專利名稱：：清除病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明所屬領(lǐng)域?yàn)樵诩兓?、減少或清除病毒的過程中，通過小孔徑排阻濾膜(filter)回收大蛋白類物質(zhì)。通過大小排阻將病毒與大生物分子(例如γ球蛋白)分離的障礙在于難以令大的球蛋白通過所需小孔徑濾膜以供制藥或診斷性應(yīng)用。用本發(fā)明方法從蛋白分子中清除病毒可得到基本無病毒的產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
：在純化、減少或清除病毒的過程中，通過小孔徑排阻濾膜(filter)回收大蛋白類物質(zhì)是目前制藥和診斷行業(yè)中的重要問題(參見Roberts，PVoxSang，1995；6982-83)。通過大小排阻將病毒與大生物分子(例如單克隆或多克隆γ球蛋白)分離的障礙在于難以令大的球蛋白通過12-15nm孔徑的排阻濾膜。如果要從高分子量產(chǎn)品中清除小的無包膜病毒時，這一問題特別突出。該過程的復(fù)雜性還在于，欲回收的蛋白類物質(zhì)例如免疫球蛋白會形成二聚體和三聚體，它們很難或根本就不能通過濾膜。孔徑越小，膜截留病毒顆粒的效果越好。然而，隨著孔徑的減小，膜允許除病毒產(chǎn)品自由通過的能力隨之下降。對所有的除病毒技術(shù)來說，每一種應(yīng)用都必須針對每一種產(chǎn)品和每一種病毒進(jìn)行評價。如果需要清除小的無包膜病毒，可能必須使用孔徑小于35nm，更好的是12-30nm之間的病毒濾膜，但這不能用于高分子量的產(chǎn)品或會形成二聚體和三聚體的產(chǎn)品。上述Roberts的文獻(xiàn)中描述了這一問題，其中談到，雖然標(biāo)稱截留值為70、160kD，孔徑15、35、40、50和70nm的濾膜可用于清除小病毒和朊病毒，但大分子量產(chǎn)品例如免疫球蛋白(IgG，150kD)和Ⅷ因子(350kD)只能通過孔徑更大的濾膜。本發(fā)明方法包括免疫球蛋白藥劑的過濾和病毒清除。為了防止新生兒溶血病，給母親注射人源Rho(D)免疫球蛋白。此類產(chǎn)品之一是RhoGAM，由本發(fā)明的受讓人出品，它防止未受免疫的Rho(D)陰性母親“來自”Rho(D)陽性嬰兒紅細(xì)胞上的Rho(D)抗原產(chǎn)生應(yīng)答，由此發(fā)揮其作用。這樣，通過防止母親產(chǎn)生抗Rho(D)抗體，避免了她的Rho(D)陽性嬰兒患新生兒溶血病。雖然，目前用Cohn醇分離法成功生產(chǎn)得這一產(chǎn)品，但數(shù)位研究者曾試圖用其他方法來生產(chǎn)類似產(chǎn)品，以期經(jīng)濟(jì)地獲得更優(yōu)良的產(chǎn)品，減少對血漿的大量需求。這樣的研究性努力可參見Hoppe等的報(bào)道“預(yù)防Rh免疫，用離子交換層析的生產(chǎn)靜脈注射用IgG-抗Rh改良法”，VoxSang，25308-316(1973)，以及Friesen等的“離子交換柱制備和靜脈注射用的Rh免疫球蛋白特性分析”，JounalofAppliedBiochemistry，3，164-175(1981)。德國的Hoppe和加拿大的Friesen都將DEAE-Sephadex層析柱與磷酸鹽緩沖洗脫液聯(lián)用。Hoppe的含抗D血漿來自通過了至少6個月HBAg試驗(yàn)室檢測的志愿者，血漿被臨時保存。所以，Hoppe使用了較安全的無感染血漿作為起始原料。然而，他沒有進(jìn)行其他檢測以測定DEAE-Sephadex去除乙肝表面抗原的效果。相反，Hoppe考慮的是去除凝聚體和分離抗體濃度較高的完整的、免疫電泳純IgG。Friesen所做的則是對Hoppe方法的改良，以開發(fā)出供加拿大使用的靜脈用RhIgG。和Hoppe一樣，F(xiàn)riesen對每一份Rh血漿進(jìn)行HBAG檢測以剔除陽性供體。Friesen使用AbbortLaboratories，NorthChicago，ILL的放射性免疫分析試劑盒(AusriaI試劑盒)。目前，該測試仍被認(rèn)為是最靈敏的試驗(yàn)之一，并被用于后文所述的本發(fā)明中。Friesen稱，臨床試驗(yàn)顯示，用DEAE-Sephadex樹脂/磷酸鹽緩沖液組合生產(chǎn)的物質(zhì)能夠有效而安全的防止Rh免疫。然而，F(xiàn)riesen的報(bào)道中沒有測定DEAE-Sephadex樹脂/磷酸鹽緩沖液組合清除血漿樣品中乙肝表面抗原的效果。至少從美國政府的角度來看，這是非常重要的，因?yàn)橛糜诤Y選供體血漿樣品的放射性免疫分析試驗(yàn)不能檢測出濃度再低兩三個數(shù)量級的HBAG顆粒，而這樣的濃度仍可能具有感染性。正是因?yàn)橛眠@種方法生產(chǎn)的制劑可能具有感染性，所以，美國政府在批準(zhǔn)用固相法生產(chǎn)的可注射免疫球蛋白產(chǎn)品時特別嚴(yán)格。RhoGAM(人)Rho(D)免疫球蛋白是第一個成功地預(yù)防性抑制抗體介導(dǎo)的免疫的特異性抗體。RhoGAM是一種IgG免疫球蛋白溶液，所含抗Rho(D)的劑量為每劑抗Rho(D)活性300微克?？稍诤线m的時候?qū)hoGAM給予未經(jīng)免疫的Rho(D)陰性孕婦，防止她的Rho(D)陽性后代患病。所述的疾病為新生兒溶血病，更具體的說是胎兒Rh成紅細(xì)胞增多癥。本發(fā)明受讓人還出售一種較低劑量的抗Rho(D)，MICRhoGAM(人)Rho(D)免疫球蛋白小劑型(50微克抗Rho(D))，治療妊娠12周或更早時流產(chǎn)的婦女。全劑量保護(hù)接受者抗高至15ml的Rho(D)陽性紅細(xì)胞，小劑量則提供抗高至2.5ml的Rho(D)陽性紅細(xì)胞的保護(hù)。RhoGAM被用于妊娠26至28周時的產(chǎn)前預(yù)防。其它適應(yīng)癥包括妊娠各階段的繼續(xù)妊娠的先兆性流產(chǎn)，在妊娠13周或之后發(fā)生的流產(chǎn)或妊娠終止，腹部創(chuàng)傷或基因羊膜穿刺，絨膜絨毛取樣(CVS)和經(jīng)皮臍帶血取樣(PUBS)。FDA和生物部批準(zhǔn)使用的多數(shù)免疫球蛋白類注射物質(zhì)目前是用哈佛大學(xué)E.Cohn博士40年代開發(fā)的醇分離法生產(chǎn)的，參見Cohn等，J.Am.Chem.Soc.68，459(1946)。與該方法聯(lián)用的是用目前最靈敏的檢測方法仔細(xì)挑選檢測肝炎感染性、HIV及其它血液攜帶病原呈陰性的血漿，該方法應(yīng)用的如此之久，以至于美國政府只承認(rèn)用該方法所得制劑是安全的。無數(shù)的產(chǎn)品接受者沒有被感染，這就可以證明該方法所得產(chǎn)品的確安全。有幾種從人血漿中分離γ球蛋白的常規(guī)方法值得注意Baumstark等，“從人血清中分離7Sγ球蛋白的制備方法”，ArchivesofBiochemistryandBiophysics，108，514-522(1964)和A.Webb“30分鐘從人血清中分離IgG的制備方法”，VoxSang，23279-290(1972)，本發(fā)明參考了以上兩篇文獻(xiàn)。雖然兩篇論文都更側(cè)重于從含多種其它污染性蛋白的血清中分離和挑選各種γ球蛋白，但也的確涉及從原血清樣品中清除污染性蛋白等物質(zhì)。它們都采用DEAE-Sephadex柱層析材料和磷酸鹽緩沖洗脫液。兩人在去除污染蛋白方面都獲得了一定程度的成功，然而都沒有涉及清除污染性肝炎病毒顆粒以提供安全的注射制劑。本發(fā)明的目的之一是提供清除了病毒的純注射免疫球蛋白。所述基本純的產(chǎn)品是用本發(fā)明方法制備的。本發(fā)明目的還在于提供純化免疫球蛋白的生產(chǎn)工藝，較好地滿足了時間、空間和蛋白質(zhì)得率方面的要求。本發(fā)明的過濾是通過篩-截留機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，該機(jī)制依賴于病毒與濾膜平均孔徑之間的相互關(guān)系。其效率不受溫度、離子強(qiáng)度、病毒效價、壓力、pH、表面張力及其它變量等過濾條件的影響。雖然，本發(fā)明的除垢劑和離子強(qiáng)度條件影響著IgG顆粒通過濾膜的能力，但它們不影響病毒的清除。為本發(fā)明受讓人進(jìn)行的研究顯示，就病毒的滅活和包膜去除而言，所用緩沖液組成對病毒顆粒的影響極小。發(fā)明概述本發(fā)明方法得到了基本純的免疫球蛋白。所述免疫球蛋白可以是單克隆或多克隆免疫球蛋白，例如單克隆或多克隆抗D免疫球蛋白，更具體的說是RhoGAM或MICRhoGAMI。本發(fā)明免疫球蛋白制劑含4.0-6.0重量％免疫球蛋白，約24-36ppm乙基汞硫代水楊酸鈉(Thimeroso1)和約80-200ppm聚山梨酸酯80。更好的是，本發(fā)明制劑含5.0重量％免疫球蛋白，約33ppm乙基汞硫代水楊酸鈉和約100ppm聚山梨酸酯80。本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種制造大的球蛋白的基本純制劑的方法，步驟包括(a)用醇分離人血漿；(b)重懸產(chǎn)生的沉淀Ⅱ；(c)將沉淀Ⅱ重懸Ⅱ液與含賦形劑的高離子強(qiáng)度緩沖液混合；和(d)進(jìn)行免疫球蛋白的超微過濾。