專利名稱：：用TNFR-Ig治療哮喘的制作方法哮喘是呼吸道的一種慢性發(fā)炎性疾病，其特征在于因接觸特異性過(guò)敏原(IgE介導(dǎo)的反應(yīng))，鍛煉，冷空氣或緊張而復(fù)發(fā)加重。與哮喘病相關(guān)的發(fā)炎特點(diǎn)是存在激活的嗜酸細(xì)胞，呼吸道對(duì)非特異性刺激的敏感性增加(呼吸道過(guò)敏反應(yīng)AHR)，水腫，粘液分泌過(guò)多和咳嗽。相信該發(fā)炎過(guò)程部分地由分泌各種細(xì)胞因子的Th2型淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生和激活介導(dǎo)。細(xì)胞因子TNFα是涉及引起哮喘癥狀的一種細(xì)胞因子。復(fù)合治療劑用于治療哮喘，使用吸入β2的興奮劑(緩解急性支氣管痙攣)和作為選擇試劑的類固醇(抗發(fā)炎)。然而，據(jù)認(rèn)為沒(méi)有一種治療方案是足夠有效的，但是該疾病的死亡率在逐漸增加。最迫切的醫(yī)學(xué)需要之一是需要一種可迅速逆轉(zhuǎn)在急性/嚴(yán)重哮喘中所見(jiàn)的嚴(yán)重發(fā)作的肺炎的試劑。另外，沒(méi)有一種治療劑可歸入疾病緩解劑。必然需要一種可迅速逆轉(zhuǎn)急性/嚴(yán)重哮喘中所見(jiàn)的發(fā)炎反應(yīng)的藥物以及作為真正的疾病緩解劑的試劑。TNFα的作用是啟動(dòng)哮喘癥狀，而申請(qǐng)人確定抑制TNFα的作用提供了緩解這些癥狀的途徑?，F(xiàn)在申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)了一種在患有哮喘癥狀的病人中抵抗哮喘的方法，包括給所述的病人施用含有由一種或多種嵌合的TNFα結(jié)合蛋白組成的制品的組合物，所述的制品中的各蛋白質(zhì)由融合到IgG上的p55TNF受體蛋白的可溶部分組成，其中所述的融合的IgG含有除了IgG重鏈恒定區(qū)的第一IgG結(jié)構(gòu)域之外的所有IgG結(jié)構(gòu)域，所述的組合物含有治療上的惰性載體，且所述組合物施用給所述病人以便給病人提供有效量的所述嵌合蛋白制品以抵抗所述的哮喘癥狀。該組合物可以有效地施用給患有哮喘病的病人，其中嵌合蛋白制品以足以緩解所述的疾病的影響的量來(lái)施用。該組合物也可以在哮喘病發(fā)作前以有效防止或延緩所述的疾病發(fā)作的量施用給哮喘病人。本發(fā)明涉及通過(guò)給病人施用含有由一種或多種嵌合的TNFα結(jié)合蛋白組成的制品的組合物在患有哮喘癥狀的病人中抵抗哮喘的方法。該制品中的蛋白質(zhì)由融合到IgG(免疫球蛋白G)上的p55TNF受體蛋白的可溶部分組成(TNFR-Ig)，其中該IgG含有除了IgG重鏈恒定區(qū)的第一結(jié)構(gòu)域之外的所有結(jié)構(gòu)域。該組合物還含有治療上的惰性載體。將該組合物施用給所述的病人以便給病人提供有效量的嵌合蛋白制品以抵抗所述的哮喘癥狀。由融合到IgG上的p55TNF受體蛋白的可溶部分組成的嵌合TNFα結(jié)合蛋白用于制備治療哮喘的藥物是本發(fā)明的另一目的，其中所述的融合IgG含有除了IgG重鏈恒定區(qū)的第一IgG結(jié)構(gòu)域之外的所有IgG結(jié)構(gòu)域。該組合物以足以緩解哮喘發(fā)作的影響的蛋白質(zhì)制品的量有效施用給處于哮喘病發(fā)作期間的病人。該組合物也可以在哮喘病發(fā)作前以有效防止或延緩該疾病發(fā)作的蛋白質(zhì)制品的量施用給哮喘病人。任何TNFR-Ig，即由融合到IgG上的p55TNF受體蛋白的可溶部分組成的嵌合TNFα結(jié)合蛋白可用于本發(fā)明的制品以便在具有上面段落所述哮喘癥狀的病人中抵抗哮喘，其中所述的融合IgG含有除了IgG重鏈恒定區(qū)的第一IgG結(jié)構(gòu)域之外的所有IgG結(jié)構(gòu)域。IgG可以是人IgG1或IgG3，在本發(fā)明中優(yōu)選IgG1。該TNFR-Ig的例子包括在EP417563；美國(guó)專利號(hào)5,447,851和5,395,760；Lesslauer等，歐洲免疫學(xué)雜志,21(11):2883,1991；Loetscher等，生物學(xué)化學(xué)雜志，266(27):18324,1991；Ashkenazi等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，88:10535,1991中公開(kāi)的蛋白質(zhì)，它們也可用在這些文獻(xiàn)中公開(kāi)的方法獲得。