1.0M的冰醋酸溶解，制成濃度為0.1-10％的骨膠原凝膠液。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學工程領(lǐng)域，是一種為進行雙相接種法構(gòu)建組織工程骨而制備骨膠原的方法，特別是一種骨膠原凝膠液的制備方法，其特征在于采用如下的制備工藝步驟1)脫鈣骨基質(zhì)粉的制備；2)脫鈣骨基質(zhì)粉的非膠原雜質(zhì)的去除；3)去除非膠原雜質(zhì)的脫鈣骨基質(zhì)粉的膠原蛋白變性；4)膠原蛋白變性后的脫鈣骨基質(zhì)的膠原蛋白酶解；5)膠原蛋白純化；6)凝膠液制備。本發(fā)明具有操作簡單，提取效率高，膠原純度高，成凝膠性好的優(yōu)點。
文檔編號C08H1/06GK1763135SQ200510057329
公開日2006年4月26日 申請日期2005年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月18日
發(fā)明者周強, 呂仁發(fā), 許建中, 王序全 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院