所述醇可以是甲醇。高離子強(qiáng)度緩沖液可以是150mMNaCl-甘氨酸。所述賦形劑是非離子聚氧乙烯除垢劑，例如聚山梨酸酯80。超微過濾包括使用截留值低于約30nm，低于12nm更好的第一超微濾膜。過濾還可以包括使用截留值約10，000kD至約60，000kD，約50，000kD更好的第二超微濾膜，它去除甲醇，濃縮蛋白質(zhì)，并改變成最有利于產(chǎn)品穩(wěn)定性的緩沖液。所述緩沖液例如低離子強(qiáng)度緩沖液，例如50mMNaCl-甘氨酸緩沖液。本發(fā)明還設(shè)計(jì)了生產(chǎn)基本純抗D抗原的方法，步驟包括(a)重懸自人血漿中分離的沉淀Ⅱ；(b)將沉淀Ⅱ重懸液與加工助劑混合；(c)進(jìn)行免疫球蛋白的超微過濾。加工助劑包含高離子強(qiáng)度緩沖液和非離子賦形劑；高離子強(qiáng)度緩沖液包含150mMNaCl-甘氨酸緩沖液，非離子賦形劑包含聚山梨酸酯80。本發(fā)明方法還可以包括步驟(d)用截留值約50，000kD的超微濾膜濃縮免疫球蛋白。這一步驟還將高離子強(qiáng)度緩沖液改變成了低離子強(qiáng)度緩沖液，例如50mMNaCl-甘氨酸緩沖液。附圖簡述圖1是分離人血漿，獲得抗Rh球蛋白的流程圖。圖2是用于本發(fā)明除病毒過程的Viresolve/超濾系統(tǒng)圖。圖3A是為比較實(shí)施例3而安裝的Viresolve-180系統(tǒng)，其中包含低離子強(qiáng)度緩沖液和聚山梨酸酯80。圖3B是比較實(shí)施例3的通量變化部分關(guān)閉后重建的Viresolve-18C系統(tǒng)。圖4顯示比較實(shí)施例3的通量變化實(shí)驗(yàn)中，低離子強(qiáng)度緩沖液中免疫球蛋白G的篩選系數(shù)對通量圖。圖5顯示比較實(shí)施例3的體積減少實(shí)驗(yàn)中，低離子強(qiáng)度緩沖液中免疫球蛋白G的篩選系數(shù)對通量圖。本發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明將高離子強(qiáng)度(大致在生理學(xué)范圍)緩沖液與非離子賦形劑組合，作為減少或清除大生物分子中病毒的加工助劑。本發(fā)明許對例如免疫球蛋白的球蛋白分子使用小孔徑超微排阻濾膜，但不造成明顯的得率損失，也不顯著改變球蛋白亞型，凝聚水平或穩(wěn)定性。高離子強(qiáng)度緩沖液與賦形劑只作為加工助劑，可在處理后由超微過濾去除。本發(fā)明方法得到了基本無病毒的產(chǎn)品。用本發(fā)明方法(大小排阻法)清除病毒確保從產(chǎn)品中去除各類潛在病毒，包括有包膜的(例如HIV、乙肝病毒)和無包膜的(例如甲肝病毒、細(xì)小病毒B19)。本發(fā)明加工助劑的優(yōu)點(diǎn)在于(1)處理時間大大縮短的同時得率提高，因?yàn)榧庸ぶ鷦⑵胶庀蛐纬啥垠w、三聚體和凝聚體的反方向移動，提高了待處理的蛋白質(zhì)濃度；(2)允許使用能更好地確保清除無包膜小病毒的小孔徑濾膜；(3)通過濾膜的被處理免疫球蛋白未改變其亞型和穩(wěn)定性；以及(4)可以優(yōu)化處理設(shè)備和生產(chǎn)空間，從而得到的最高的單位面積產(chǎn)品得率。用本發(fā)明方法處理的大分子包括大的球蛋白，例如白蛋白、免疫球蛋白(例如IgG)及其片段，血液凝聚因子，例如Ⅷ、Ⅸ和Ⅺ因子，生長激素，載脂蛋白，酶(例如鏈激酶)，上述分子既可以是天然存在的也可以是基因工程獲得的。生產(chǎn)本發(fā)明基本純無病毒免疫球蛋白產(chǎn)品所用的超微過濾單元的孔徑小于約30nm，小于約15nm更好。然而，截留值足以減少或消除蛋白質(zhì)溶液中無包膜病毒的任何濾膜都可用于本發(fā)明的處理方法。例如，可使用Viresolve-180(MilliporeCorporation，Bedford，MA)單元，該單元分子量孔徑截留值小于180kD，或小于12nm。本發(fā)明方法還可使用目前用于過濾小重組蛋白、細(xì)胞因子和淋巴因子產(chǎn)品以及血液分離產(chǎn)品的70kD孔徑超微過濾單元。直接明使用非離子賦形劑作為超微過濾加工助劑具有新穎性。本發(fā)明的非離子賦形劑包括乙烯聚合物，聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物或共聚物(Pluronics)，多糖，蛋白質(zhì)，聚氧乙烯，丙烯酰胺聚合物及它們的衍生物或鹽。已知，聚氧乙烯包括聚乙二醇。用于本發(fā)明的乙烯聚合物可選自聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸，聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇。用于本發(fā)明的多糖可選自纖維素或纖維素衍生物，糖胺聚糖、瓊脂、果膠、藻酸、葡聚糖、淀粉和脫乙酰幾丁質(zhì)。糖胺聚糖可選自透明質(zhì)酸，軟骨素及相關(guān)分子。用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)選自明膠和纖連蛋白。雖然上述物質(zhì)中有些不能通過超微濾膜，但它們存在于濾膜截留液側(cè)就足以達(dá)到本發(fā)明的目的。纖維素衍生物可包括烷基纖維素和羥基烷基纖維素，例如甲基纖維素，羥乙基纖維素，羧甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素和羥丙基纖維素。本發(fā)明認(rèn)為對球蛋白超微過濾來說，最好的是離子型除垢劑，具有聚氧乙烯或糖頭基團(tuán)(headgroup)的非離子除垢劑，溶血磷脂，膽鹽，以及它們的混合物。特別好的是非離子聚氧乙烯除垢劑，例如聚山梨酸酯，Pluronics，Brij，Sterox-AJ，Tritons和Tweens。最好的是聚山梨酸酯80。處理方法之初，本發(fā)明非離子賦形劑在蛋白質(zhì)溶液的含量范圍約0.015-0.024g/L，最好是約0.02g/L或20ppm。處理過程中，這樣的賦形劑濃度已確定不會影響病毒的清除。非離子賦形劑中最好的是聚山梨酸酯80，用于處理時的最佳濃度是0.002％或20ppm。該范圍正是或低于聚山梨酸酯80的臨界膠體濃度。在確定本發(fā)明其它賦形劑的濃度時，可參照該賦形劑的臨界膠體濃度。在此所述的賦形劑用量是專門針對對抗D免疫球蛋白而言的，然而，上述用量也適用于其它IgG制劑，例如(人和馬)血清球蛋白和乙肝免疫球蛋白。產(chǎn)品中賦形劑的最終濃度可達(dá)約0.1-0.2％w/v；更好的是約80-200ppm；最好的是，約100ppm的聚山梨酸酯80。通常，對以相同劑量給予的所有IgG分子來說，賦形劑在最終產(chǎn)品中的含量是相同的。使用賦形劑的另一個優(yōu)點(diǎn)是它可在過濾過程中作為消泡助劑。本發(fā)明所用人血漿可用上文引用的Cohn等的方法(“Cohn法”)，用分批或柱交換層析，或用親合層析獲得。本發(fā)明方法中，沉淀Ⅱ(Cohn等的方法所產(chǎn)生)物質(zhì)被稀釋至約4.6-5.0mg/ml(約0.5％)，并且必須在以后通過超濾濃縮10倍，此間，使用低初濃的賦形劑是十分重要的；上述范圍內(nèi)，以約0.002％為佳的賦形劑濃度對方法沒有不利影響。以有包膜病毒為例所述的不利影響可能是病毒與其包膜解離，病毒顆粒進(jìn)入濾液。為本發(fā)明受讓人用水泡性口炎病毒(這是一種子彈形、有包膜、含RNA的病毒)所做的研究顯示，在本發(fā)明所用的賦形劑濃度(用于處理的5X溶液為100ppm或0.01％)，沒有發(fā)生明顯的病毒激活。本發(fā)明處理所用的蛋白質(zhì)濃度范圍約為0.1-1重量％。約1％的濃度可用于單體或單克隆的蛋白物質(zhì)。就本發(fā)明所用沉淀Ⅱ免疫球蛋白而言，用于處理的蛋白質(zhì)初始濃度約為4.6-5.0mg/ml(約0.45-0.5％)。本發(fā)明參考的Cohn的美國專利2，390，074公開了通過分離血液來制備γ球蛋白的方法。用Cohn法制得的γ球蛋白含有19S的球蛋白，纖溶酶原和脂質(zhì)。雖然該γ球蛋白特別適合預(yù)防例如麻疹和破傷風(fēng)等疾病，19S的球蛋白，纖溶酶原和脂質(zhì)卻是不需要的污染物，它們會降低γ球蛋白預(yù)防對胎兒紅細(xì)胞上Rh因子免疫應(yīng)答的效力。用有望獲準(zhǔn)的本發(fā)明方法制備的基本純抗Rh球蛋白是從人血漿制備的，人血漿中含白蛋白，纖溶酶原，α、β和γ球蛋白，以及多種脂質(zhì)。特別需要指出的是，本發(fā)明的抗Rh球蛋白是γ球蛋白。根據(jù)本發(fā)明參考的已經(jīng)被普通轉(zhuǎn)讓的Pollack等的美國專利3，449，314，分離人血漿制備抗Rh球蛋白。參照附圖1的流程圖，該方法分離人血漿的能力依賴于各種血漿成分的溶解度。在分離的各階段，組分的分離與最終去除不希望留在抗Rh球蛋白中的各成分取決于對系統(tǒng)pH、溫度、沉淀劑濃度和離子強(qiáng)度的嚴(yán)格控制。血漿分離中使用了多種低介電常數(shù)有機(jī)溶劑，例如酮和醇，它們會使蛋白質(zhì)沉淀。本發(fā)明方法所用有機(jī)溶劑包括各種醇和酮，優(yōu)選的是甲醇。