優(yōu)選的本發(fā)明的TNFR-Ig分子的制品用IgG1制備并包含具有以一個(gè)或多個(gè)唾液酸殘基終止的復(fù)合寡糖并具有暴露的N-乙酰葡糖胺的蛋白質(zhì)，制品中唾液酸殘基的摩爾比為每摩爾蛋白質(zhì)大約4至大約7摩爾唾液酸，尤其是大約5至大約6，制品中暴露的N-乙酰葡糖胺的摩爾比是每摩爾蛋白質(zhì)從大約1至大約2摩爾N-乙酰葡糖胺，制品中唾液酸殘基與N-乙酰葡糖胺殘基的摩爾比是從大約0.35至大約0.5，尤其是大約0.4至大約0.45。制品的等電點(diǎn)(pI)是從大約5.5至大約7.5，可用層析聚焦測(cè)定并對(duì)神經(jīng)氨酸酶處理敏感。本發(fā)明的TNFR-Ig可用重組技術(shù)或蛋白質(zhì)合成的常規(guī)方法獲得。編碼p55TNF受體的DNA，編碼除了第一IgG1或IgG3重鏈恒定區(qū)之外的所有結(jié)構(gòu)域的DNA，且將這些序列連接在一起用于在合適的載體中表達(dá)對(duì)技術(shù)人員而言是已知的且在文獻(xiàn)中進(jìn)行了描述。合適的克隆載體和宿主細(xì)胞是熟知的且可由技術(shù)人員進(jìn)行選擇，而且已測(cè)定了合適的培養(yǎng)條件(見(jiàn)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)踐探索，第2版，Rickwood和Hames編輯，牛津大學(xué)出版社，NY1992)。然后可使用已知的蛋白質(zhì)回收和純化方法純化TNFR-Ig。TNFR-Ig盡管也可以從宿主細(xì)胞裂解產(chǎn)物中回收，但優(yōu)選從培養(yǎng)基中作為分泌的多肽回收?？呻x心細(xì)胞培養(yǎng)基或裂解產(chǎn)物以去掉顆粒狀的細(xì)胞碎片。隨后從有雜質(zhì)的可溶性蛋白質(zhì)和多肽中純化TNFR-Ig，下面的程序作為合適的純化程序的例子在免疫親和或離子交換柱上分離；乙醇沉淀；反向HPLC；在二氧化硅或諸如DEAE的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂上層析；層析聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；使用例如，SephadexG-75，和蛋白A瓊脂糖柱凝膠過(guò)濾以去掉諸如IgG的污染物。諸如苯甲基磺酰氟(PMSF)的蛋白酶抑制劑也可用于抑制純化期間的蛋白水解的降解。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可預(yù)料到適合于目的多肽的純化方法需要根據(jù)在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)的多肽的特征的變化進(jìn)行修改。具有特定pI及唾液酸和N-乙酰葡糖胺比率的本發(fā)明的TNFR-Ig可通過(guò)使用重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)TNFR-Ig并按例如WO96/39488所述控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生TNFR-Ig的培養(yǎng)條件獲得。選擇的宿主細(xì)胞應(yīng)能夠?qū)-和O-連接的包括唾液酸的糖類連接到它們表達(dá)的蛋白質(zhì)上。一個(gè)這種宿主細(xì)胞的例子是CHO細(xì)胞。合適的培養(yǎng)條件是熟知的且依賴于所選的宿主細(xì)胞。在糖蛋白生產(chǎn)期間增加細(xì)胞特定產(chǎn)量導(dǎo)致成熟蛋白質(zhì)唾液酸含量降低，反之亦然。影響細(xì)胞特定產(chǎn)量的因素在本領(lǐng)域是熟知的，且包括但不限于，影響DNA/RNA拷貝數(shù)的因素，影響RNA的因素，如穩(wěn)定RNA的因素，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分和其它補(bǔ)充物，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子濃度，培養(yǎng)物環(huán)境的重量摩爾滲透壓濃度，細(xì)胞培養(yǎng)物的溫度和pH值等。這些因素可用熟知的方法進(jìn)行調(diào)節(jié)以獲得諸如唾液酸的糖蛋白的優(yōu)選含量。