優(yōu)選甲醇是因?yàn)榕c其它有機(jī)溶劑相比，它毒性較低，處理起來較安全(例如，爆炸危險(xiǎn)性小)。為了避免蛋白質(zhì)在分離中變性，沉淀在低溫下進(jìn)行。由于蛋白質(zhì)的溶解度是溫度依賴性的，為了避免變性，每步分離所選溫度必須是達(dá)到所需分離目的的最低溫度。參照附圖1的流程圖，分離從人全血漿開始。將血漿冷卻至約1℃，離心，將低溫下不溶的沉淀與上清液分離。進(jìn)一步分離上清液，得到沉淀Ⅰ和上清液Ⅰ。丟棄主要含纖維蛋白原的沉淀Ⅰ。進(jìn)一步分離上清液Ⅰ，得到上清液Ⅱ+Ⅲ和沉淀Ⅱ+Ⅲ。丟棄上清液Ⅱ+Ⅲ，其中含α和β球蛋白以及脂質(zhì)。沉淀Ⅱ+Ⅲ主要是β和γ球蛋白以及同種凝集素，但也含凝血酶原、纖溶酶原、膽固醇和其它脂質(zhì)。沉淀Ⅱ+Ⅲ經(jīng)進(jìn)一步分離，得上清液Ⅱ+ⅢW和沉淀Ⅱ+ⅢW。β球蛋白、膽固醇和其它脂質(zhì)被基本清除到丟棄的上清液Ⅱ+ⅢW中。沉淀Ⅱ+ⅢW主要是γ球蛋白、同種凝集素、纖溶酶原和凝血酶原，以及部分β球蛋白、膽固醇和其它脂質(zhì)。進(jìn)一步分離沉淀Ⅱ+ⅢW得到上清液Ⅲ和沉淀Ⅲ。丟棄的沉淀Ⅲ含同種凝集素，纖溶酶原與凝血酶原。上清液Ⅲ主要是γ球蛋白和微量纖維蛋白原及脂質(zhì)。分離最后得到沉淀Ⅱ，它主要是純γ球蛋白，幾乎完全沒有19S球蛋白、纖溶酶原和脂質(zhì)。本發(fā)明方法制備的沉淀Ⅱ是抗Rhγ球蛋白。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例中，重懸的免疫球蛋白起始材料是改良Cohn法制得的沉淀Ⅱ漿料。如果在本發(fā)明所考慮的賦形劑存在下冷凍干燥蛋白質(zhì)，則可以使用經(jīng)冷凍干燥的沉淀Ⅱ漿料。本發(fā)明用來重懸沉淀Ⅱ漿料的稀釋液包括藥學(xué)上認(rèn)可的稀釋劑，選自注射用水，U.S.P.(“W.F.I.”)，普通生理鹽水U.S.P.，或各種合適的緩沖液，緩沖液的優(yōu)點(diǎn)在于可提供穩(wěn)定的pH。合適的緩沖液選自pH約為6.4的磷酸鹽緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液，硼酸鹽緩沖液，乙酸鹽緩沖液和甘氨酸緩沖液。較好的是，最初的稀釋劑是重量為漿料3倍的W.F.I然后經(jīng)高離子強(qiáng)度緩沖液稀釋后再進(jìn)行第一次超微過濾。本發(fā)明采用的高離子強(qiáng)度緩沖液也適合作為最初的稀釋劑。采用的離子強(qiáng)度宜為150mM+/-20％，較好的是150mM+/-20％NaCl甘氨酸緩沖液；pH6.4。在本發(fā)明處理和過濾免疫球蛋白的過程中，宜用高離子強(qiáng)度緩沖液作為加工助劑減少免疫球蛋白二聚體和三聚體的形成，從而使球蛋白更充分地通過濾膜。合適的高離子強(qiáng)度稀釋劑即前文所述的重懸稀釋劑，但離子強(qiáng)度更高，pH約為6.4。較好的是，所述加工助劑的離子強(qiáng)度約為最佳的150mM+/-20％，這接近生理離子強(qiáng)度。在本發(fā)明的最佳實(shí)施例中，高離子強(qiáng)度加工助劑是150mMNaCl甘氨酸緩沖液，pH6.4。在處理本發(fā)明免疫球蛋白時，在過濾步驟開始時可將非離子賦形劑與高離子強(qiáng)度緩沖液混合。這可參照制備含聚山梨酸酯80的高離子強(qiáng)度緩沖液的實(shí)施例2A和3A。本發(fā)明的加工助劑可根據(jù)其它組分相對調(diào)節(jié)，這樣，當(dāng)聚山梨酸酯80濃度升高時，可減少離子強(qiáng)度組分。可在本發(fā)明處理方法所得的藥物產(chǎn)品中使用防腐劑。較好的是藥學(xué)上認(rèn)可的防腐劑，例如乙基汞硫代水楊酸鈉和疊氮鈉，前者的使用濃度可以是26-36ppm，本發(fā)明中是33ppm(0.003％)。然而，在一次性胃腸外給藥的本發(fā)明免疫球蛋白制劑，尤其是RhoGAM和MICRhoGAM制劑中，不必使用防腐劑。在本發(fā)明用小孔徑第二超微濾膜濃縮蛋白質(zhì)并清除有機(jī)溶劑的步驟中，高離子強(qiáng)度緩沖液可能被轉(zhuǎn)換成較低的離子強(qiáng)度，例如50mM的緩沖液，所述濾膜的截留值約10，000-60，000K，例如Biomax-50(截留值50，000K)濾膜(MilliporeCorporation，Bedford，MA)。這一蛋白質(zhì)濃縮步驟濃縮了蛋白質(zhì)產(chǎn)品，同時去除了部分賦形劑和有機(jī)溶劑。在用Viresolve-180膜系統(tǒng)進(jìn)行過濾時，跨膜壓力以約＞0-3.0psi為宜，最好低于約1.5psi.。篩分系數(shù)以高于約60％為佳。本發(fā)明的處理可在環(huán)境溫度下進(jìn)行。低溫下進(jìn)行處理一般會延長過濾時間，因?yàn)檫@樣的溫度(例如16-17℃)通常會增加粘度。處理過程中的產(chǎn)品溫度可以是約0℃或略高于45℃，更好的是約15-30℃，最好的是約20-25℃。本文中以下用語的意義如下所述橫流流速溶液流經(jīng)濾膜表面的流速，ml/min透過液通過濾膜的純化產(chǎn)品截留液被濾膜截留的物質(zhì)通量透過液流速/面積換算比透過液流速/橫流流速篩分系數(shù)透過液中蛋白質(zhì)濃度/截留液中蛋白質(zhì)濃度在本發(fā)明實(shí)施例之一中，參照附圖2，如下進(jìn)行生產(chǎn)規(guī)模的處理，以得到基本純(清除了病毒)的免疫球蛋白，例如RhoGAM用Cohn純化法(Cohn等，J.Am.Chem.SocVol.68，p.459-475)，但將乙醇換成甲醇，將Rho(D)免疫球蛋白純化成“沉淀Ⅱ漿料”，重懸在注射用水(WFI)U.S.P.中，冷卻至2-8℃。用以下公式計(jì)算WFI體積沉淀Ⅱ重量(kg)×3L/kg=所需WFI體積(L)每kg沉淀漿料重懸在3LWFL中。混合物在維持罐-產(chǎn)品(1)中渦流攪拌(無泡沫)3-8小時，使用前保存于4℃。對除病毒系統(tǒng)進(jìn)行就地蒸汽消毒(SIP)，所述系統(tǒng)包括安裝在除病毒濾膜夾具中的ViresolveCIP/SIP模塊(MilliporeCorporation，Bedford，MA)(2)和裝在超濾膜夾具上的PelliconCIP/SIP模塊(MilliporeCorporation，Bedford，MA)(3)。還對系統(tǒng)和50mMNaCl-甘氨酸緩沖液儲罐(4)進(jìn)行CIP/SIP。就地清洗(CIP)過程是一種無需拆卸零部件的設(shè)備清洗過程。對設(shè)備的要求是所有管道都是不銹鋼的，斜度和排布合理，墊圈盡可能少。CIP的目的是免除手工清洗和避免批次間的交叉污染。可對該過程進(jìn)行檢驗(yàn)。清洗要素包括時間，溫度，化學(xué)和機(jī)械參數(shù)。處理后殘留物的類型將決定CIP所用的清洗劑。制藥業(yè)的一般技術(shù)人員都熟悉CIP的過程和要求。SIP之后，ViresolveCIP/SIP模塊(2)換裝成用于40L沉淀Ⅱ重懸液的20疊Viresolve-180R模塊。(10疊Viresolve-180濾膜可用于10-16L最終產(chǎn)品，20疊可用于＞16-40L最終產(chǎn)品)。PelliconCIP/SIP模塊(3)換裝成4個Biomax-50濾框(MilliporeCorporation，Bedford，MA)。2個Biomax-50濾框可用于10-16L沉淀Ⅱ重懸液，4個Biomax-50濾框可用于＞16-40L沉淀Ⅱ重懸液。Viresolve-180模塊用氯消毒并清洗，直至二乙基苯二胺(DPD)測定的氯含量≤0.3ppm。消毒后對模塊(2)進(jìn)行穩(wěn)壓測試。模塊必須至少能承受10psi壓力，并且，所需5分鐘測試后的壓降≤1psi。用WFIU.S.P沖洗Biomax-50濾膜。對最后透過的沖洗樣品進(jìn)行苯扎氯銨(Roccal)測定；苯扎氯銨含量必須≤10ppm。對Biomax-50濾框進(jìn)行擴(kuò)散測試；如下計(jì)算釋放速度釋放體積(cc)÷時間(min)÷濾框數(shù)=釋放速度(cc/min/濾框)釋放速度必須≤18cc/min/濾框。用Viresolve-180(2)對50mMNaCl甘氨酸緩沖液進(jìn)行除病毒超濾。在除病毒循環(huán)罐(T-1)(5)中加入50mMNaCl甘氨酸緩沖液。加入的最大體積是250L，最小是130L。緩沖液在T-1(5)中循環(huán)，同時將緩沖液透過液收集在一離線罐中。在除病毒循環(huán)罐(T-1)(5)中加入至少60L的150mMNaCl甘氨酸緩沖液，用于洗罐和洗膜。如下處理沉淀Ⅱ重懸液。以形成渦流但不發(fā)泡的速度攪拌沉淀Ⅱ15-30分鐘，直到完全懸浮。用手持突眼計(jì)測定沉淀Ⅱ懸浮液的折光率蛋白質(zhì)百分濃度(mg/ml蛋白)。為達(dá)到5.0mg/ml蛋白質(zhì)濃度所需的沉淀Ⅱ稀釋液最終體積用以下公式計(jì)算所需150mMNaCl甘氨酸緩沖液體積用以下公式計(jì)算所需沉淀Ⅱ稀釋液體積(L)-沉淀Ⅱ懸浮液體積(L)=加入緩沖液體積(L)加緩沖液是為了稀釋沉淀Ⅱ，以形成渦流但不發(fā)泡的速度攪拌混合至少30分鐘。