通過(guò)向細(xì)胞培養(yǎng)物中以大約0.1mM至大約20mM，或5至20mM的濃度加入鏈烷酸，如丁酸鈉或其鹽，并保證細(xì)胞培養(yǎng)物的重量摩爾滲透壓濃度在大約250至600mOsm之間，最好在過(guò)渡期間互相組合改變細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)期的細(xì)胞特定產(chǎn)量來(lái)生產(chǎn)具有不同唾液酸量的蛋白質(zhì)。大約6.0mM丁酸鈉的濃度和350-400mOsm的條件提供本發(fā)明的高度唾液酸化的TNFR-Ig，而大約12mM丁酸鈉的濃度提供本發(fā)明的較低唾液酸化的TNFR-Ig。后一濃度可與450-550mOsm的條件組合。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到培養(yǎng)基的重量摩爾滲透壓濃度依賴于培養(yǎng)液中的滲透的活性顆粒濃度，和配制哺乳動(dòng)物復(fù)合細(xì)胞培養(yǎng)基的許多變量會(huì)影響重量摩爾滲透壓濃度。培養(yǎng)基的組成決定培養(yǎng)基的起始重量摩爾滲透壓濃度。使用滲透壓計(jì)，例如FisherScientific,Pittsburgh,Pennsylvania以商標(biāo)名OSMETTE銷售的滲透壓計(jì)(或可從精密系統(tǒng)公司，NatickMA獲得的Osmette2007型)測(cè)量重量摩爾滲透壓濃度。為了獲得所需范圍的重量摩爾滲透壓濃度，可調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中各組成成分的濃度?？稍谂囵B(yǎng)基中加入溶質(zhì)以增加其重量摩爾滲透壓濃度，該溶質(zhì)包括蛋白質(zhì)，肽，氨基酸，諸如蛋白胨的水解動(dòng)物蛋白質(zhì)，非代謝多聚體，維生素，離子，鹽，糖類(特別是葡萄糖)，代謝產(chǎn)物，有機(jī)酸，脂類等。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在補(bǔ)料分批培養(yǎng)程序期間向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入蛋白胨以及其它培養(yǎng)基成分控制重量摩爾滲透壓濃度?？墒褂眉?xì)胞培養(yǎng)的三個(gè)時(shí)期，生長(zhǎng)期其中選定的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)最快；接著是過(guò)渡期，其中選擇并應(yīng)用如上所述的為得到成熟糖蛋白所需唾液酸含量的細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)；隨后是生產(chǎn)期，其中保持過(guò)渡期選擇的參數(shù)，生產(chǎn)并收獲糖蛋白產(chǎn)物。關(guān)于在本發(fā)明說(shuō)明書中優(yōu)選的純化，可以是選擇來(lái)用于本發(fā)明的糖類的純化技術(shù)和方法?？赏ㄟ^(guò)例如，離子交換軟凝膠色譜或使用陽(yáng)離子或陰離子交換樹(shù)脂的HPLC，針對(duì)含唾液酸的分子富集本發(fā)明的所需糖形式，其中收集酸性更強(qiáng)的餾分。本發(fā)明優(yōu)選的TNFR-Ig在純化組合物中具有一個(gè)或多個(gè)下列特征TNFR-Ig組合物的pI范圍在大約5.5至大約7.5之間，唾液酸與蛋白質(zhì)的摩爾比為大約4至大約7，尤其是大約5至大約6，具有每摩爾蛋白質(zhì)大約1至大約2摩爾的暴露的N-乙酰葡糖胺殘基，具有大約0.35至大約0.5且更優(yōu)選的是大約0.4至大約0.45的唾液酸與N-乙酰葡糖胺的摩爾比。獲得該優(yōu)選的TNFR-Ig的最合適的條件是采用的丁酸鈉濃度為大約0.1mM至大約6mM，重量摩爾滲透壓濃度維持在大約300至450mOsm之間，溫度在大約30℃和37℃之間的培養(yǎng)條件。技術(shù)人員使用熟知的技術(shù)可測(cè)定TNFR-Ig的上述特征。例如，如果需要，用本發(fā)明方法生產(chǎn)的糖蛋白的復(fù)合糖類部分容易用糖類分析的常規(guī)技術(shù)分析。因此，例如，在本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，如凝集素印跡揭示了末端甘露糖或諸如半乳糖的其它糖類的比率。