下一步處理之前，混合物在15-30℃最多保存2.5小時。將沉淀Ⅱ稀釋液分批加入除病毒循環(huán)罐T-1(5)進(jìn)行超濾。TMP設(shè)定值約為3.0。然而，它可能會升高。如果達(dá)到了約12，濾膜可能被極化，應(yīng)允許截留液在濾膜上流洗(透過液減少)。如下計(jì)算Viresolve液位設(shè)定值如果以上結(jié)果小于50，則以50作為Viresolve液位設(shè)定值。將1/3總體積圓整到最接近的整數(shù)(L)。如下計(jì)算超濾濃縮終點(diǎn)如果以上結(jié)果小于20，則以20作為濃縮終點(diǎn)。如下計(jì)算超濾滲濾終點(diǎn)濃縮終點(diǎn)-3=滲濾終點(diǎn)滲濾膜總設(shè)定值的計(jì)算如下濃縮終點(diǎn)×5.5=滲濾膜總設(shè)定值(L)超濾/濃縮過程開始時，Viresolve-180進(jìn)料泵(P1)的速度調(diào)節(jié)為對應(yīng)于20疊濾膜的75-83％，或?qū)?yīng)于10疊濾膜的37-42％?？刂芓MP；則TMP由滲透泵(P2)速度來控制；如果跨膜壓力達(dá)到3，則降低泵速。將Viresolve滲透泵(P2)(8)的速度緩慢升高到18％，若用10疊濾膜則升高到9％。調(diào)高P2后，則截留壓(PT3)穩(wěn)定在≥5.0psi。TMP達(dá)到平衡后，將泵速設(shè)定在對應(yīng)于10疊濾膜的9-11％和對應(yīng)于20疊濾膜的18-23％。然而，不控制TMP壓力，則該壓力最好較低，例如低于3.0psi，否則，濾膜會極化。如果TMP升高，例如接近12psi，可以停止?jié)B透，使得截留液在濾膜上流洗。UV值(UV1)(9)必須介于下限4.0A.U.與上限7.7A.U.之間。透過液流速(FT1)介于下限0.81L/min(LPM)與上限0.98L/min(LPM)之間；若為10疊濾膜，則介于0.40-0.49LPM之間。處理溫度保持在約15-30℃。在除病毒/超濾過程中，對以上條件進(jìn)行全程監(jiān)控。UV值(UV1)(9)介于下限6.4A.U.與上限7.7A.U.之間。篩分系數(shù)應(yīng)≥約75％。當(dāng)T-2(6)的體積達(dá)到約75-100L時，建立Pellicon系統(tǒng)(3)，開始混合。啟動/調(diào)高UF進(jìn)料泵(P5)(10)，由泵速控制UF滲透流速。UF進(jìn)料壓(PT4)和UF截留壓(PT5)保持為UF進(jìn)料壓≤30psiUF截留壓≤10psi保持進(jìn)料壓和截留壓之間的壓差≤20psi。進(jìn)料壓(psi)-截留壓(psi)=壓差(psi)進(jìn)料罐T-1(5)內(nèi)沉淀Ⅱ稀釋液的體積水平由T-1上的測壓元件監(jiān)測(通過重量)并做出響應(yīng)。在T-1(5)中進(jìn)行恒容滲濾。這次滲濾使得殘留的蛋白質(zhì)通過系統(tǒng)和Viresolve-180濾膜，從而提高得率。進(jìn)行3次150mMNaCl-甘氨酸緩沖液滲濾；加入固定量的緩沖液，加入速度與其通過Viresolve-180滲透去除時的相同。滲濾完成后，如前所述，用氯消毒T-1(5)和Viresolve-180模塊(2)，確保任何滯留的病毒被滅活。在T-2(6)內(nèi)用無病毒50mMNaCl-甘氨酸緩沖液進(jìn)行的恒容滲濾濃縮其中的內(nèi)含物。這一步驟濃縮了產(chǎn)品，并將高離子強(qiáng)度緩沖液濃度轉(zhuǎn)變成了低離子強(qiáng)度緩沖液濃度，去除了Cohn過程中的甲醇以及約一半的聚山梨酸酯80。滲濾完成后，記錄T-2(6)中的液位(L)。從T-2(6)中取樣，進(jìn)行UF透過液樣品的數(shù)字比電導(dǎo)測定。結(jié)果必須落于4.95-5.67×10-3mhos/cm范圍內(nèi)。如果第一次測試不滿足以上要求，必須繼續(xù)恒容滲濾，直到測試結(jié)果落于上述范圍內(nèi)。5.5X滲濾后T-2液位必須≤95％沉淀Ⅱ重懸液體積。如果T-2液位高于95％沉淀Ⅱ重懸液體積，繼續(xù)濃縮，直到T-2內(nèi)體積達(dá)到上述體積要求。達(dá)到上述體積水平后，關(guān)閉UF滲濾(11)，環(huán)流混合內(nèi)含物，無菌取樣10.5ml(12)。用手持式突眼計(jì)測定0.5ml樣品中的蛋白質(zhì)含量。如果蛋白質(zhì)濃度低于5.5％，必須進(jìn)一步濃縮樣品，直至達(dá)到上述最低百分比。將內(nèi)含物排放到一個臨時容器中，用以下公式通過重力計(jì)算內(nèi)含物的重量臨時罐的裝滿重量(kg)-臨時罐的自重(kg)=T-2內(nèi)產(chǎn)品重量(kg)用以下公式確定達(dá)到最終產(chǎn)品體積所需加入的50mMNaCl-甘氨酸緩沖液體積，可調(diào)節(jié)產(chǎn)品量需加入的50mMNaCl-甘氨酸緩沖液體積是如此計(jì)算的所需最終體積(L)-T-2內(nèi)的產(chǎn)品總體積(L)=需加入的50mMNaCl-甘氨酸緩沖液體積(L)用剩余樣品測定最初pH，先用0.9％NaCl以1∶10稀釋小份樣品，然后用0.5NHCl或0.5NNaOH的1∶100稀釋液滴定到pH6.3-6.4。如果需要調(diào)整，如下計(jì)算調(diào)整產(chǎn)品pH所需未稀釋0.5N試劑的量所需最終體積(L)-1∶100的滴定劑需量(ml)=未稀釋0.5N試劑的量(ml)用已認(rèn)可的方法檢測Viresolve-180濾膜模塊的完整性。完整性測定值必須不低于1.2，必須如前所述對模塊進(jìn)行氯消毒和清洗。將由上述公式算得的未稀釋0.5N試劑與可能需要100X乙基汞硫代水楊酸鈉溶液加入產(chǎn)品。如下計(jì)算可能需要加入的乙基汞硫代水楊酸鈉溶液的量根據(jù)以下公式計(jì)算加入產(chǎn)品的50mMNaCl-甘氨酸緩沖液罐2的液位(L)+50mMNaCl-甘氨酸緩=最終所需產(chǎn)品體積沖液所需體積(L)的罐2液位(L)達(dá)到所需的最終體積后，用泵將產(chǎn)品返回到T-2中，在T-2中繼續(xù)混合10-60分鐘，然后無菌取樣10.5ml產(chǎn)品，測定pH。pH應(yīng)是6.3-6.4。如果pH不在該范圍內(nèi)，必須如前所述稀釋樣品并滴定，直到達(dá)到認(rèn)可的pH，應(yīng)如前所述計(jì)算非稀釋0.5N試劑的需量，并在混合時加還到產(chǎn)品中。如前所述，用手持式突眼計(jì)，通過折光率測定蛋白質(zhì)含量。如果蛋白質(zhì)含量≥可接受的5.0％，則產(chǎn)品可進(jìn)入下一步驟。如果蛋白質(zhì)濃度低于可接受的百分比，則產(chǎn)品報(bào)廢?？捎?.2μ的Optiseal濾膜(13)過濾產(chǎn)品，過濾過程中的壓力不超過15psi，然后對產(chǎn)品進(jìn)行微生物學(xué)和血清學(xué)測定。對除病毒系統(tǒng)進(jìn)行包括使用WFI和蒸汽的就地清洗過程(前文所述CIP)。表1列出了可接受的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。表1<tablesid="table1"num="001"><table>特征要求蛋白質(zhì)4.0-6.0％pH6.3-6.4乙基汞硫代水楊酸鈉24-36ppm聚山梨酸酯8080-200ppm甲醇＜50ppm</table></tables>本發(fā)明制劑的給藥方式?jīng)Q定了化合物將到達(dá)的生物體內(nèi)的部位和/或細(xì)胞。本發(fā)明化合物可以單用，但通常與根據(jù)所需給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)制藥實(shí)踐所選的藥用載體或稀釋劑混合使用。例如，制劑可胃腸外注射，動脈注射或靜脈注射。制劑也可以通過口腔、皮下或肌內(nèi)途徑傳遞。就胃腸外給藥而言，化合物可以無菌水溶液的形式使用，溶液中還可以包含其它溶質(zhì)，例如另溶液具有等滲性的足夠的鹽或葡萄糖。就經(jīng)口給藥而言，本發(fā)明的EPO組合物可以片劑、膠囊、錠劑、粉劑、糖漿、酒劑、水溶液和懸浮液等形式使用。如果是片劑，可用載體包括乳糖、檸檬酸鈉和磷酸鹽。片劑中常使用諸如淀粉等崩解劑和諸如硬脂酸鎂等潤滑劑。如果以膠囊形式給藥，可用的吸收劑是乳糖和高分子量的聚乙二醇。在要求口服水溶液時，可加入某些甜味劑和/或賦味劑。本發(fā)明的基本純免疫球蛋白可給予包括人在內(nèi)的哺乳動物等對象。就治療中的給藥而言，開具處方的醫(yī)師將最終決定對特定人或動物對象合適的劑量，這可能隨個體的體重、年齡、反應(yīng)以及癥狀的特性和嚴(yán)重程度而不同。就本發(fā)明基本純的抗D免疫球蛋白而言，每劑的劑量為300μgRhoGAM和約50μgMICRhoGAM，兩藥的給予都遵照前文及相關(guān)產(chǎn)品說明中的指導(dǎo)，并用于其中所述的目的。上述產(chǎn)品也都可以多次給藥，以達(dá)到主治醫(yī)生所確定的總傳遞量。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，而不是限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1通過以下超濾方法生產(chǎn)無病毒的RhoGAM。用改良的Cohn純化法(見前文)將Rho(D)免疫球蛋白3.250kg純化至“沉淀Ⅱ”，將其重懸在9.750L注射用水(WFI)U.S.P.中，冷卻至5℃。混合物渦流攪拌(不發(fā)泡)4小時，使用前保存于4℃。沉淀Ⅱ重懸液的重量為3.250kg。SIP后，安裝適合約13.0L沉淀Ⅱ重懸液的Viresolve-180R模塊(MilliporeCorporation)(10疊)。PelliconCIP/SIP模塊換裝為2個Biomax-50濾框。Viresolve-180R模塊用氯消毒并洗滌。用WFIU.S.P沖洗Biomax-50濾框。測定最后透過的沖洗樣品的苯扎氯銨(Roccal)；苯扎氯銨濃度為6ppm。對Biomax-50濾框進(jìn)行擴(kuò)散測試；如前所述計(jì)算釋放速度；5分鐘內(nèi)的總釋放體積是2ml，實(shí)際釋放速度是0.4cc/min。用Viresolve-180以190.0L50mMNaCl-甘氨酸緩沖液進(jìn)行除病毒超濾。在除病毒循環(huán)罐(T-1)中加入50mMNaCl-甘氨酸緩沖液100L。緩沖液在T-1中循環(huán)，同時將緩沖液透過液收集在一個預(yù)先消毒過的50mMNaCl-甘氨酸緩沖液儲罐中。21.7℃時收集到的透過緩沖液體積是123.3L，收集進(jìn)行50分鐘。除病毒后的緩沖液保存在約25℃的環(huán)境溫度下。將緩沖液進(jìn)料罐與除病毒循環(huán)罐(T-1)連接，用150mMNaCl-甘氨酸緩沖液(參見實(shí)施例2A)沖洗。在T-1中加入60L150mMNaCl-甘氨酸緩沖液進(jìn)行沖洗。如下處理沉淀Ⅱ重懸液。攪拌沉淀Ⅱ(3250g)20分鐘，直到完全懸浮，攪拌速度形成渦流但不發(fā)泡。用手持式突眼計(jì)，通過折射率(mg/ml蛋白質(zhì))測定沉淀Ⅱ重懸液的蛋白質(zhì)含量，結(jié)果為49mg/ml(約5.0％蛋白質(zhì))。計(jì)算使得蛋白質(zhì)濃度為5.0mg/ml所需的沉淀Ⅱ稀釋液體積，用以下公式計(jì)算所需含20ppm聚山梨酸酯80的150mMNaCl-甘氨酸緩沖液的體積所需沉淀Ⅱ稀釋液體積(L)-沉淀Ⅱ重懸液體積(L)=加入緩沖液體積(L)或(127.4L)-(13.0L)=114.4L加入的緩沖液將114.4L緩沖液加入13L沉淀Ⅱ稀釋液中混合，混合速度足以形成渦流但不發(fā)泡，混合45分鐘。在除病毒循環(huán)罐中加入100.0L沉淀Ⅱ稀釋液。啟動除病毒循環(huán)罐(1號泵)，若用10疊的Viresove-180模塊，則進(jìn)料泵的速度為40％。若是10疊的模塊，將除病毒滲透泵(2號泵)的速度調(diào)至0.450LPM(10.0％)，以保持最初跨膜壓力低于1.6psi.。實(shí)際壓力保持在1.6psi.。調(diào)整產(chǎn)品泵(3號泵)速度至控制水平。在處理全過程中，通過監(jiān)測除病毒罐截留側(cè)的蛋白質(zhì)濃度保持TMP不超過3.0psi.。觀察在線UV監(jiān)測器，將吸光度保持在對應(yīng)于4.5-5.5mg/ml的蛋白質(zhì)濃度的6.4-7.7單位。在約75L透過液從除病毒罐進(jìn)入超濾罐(UF)后，啟動超濾進(jìn)料泵(5號泵)，速度為10％。調(diào)高泵速(至30％)，直到UF透過液流速等于除病毒透過液的流速，然后設(shè)定在25％以保持恒定體積。UF透過液流速為0.4LPM，VC透過液流速為0.460LPM。保持UF罐內(nèi)體積恒定在75.3L。UF進(jìn)料壓力為5.4psiUF滲透壓力為0.2psiUF截留壓力為0.3psi。當(dāng)T-1內(nèi)含物降到15-20L后，進(jìn)行恒容滲濾。用150mMNaCl-甘氨酸緩沖液(總體積約60L)至少交換3次以維持滲濾。滲濾完成后，關(guān)閉除病毒罐的泵和攪拌器。保持VC循環(huán)罐內(nèi)體積恒定在16.2L。交換緩沖液總體積為49L。自UF泵啟動開始，完成除病毒滲濾約需4小時。對T-2內(nèi)的產(chǎn)品進(jìn)行循環(huán)，用清除了病毒的50mMNaCl-甘氨酸緩沖液(無聚山梨酸酯80)進(jìn)行恒容滲濾濃縮。將產(chǎn)品濃縮到接近初始沉淀II重懸液體積。將透過液閥完全打開，UF泵速為65％；通過給截留回路(loop)施加背壓(backpressure)保持進(jìn)料壓力低于30psi，保持壓力差為14-17psi。將UF體積維持在20L，交換緩沖液總體積為110L。從T-2中取樣，測定UF透過液樣品的數(shù)字比電導(dǎo)。結(jié)果為5.29×10-3mho/cm。達(dá)到體積液位后，關(guān)閉UF滲透，循環(huán)混合產(chǎn)品，無菌取樣10.5ml。取0.5ml樣品，用手持式突眼計(jì)通過折射率測定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)濃度為4.8％。要達(dá)到5％蛋白質(zhì)含量所需的最終產(chǎn)品體積計(jì)算如下進(jìn)一步濃縮產(chǎn)品至11.424L的最終體積，以達(dá)到5％的蛋白質(zhì)濃度要求。用剩余樣品測定最初pH，先將樣品用0.9％NaCl稀釋10倍，然后用0.5NHCl或0.5NNaOH的100倍稀釋液滴定至pH6.3-6.4。pH為6.58。為了校正pH，加入1.8ml滴定液即以0.9％NaCl配制的0.5NHCl溶液，最終的pH為6.31。如果需要校正，如下計(jì)算校正pH所需非稀釋0.5N試劑的量所需最終體積(L)-所需100倍稀釋的滴定液體積(ml)=非稀釋0.5N試劑體積(ml)或，在本實(shí)施例中，11.424L×1.8ml=20.563ml非稀釋0.5N試劑根據(jù)已知方法測試Viresolve-180濾膜模塊的完整性。完整性測試值必須大于1.2，模塊必須如前所述用氯消毒并清洗。計(jì)算所需100X乙基汞硫代水楊酸鈉溶液的體積不斷混合產(chǎn)品，同時加入99.7ml的100倍乙基汞硫代水楊酸鈉溶液。用0.70L清除了病毒的50mMNaCl-甘氨酸緩沖液將產(chǎn)品調(diào)節(jié)到所需的最終體積，混合10分鐘。無菌取樣10.5ml產(chǎn)品測定pH。pH應(yīng)是6.3-6.4。實(shí)際pH是6.54。因?yàn)閜H不在上述范圍內(nèi)，所以稀釋樣品并滴定到可接受的pH，計(jì)算所需非稀釋0.5N試劑的量，返還到產(chǎn)品中混合。11.9L×1.7ml=20.2ml所需最終體積(L)×1.7ml所需稀釋液100倍稀釋所需非稀釋0.5N試劑液體積的體積(ml)用改良的Cohn純化法將Rho(D)免疫球蛋白6.802kg純化至“沉淀Ⅱ漿料”，重懸在20.406L注射用水(WFI)U.S.P.中，冷卻至4℃。渦流攪拌(不發(fā)泡)混合物4小時，使用前保存于4℃。SIP后，安裝用于27.208L沉淀Ⅱ重懸液的Viresolve-180R模塊(MilliporeCorporation)(20疊)。PelliconCIP/SIP模塊換裝為2個Biomax-50濾框。Viresolve-180R模塊用氯消毒并洗滌。用WFIU.S.P沖洗Biomax-50濾框。測定最后透過的沖洗樣品的苯扎氯銨(Roccal)；苯扎氯銨濃度為8ppm。對Biomax-50濾框進(jìn)行擴(kuò)散測試；如前所述計(jì)算釋放速度；5分鐘內(nèi)的總釋放體積是22cc，實(shí)際釋放速度是4.4cc/min。用Viresolve-180以245L50mMNaCl-甘氨酸緩沖液進(jìn)行除病毒超濾。在除病毒循環(huán)罐(T-1)中加入245L50mMNaCl-甘氨酸緩沖液。緩沖液在T-1中循環(huán)，同時將緩沖液透過液收集在一個預(yù)先消毒過的50mMNaCl-甘氨酸緩沖液離線儲罐中。收集到的透過緩沖液體積是213L。除病毒后的緩沖液保存在約63-78F的環(huán)境溫度下。將緩沖液罐與除病毒循環(huán)罐(T-1)連接，用150mMNaCl-甘氨酸緩沖液(參見實(shí)施例2)沖洗。在T-1中加入60L150mMNaCl-甘氨酸緩沖液進(jìn)行沖洗。如下處理沉淀Ⅱ重懸液。攪拌沉淀Ⅱ(6.802kg)55分鐘，直到完全懸浮，攪拌速度形成渦流但不發(fā)泡。用手持式突眼計(jì)，通過折射率(mg/ml蛋白質(zhì))測定沉淀Ⅱ重懸液的蛋白質(zhì)含量，結(jié)果為59mg/ml。計(jì)算所需沉淀Ⅱ稀釋液體積，使得蛋白質(zhì)濃度為5.0mg/ml用以下公式計(jì)算所需150mMNaCl-甘氨酸緩沖液體積所需沉淀Ⅱ稀釋液體積(L)-沉淀Ⅱ重懸液體積(L)=加入緩沖液體積(L)或(321.054L)-(27.208L)=293.846L加入緩沖液蛋白質(zhì)濃度約為5.9％。將293.846L緩沖液加入27.208L沉淀Ⅱ稀釋液中混合，混合速度足以形成渦流但不發(fā)泡，混合30分鐘。在除病毒循環(huán)罐中加入107L沉淀Ⅱ稀釋液。啟動除病毒循環(huán)罐(1號泵)，對于20疊的Viresove-180模塊，進(jìn)料泵的速度為80％。對于20疊的模塊，將除病毒滲透泵(2號泵)的速度調(diào)至0.91LPM(20％)，以保持初始跨膜壓力(TMP)低于1.6psi.。實(shí)際壓力保持在1.2psi.。調(diào)整產(chǎn)品泵(3號泵)至控制水平。在處理全過程中，通過監(jiān)測除病毒罐截留側(cè)的蛋白質(zhì)濃度保持TMP低于3.0psi.。觀察在線UV監(jiān)測器，將吸光度單位保持在對應(yīng)于4.5-5.5mg/ml的蛋白質(zhì)濃度的6.4-7.7。在約75L透過液從除病毒罐進(jìn)入超濾罐(UF)后，啟動超濾泵(5號泵)，速度為10％。調(diào)高泵速(至25％)，直到UF透過液流速等于除病毒透過液的流速，然后設(shè)定在25％以保持體積恒定。UF透過液流速為0.91LPM，VC透過液流速為0.91LPM。保持UF罐內(nèi)體積恒定在152L。UF進(jìn)料壓力為4.0psiUF滲透壓力為0.1psiUF截留壓力為0.7psi。當(dāng)T-1內(nèi)含物到15-20L后，進(jìn)行恒容滲濾。用150mMNaCl-甘氨酸緩沖液(總體積約60L)至少交換3次以維持滲濾。滲濾完成后，關(guān)閉除病毒罐的泵和攪拌器。保持VC循環(huán)罐內(nèi)體積恒定在15L。交換緩沖液的總體積為45L。對T-2內(nèi)的產(chǎn)品進(jìn)行循環(huán)，用清除了病毒的50mMNaCl-甘氨酸緩沖液進(jìn)行恒容滲濾濃縮。將產(chǎn)品濃縮到接近初始沉淀Ⅱ重懸液體積。將透過液閥完全打開，UF泵速為70％；通過給截留回路(loop)施加背壓(backpressure)保持進(jìn)料壓力低于30psi，保持壓力差為14-17psi。將UF體積維持在22L，交換緩沖液總體積為121.2L。從T-2中取樣，測定UF透過液樣品的數(shù)字比電導(dǎo)。結(jié)果為5.47×10-3mho/cm。達(dá)到體積液位后，關(guān)閉UF滲透，循環(huán)混合產(chǎn)品，無菌取樣10.5ml。取0.5ml樣品，用手持式突眼計(jì)通過折射率測定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)含量為7.9％。將產(chǎn)品從T-2轉(zhuǎn)移到臨時罐中，測定容器的總重量(毛重)。將產(chǎn)品返回到T-2，稱量空的臨時罐重量毛重(kg)-空罐重量(kg)=產(chǎn)品重量(kg)或58.180kg-25.24kg=32.94kg產(chǎn)品要達(dá)到5％蛋白質(zhì)含量所需的最終產(chǎn)品體積計(jì)算如下用剩余樣品測定最初pH，先用0.9％NaCl將樣品稀釋10倍，然后用0.5NHCl或0.5NNaOH的100倍稀釋液滴定至pH6.3-6.4。pH為6.55。為了校正pH，加入1.35ml滴定液即以0.9％NaCl配制的0.5NHCl溶液，最終的pH為6.35。如果需要校正，如下計(jì)算校正pH所需非稀釋0.5N試劑的量所需最終體積(L)-所需滴定液100倍稀釋液體積(ml)=非稀釋0.5N試劑體積(ml)或，在本實(shí)施例中，34.128L×1.35ml=46.1ml非稀釋0.5N試劑根據(jù)已知方法測試Viresolve-180濾膜模塊的完整性。完整性測試值必須大于1.2，模塊必須如前所述用氯消毒并清洗。計(jì)算所需100X乙基汞硫代水楊酸鈉溶液的體積不斷混合產(chǎn)品，同時加入341ml的100倍乙基汞硫代水楊酸鈉溶液。用0.801L清除了病毒的50mMNaCl-甘氨酸緩沖液將產(chǎn)品調(diào)節(jié)到所需的最終體積，混合10分鐘。無菌取樣10.5ml產(chǎn)品測定pH。pH應(yīng)是6.3-6.4。兩次讀數(shù)的實(shí)際pH是6.38和6.354。最終的蛋白質(zhì)產(chǎn)品滿足接受標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)=5.3％pH=如上氣相層析測得的甲醇含量為53.9ppm。兩次測試的聚山梨酸酯80=101.7ppm和102.2ppm，平均值為101.9ppm。實(shí)施例2A如下制備實(shí)施例2中使用的150mMNaCl-甘氨酸緩沖液計(jì)算需制備的緩沖液量[重懸漿體積(L)×10L]×2+60=緩沖液制備體積[27.208L×10L]×2+60=制備604.16L緩沖液確定并測定所需原料量，加入清除了熱原的容器中。表4<tablesid="table4"num="004"><table>原料所需濃度×每批量=所需量NaCl8.87g/L604.16L5，358.90g氨基乙酸15.01g/L604.16L9，068.44g聚山梨酸酯800.02g/L604.16L12.08g</table></tables>多次用2L注射用水，U.S.P洗滌稱量聚山梨酸酯的容器，將每次的洗滌液都加入原料中，補(bǔ)足到604.16L。確定以下物質(zhì)的量表5<tablesid="table5"num="005"><table>原料所需濃度×每批量=所需量1.0NNaOH0.125ml/L604.16L75.52ml</table></tables>用注射用水，U.S.P稀釋混合物到要求體積，將最后所得混合物混合60分鐘。測定pH；要求是6.3-6.5。實(shí)際pH為6.38。如果不合要求，則需添加1.0NHCl或1.0NNaOH，直到達(dá)到要求的pH；每次添加后都必須將溶液混合15-30分鐘，并確認(rèn)pH測定結(jié)果。測定數(shù)字比電導(dǎo)；要求是25℃時為14.15-15.59×10-3mhos/cm。結(jié)果是15.18×10-3mhos/cm。如果不合要求，則報(bào)廢并重新制備。測定聚山梨酸酯80；測試樣品必須含15-24ppm聚山梨酸酯80。實(shí)際濃度為19.5ppm。比較實(shí)施例含聚山梨酸酯80與無聚山梨酸酯80比較實(shí)施例1A-含聚山梨酸酯80將沉淀Ⅱ漿料(10g)重懸在30mlWFI中。將該重懸漿(40ml)與360ml含100ppm(0.1g/L)聚山梨酸酯80的150mMNaCl-甘氨酸緩沖液混合，令總體積為400ml。流過MilliporeMultiplex泵送平臺(1/3sq.ft.模塊)的透過液流速為21.8ml/min，通量為0.06ml/min./cmsq.。運(yùn)行39分鐘后，跨膜壓力仍低于1.3psi，篩分系數(shù)高于80％。用高離子強(qiáng)度的含聚山梨酸酯80緩沖液保證IgG多克隆抗D球蛋白能自由通過。比較實(shí)施例1B-無聚山梨酸酯80將沉淀Ⅱ漿料(10g)重懸在30mlWFI中。將該重懸漿(40ml)與360ml無聚山梨酸酯80的150mMNaCl-甘氨酸緩沖液混合(稀釋10倍)，令總體積為400ml。流過MilliporeMultiplex泵送平臺(1/3sq.ft.模塊)的透過液流速為21.8ml/min，通量為0.06ml/min./cmsq.。運(yùn)行39分鐘后，跨膜壓力為6.1psi，篩分系數(shù)迅速降至60％。用高離子強(qiáng)度的含聚山梨酸酯80緩沖液保證IgG多克隆抗D球蛋白自由通過。以上比較研究的結(jié)果顯示，高離子強(qiáng)度緩沖系統(tǒng)中必須含聚山梨酸酯80。比較實(shí)施例2低離子強(qiáng)度與高離子強(qiáng)度比較實(shí)施例2A-低離子強(qiáng)度將沉淀Ⅱ漿料(1.35g)重懸在4.5mlWFI中。將該重懸漿(5.0ml)與45ml含0.1g/L聚山梨酸酯80的50mMNaCl-甘氨酸緩沖液混合，令總體積為50ml。流過Viresolve-180小面積模塊(SAM，10sq.cm)(MilliporeCorporation，Bedford，MA)的透過液流速為15.6ml/min，通量為0.64ml/min./cmsq.。運(yùn)行28分鐘后，篩分系數(shù)迅速降至31％。比較實(shí)施例2B-高離子強(qiáng)度將沉淀Ⅱ漿料(46.0g)重懸在比較實(shí)施例2A中含100ppm(0.01％)聚山梨酸酯80的50mMNaCl-甘氨酸緩沖液中，其中已加了0.29gNaCl，使它成為150mMNaCl-甘氨酸緩沖液。流過Viresolve-180小面積模塊(SAM，10sq.cm)(MilliporeCorporation，Bedford，MA)的透過液流速為15.6ml/min，通量為0.64ml/min./cmsq.。運(yùn)行40分鐘后，篩分系數(shù)為86％。以上比較實(shí)施例2A和2B對低離子強(qiáng)度和高離子強(qiáng)度緩沖系統(tǒng)所作的比較研究結(jié)果顯示，處理過程中緩沖系統(tǒng)的離子濃度對蛋白質(zhì)通過Viresolve濾膜具有可測知的、顯著的影響。比較實(shí)施例3溶解于WFI，低離子強(qiáng)度的冷凍干燥沉淀Ⅱ漿料產(chǎn)品概述用Viresolve/180(1/3ft2)模塊測試人IgG產(chǎn)品，以測定該濾膜對該分子的性能。進(jìn)行了兩種實(shí)驗(yàn)；通量變化和體積減少。初期測試測定蛋白質(zhì)篩分與通量的關(guān)系，提供基本膜數(shù)據(jù)。在體積減少實(shí)驗(yàn)中用通量變化實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)模擬過程的運(yùn)行。用溶于注射用水(WFI)的產(chǎn)品在通量變化實(shí)驗(yàn)中沒有發(fā)現(xiàn)有蛋白質(zhì)通過。此后的實(shí)驗(yàn)用產(chǎn)品的甘氨酸緩沖液(含0.01％聚山梨酸酯80)溶液。用該溶液，蛋白質(zhì)質(zhì)量回收率為89.1％，體積增加83.3％。目的實(shí)驗(yàn)的目的是評價用Viresolve/180模塊處理產(chǎn)品時的篩分系數(shù)和蛋白質(zhì)質(zhì)量回收率。所得的數(shù)據(jù)被用來確定系統(tǒng)的操作條件。實(shí)驗(yàn)在4℃的冷室，用產(chǎn)品的WFI溶液進(jìn)行初期實(shí)驗(yàn)。此后的實(shí)驗(yàn)都在室溫下用1/3ft2的Viresolve/180模塊進(jìn)行。所有蛋白質(zhì)濃度均通過讀取280nm光密度(O.D.)測定。所用樣品均以產(chǎn)品緩沖液稀釋并以此為背景讀數(shù)。通量變化1)如圖3A所示安裝系統(tǒng)，采用Viresolve/180模塊#0010，產(chǎn)品批號為#K2EM0536(MilliporeCorporation，Bedford，MA)。2)500ml沉淀Ⅱ在WFI中的冷凍干燥粉末配制成約1％的蛋白質(zhì)濃度，用泵將其裝入1000ml的原料包中。產(chǎn)品取樣測定最初蛋白質(zhì)濃度。將原料包與系統(tǒng)連接，用管子先抽去空氣。3)將產(chǎn)品循環(huán)30分鐘，橫流流速為500ml/min。(滲透泵是關(guān)閉的)4)從截留液口取1ml樣品測定是否出現(xiàn)顯著的蛋白質(zhì)吸收(R0)。注如非另作說明，所有取樣均為1ml。5)最初的透過液流速是1.09ml/min(J=0.003ml/min/cm2)。用裝有308MC/A泵頭的WatsonMarlow503U泵控制透過液流速。用35分鐘將產(chǎn)品循環(huán)返回到進(jìn)料回路。6)35分鐘的循環(huán)后，采集一份截留液樣品(R1)和一份透過液樣品(P1)。此時，過程由冷室轉(zhuǎn)移到室溫下。以相同流速，再循環(huán)30分鐘。7)室溫下循環(huán)30分鐘后，采集一份截留液樣品(R2)和一份透過液樣品(P2)。8)然后將橫流提高到約600ml/min，循環(huán)15分鐘。采集截留液樣品(R3)和透過液樣品(P3)。9)用產(chǎn)品緩沖液將產(chǎn)品稀釋至0.5％。保持橫流流速與透過液流速恒定。循環(huán)20分鐘后采集截留液樣品(R4)與透過液樣品(P4)。10)再測定兩次透過液通量速率。0.005ml/min/cm2(1.82ml/min)和0.01ml/min/cm2(3.63ml/min)。每次至少循環(huán)30分鐘。通量變化與體積減少相結(jié)合第2個實(shí)驗(yàn)是對溶于甘氨酸緩沖液的人IgG進(jìn)行的。1)如圖3A所示安裝系統(tǒng)，采用Viresolve/180模塊#0009，產(chǎn)品批號為#K2EM0536。2)用泵將濃度約1％的990ml產(chǎn)品裝入1L的原料包中。取1ml樣品測定實(shí)際蛋白質(zhì)濃度。注如非另作說明，所有取樣均為1ml。將原料包與系統(tǒng)連接，用管子先抽去空氣。3)將產(chǎn)品循環(huán)30分鐘，橫流流速為500ml/min(滲透泵是關(guān)閉的)。用裝有501RL泵頭的WatsonMarlow503U泵控制橫流流速。循環(huán)后，取樣測定蛋白質(zhì)濃度。4)測定4次透過液通量速率0.003，0.005，0.030和0.050ml/min/cm2。產(chǎn)品以每一通量速率循環(huán)30分鐘。將橫流流速升高到600ml/min，通量為0.05ml/min/cm2。30分鐘后，采集截留液和透過液樣品。5)實(shí)驗(yàn)的通量變化部分結(jié)束后，關(guān)閉滲透泵。按照圖3B重建系統(tǒng)。取最初樣品15ml。6)然后以0.050ml/min/cm2(18.2ml/min)的通量處理產(chǎn)品。注測得的通量為0.043ml/min/cm2(15.7ml/min)。7)采集100，250和500ml產(chǎn)品時取樣截留液和透過液。8)在處理了645mlIgG溶液時開始用產(chǎn)品緩沖液進(jìn)行滲濾(以透過液流速)。滲濾持續(xù)到500ml處理產(chǎn)品通過Viresolve/180模塊。在收集到745，895和1145ml經(jīng)處理產(chǎn)品時取樣截留液和透過液。9)剩余溶液以體積減少模式進(jìn)行處理，直至減少到系統(tǒng)的滯留體積。在總處理體積達(dá)1245和1475ml時取樣截留液和透過液。10)最后用一步滲濾回收濃縮滯留體積內(nèi)的產(chǎn)品。連續(xù)進(jìn)行4次50ml的滲濾。分別收集每次的滲濾液。11)采集匯集后總透過液的樣品和各份滲濾液的樣品。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時采集最后的截留液樣品，測定進(jìn)料包中殘留的產(chǎn)品濃度。結(jié)果通量變化在最初的通量變化實(shí)驗(yàn)中沒有觀察到產(chǎn)品通過。為了提高產(chǎn)品的溶解度，將過程轉(zhuǎn)移到室溫下(最初是在4℃)。沒有看到產(chǎn)品通過增加。引導(dǎo)蛋白質(zhì)通過的其它方法包括提高橫流流速，稀釋產(chǎn)品和提高透過液通量速率以迫使蛋白質(zhì)通過。在所有測試條件下，篩分系數(shù)始終為0。將最初的樣品懸浮在WFI中。溶液變得渾濁，出現(xiàn)了預(yù)計(jì)的溶解度問題。然后將其余產(chǎn)品溶解在甘氨酸緩沖液中，用該溶液進(jìn)行其余測試。通量變化與體積減少相結(jié)合表6顯示了對懸浮于甘氨酸緩沖液中的IgG進(jìn)行的通量變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。表中是采自總蛋白約0.1％的產(chǎn)品的數(shù)據(jù)。表中以吸光單位(AU)表示產(chǎn)品濃度值。該值已將稀釋因數(shù)計(jì)算在內(nèi)。初濃度1.68AUR0濃度1.81AU表6附圖4是IgG甘氨酸緩沖液溶液的篩分系數(shù)對通量曲線。以下是體積減少實(shí)驗(yàn)得出的產(chǎn)品濃度(AU)數(shù)據(jù)。初處理體積963ml初濃度～0.1％(1.80AU)總蛋白橫流流速600ml/min測得通量0.043ml/min/cm2(流速15.7ml/min)產(chǎn)品1的透過液體積645ml滲濾體積500ml產(chǎn)品2的透過液體積330ml表7提供了體積減少實(shí)驗(yàn)中采集的蛋白質(zhì)濃度和篩分系數(shù)數(shù)據(jù)。表中以吸光單位(AU)表示產(chǎn)品濃度。稀釋因數(shù)已計(jì)算在內(nèi)。表7表8提供了體積減少實(shí)驗(yàn)中每一步的總蛋白濃度數(shù)據(jù)。稀釋因數(shù)已計(jì)算在內(nèi)。表8*第四次滲濾加最終體積減少。圖5是體積減少實(shí)驗(yàn)的篩分系數(shù)對過濾體積的曲線。討論蛋白質(zhì)質(zhì)量回收率表9體積減少<tablesid="table9"num="009"><table>處理步驟總體積(ml)濃度(AU/ml)蛋白質(zhì)質(zhì)量(AU)初始9631.801733.4產(chǎn)品1透過液6451.15741.8滲濾5000.81405.0產(chǎn)品2透過液3300.68224.4第一次滲濾530.8444.5第二次滲濾600.5935.4第三次滲濾500.5025.0第四次滲濾*1000.4444.0</table></tables>*第四次滲濾加最終體積減少截留液樣品的總蛋白質(zhì)量20.6AU透過液樣品的總蛋白質(zhì)量6.2AU滲濾提高了蛋白質(zhì)的回收率，但導(dǎo)致產(chǎn)品體積增加和稀釋。每次滲濾增加的體積百分比如下滲濾體積增加55.7％第一次滲濾體積增加61.3％第二次滲濾體積增加67.6％第三次滲濾體積增加72.8％第四次滲濾體積增加83.3％根據(jù)實(shí)驗(yàn)得出的蛋白質(zhì)篩分?jǐn)?shù)據(jù)，得到以下信息1)Viresolve/180對蛋白質(zhì)的吸收可忽略。2)產(chǎn)品懸浮于WFI時見到渾濁，而且用該溶液無蛋白質(zhì)通過，說明該產(chǎn)品與WFI存在穩(wěn)定性問題。將蛋白質(zhì)懸浮于甘氨酸緩沖液時則有蛋白質(zhì)通過Viresolve膜。3)處理過程中，隨著蛋白質(zhì)在膜的上游側(cè)濃縮，篩分系數(shù)逐步下降。4)過程最后的低篩分系數(shù)(～25％)表明膜表面發(fā)生了顯著的蛋白質(zhì)極化。結(jié)論用懸浮于兩種不同緩沖液WFI和甘氨酸緩沖液中的人IgG，用Viresolve/180濾膜進(jìn)行了可行性研究。用懸浮于WFI的產(chǎn)品沒有蛋白質(zhì)通過。初始溶液略有渾濁，說明蛋白質(zhì)沒有完全溶于溶液。這會造成濾膜的中度極化，阻止蛋白質(zhì)通過。通量變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了這種情況的確發(fā)生了未溶解的蛋白堵塞了膜，阻止蛋白通過。產(chǎn)品甘氨酸溶液的澄清度顯著不同該溶液完全沒有渾濁。該溶液的通量變化試驗(yàn)顯示對于所有被測通量(0.003ml/min/vm2至0.5ml/min/vm2)，篩分系數(shù)約為50％。甘氨酸緩沖液中的產(chǎn)品濃度約為0.1％(總蛋白)。用0.1％溶液進(jìn)行體積減少實(shí)驗(yàn)。產(chǎn)品回收率達(dá)89.1％時體積增加83.3％。在處理過程中采用滲濾來限制濾膜上游側(cè)的蛋白質(zhì)濃縮。還用最后的滲濾來回收系統(tǒng)滯留體積中的蛋白質(zhì)。在處理過程中，篩分系數(shù)從最初的57.8％穩(wěn)步下降到最后的26.9％。這說明，處理過程中，有明顯的蛋白質(zhì)層沉積在濾膜上。過程中的滲濾減慢了篩分系數(shù)降低的速度，但不能使它提高或保持穩(wěn)定。最后的滲濾步驟的確回收到了滯留體積和濾膜表面的部分蛋白。最后滲濾液中的蛋白質(zhì)濃度約為初始溶液的25-50％；這說明，滲濾的新鮮緩沖液洗滌緩慢去除了濾膜的蛋白質(zhì)極化層。這有利于更多的產(chǎn)品在滲濾中通過濾膜，減少了產(chǎn)品稀釋并縮短了處理時間。延長最后的滲濾可回收到更多蛋白，但會降低產(chǎn)品濃度。經(jīng)測定，產(chǎn)品溶液中含5-12％二聚體。這些二聚體是活性產(chǎn)品的一部分。當(dāng)然，二聚體的存在會引起膜表面的蛋白質(zhì)極化，而且，如果二聚體保持完整，將在上游被截獲。比較實(shí)施例顯示，在使用冷凍干燥起始原料和低離子強(qiáng)度緩沖液的條件下，得到的篩分系數(shù)較低，即使在高稀釋度條件下，通過濾膜的蛋白質(zhì)也少于50％。要使得實(shí)施例1和2的過程優(yōu)化并獲準(zhǔn)，在相同時間內(nèi)處理該物質(zhì)將需要具有更大濾膜面積的設(shè)備。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得，以上描述和實(shí)施例說明本發(fā)明的實(shí)施，而不是限定。可對本文中的細(xì)節(jié)進(jìn)行多種改變，這些都不背離本發(fā)明的范圍和宗旨。權(quán)利要求1．一種基本純的免疫球蛋白。2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白，它是單克隆免疫球蛋白。3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白是抗D免疫球蛋白。4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫球蛋白，它是單克隆抗D免疫球蛋白。5．根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫球蛋白，所述抗D免疫球蛋白是多克隆抗D免疫球蛋白。6．根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫球蛋白，所述抗D免疫球蛋白是RhoGAM或MICRhoGAM。7．權(quán)利要求6所述免疫球蛋白的制劑，它包含4.0-6.0重量％免疫球蛋白，24-36ppm乙基汞硫代水楊酸鈉，和80-200ppm聚山梨酸酯80。8．根據(jù)權(quán)利要求7所述的免疫球蛋白制劑，它包含5.0重量％免疫球蛋白，33ppm乙基汞硫代水楊酸鈉和100ppm聚山梨酸酯80。9．一種制備權(quán)利要求1所述免疫球蛋白制劑的方法，它包括的步驟有(a)用醇分離人血漿；(b)重懸所得沉淀Ⅱ；(c)將沉淀Ⅱ重懸液與含賦形劑的高離子強(qiáng)度緩沖液混合；(d)對免疫球蛋白進(jìn)行超微過濾。10．根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中的醇是甲醇。11．根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中的緩沖液是150mMNaCl-甘氨酸緩沖液。12．根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中的賦形劑是非離子聚氧乙烯除垢劑。13．根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中的非離子聚氧乙烯除垢劑是聚山梨酸酯80。14．根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中的超微過濾包括使用截留值低于30nm的第一超微濾膜。15．根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中的截留值為12nm。16．根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中的超微過濾包括使用截留值為10，000-60，000k的第二超微濾膜。17．根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中的截留值為50，000k。18．根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中的免疫球蛋白是抗D免疫球蛋白。19．根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中的抗D免疫球蛋白是RhoGAM或MICRhoGAM。20．用權(quán)利要求18所述方法制備的RhoGAM或MICRhoGAM。21．一種生產(chǎn)基本純抗D抗體的方法，包括的步驟有(a)重懸分離人血漿得到的沉淀Ⅱ；(b)將沉淀Ⅱ重懸液與加工助劑混合；(c)對免疫球蛋白進(jìn)行超微過濾。22．根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中的加工助劑包含高離子強(qiáng)度緩沖液與非離子賦形劑。23．根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中的高離子強(qiáng)度緩沖液包含150mMNaCl-甘氨酸緩沖液，非離子賦形劑包含聚山梨酸酯80。24．根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中的超微過濾包括使用截留值低于30nm的第一超微濾膜。25．根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中的截留值為12nm。26．根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中的超微過濾包括使用截留值為10，000-60，000k的第二超微濾膜。27．根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中的截留值為50，000k。28．根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，還包括步驟(d)用截留值50，000的超微濾膜濃縮免疫球蛋白并以低離子強(qiáng)度緩沖液交換加工助劑。29．根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中的低離子強(qiáng)度緩沖液是50mMNaCl-甘氨酸緩沖液。30．用權(quán)利要求21所述方法制備的抗D免疫球蛋白。31．用權(quán)利要求29所述方法制備的抗D免疫球蛋白。32．一種生產(chǎn)基本純蛋白質(zhì)的方法，包括的步驟有(a)從血漿中分離出蛋白質(zhì)；(b)將分離出的蛋白重懸在緩沖液中；(c)將分離蛋白重懸液與加工助劑混合；(d)對分離蛋白進(jìn)行超微過濾。33．根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中的分離蛋白是免疫球蛋白。34．根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中的分離步驟(a)選自分批層析，離子交換層析，親合層析或Cohn法。全文摘要生產(chǎn)基本無病毒免疫球蛋白尤其是抗D免疫球蛋白的方法,以及所得產(chǎn)品。具體地說,本發(fā)明提供在高離子強(qiáng)度緩沖液中用諸如聚山梨酸酯80的賦形劑超微過濾抗D免疫球蛋白的方法。附加步驟包括用滲濾濃縮抗D蛋白和降低賦形劑濃度。文檔編號C07K16/00GK1279688SQ98811286公開日2001年1月10日申請日期1998年10月14日優(yōu)先權(quán)日1997年10月14日發(fā)明者R·W·范霍爾滕,G·E·小烏倫森申請人:奧爾托臨床診斷股份有限公司,米里坡有限公司