通過(guò)使用脫水酰肼或酶學(xué)方法從蛋白質(zhì)釋放糖并經(jīng)離子交換或大小排阻層析或其它本領(lǐng)域熟知的方法分離寡聚糖可證實(shí)單-，雙-，三-，四-支寡聚糖由唾液酸的終止。也可在用神經(jīng)氨酸酶處理去掉唾液酸之前和之后測(cè)定糖蛋白的pI。神經(jīng)氨酸酶處理后pI增加表明在糖蛋白上存在唾液酸。本發(fā)明的糖類結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在表達(dá)為N-連接的或O-連接的糖類的蛋白質(zhì)上。N-連接的和O-連接的糖類主要區(qū)別在其核心結(jié)構(gòu)上。N-連接的糖基化指通過(guò)GlcNAc將糖部分連接到肽鏈的天冬酰胺殘基上。N-連接的糖類也含有共同的核心結(jié)構(gòu)Man1-6(Man1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-R。因此，在所述的核心結(jié)構(gòu)中，R代表生產(chǎn)蛋白的天冬酰胺殘基。生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的肽序列會(huì)含有天冬酰胺-X-絲氨酸，天冬酰胺-X-蘇氨酸，和天冬酰胺-X-半胱氨酸，其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸。相反，O-連接的糖類其特征在于一個(gè)共同的核心結(jié)構(gòu)，它是附著于蘇氨酸或絲氨酸羥基上的GalNAc。在N-連接的和O-連接的糖類中，最重要的是N-和O-連接的復(fù)合糖類。該復(fù)合糖類含有一些分支結(jié)構(gòu)。單-，雙-，三-和四-外側(cè)結(jié)構(gòu)對(duì)于增加末端唾液酸是重要的。這樣的外側(cè)鏈結(jié)構(gòu)提供了特異性糖的附加位點(diǎn)和包含本發(fā)明的糖類的鍵。以包括本文所述的那些方法的本領(lǐng)域已知的任何方法可分析所得的糖類。用于糖基化分析的一些方法在本領(lǐng)域是已知的并在本發(fā)明的內(nèi)容中是有用的。該方法提供了關(guān)于連接于肽上的寡聚糖的相同性和組成的信息。在本發(fā)明中有用的糖類分析方法包括但不限于凝集素層析；使用高pH值陰離子交換色譜的HPAEC-PAD以電荷為基礎(chǔ)分離寡聚糖；NMR；質(zhì)譜分析法；HPLC；GPC；單糖組成分析；順序酶消化。另外，釋放寡聚糖的方法是已知的。這些方法包括1)酶，通常使用肽-N-糖苷酶F/內(nèi)切-β-半乳糖苷酶進(jìn)行；2)使用強(qiáng)堿性環(huán)境以釋放主要的O-連接結(jié)構(gòu)消除法；和3)使用脫水酰肼以釋放N-和O-連接的寡聚糖的化學(xué)方法?？墒褂孟铝胁襟E進(jìn)行分析1．用去離子水透析樣品以去掉所有的緩沖鹽，隨后凍干。2．用脫水酰肼釋放完整的寡聚糖鏈。3．用無(wú)水的含甲醇的HCl處理完整的寡聚糖鏈以O(shè)-甲基衍生物釋放單個(gè)的單糖。4．任意第一氨基的N-乙?；?。5．衍生化以提供高-O-三甲基硅烷基甲基糖苷。6．通過(guò)在CP-SIL8柱上毛細(xì)GLC(氣-液色譜)分離這些衍生物。7．用從GLC的滯留時(shí)間和質(zhì)譜分析與已知標(biāo)準(zhǔn)相比來(lái)鑒定單個(gè)的糖苷衍生物。8．用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)(13-O-甲基-D-葡萄糖)以FID定量單個(gè)衍生物。以高效陰離子交換色譜結(jié)合脈沖安培計(jì)檢測(cè)(HPAE-PAD糖類系統(tǒng)，Dionex公司)可測(cè)定中性和氨基糖。例如，通過(guò)在20％(v/v)三氟乙酸中100℃水解6小時(shí)可釋放糖類。然后通過(guò)凍干或用Speed-Vac(SavantInstruments)干燥水解產(chǎn)物。然后將殘留物溶于1％三水乙酸鈉溶液中并按Anumula等(生化年鑒195:269-280(1991)〕所述在HPLC-AS6柱上分析?？稍谝皇饺輼悠分杏肶ao等(生化年鑒，179:332-335(1989)〕的直接比色方法分別測(cè)定唾液酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用Warren,L.生物化學(xué)雜志238:(8)(1959)的硫代巴比妥酸(TBA)。作為選擇，可進(jìn)行免疫印跡糖類分析。根據(jù)該方法，使用根據(jù)Haselbeck和Hosel[Hasebeck等，糖偶聯(lián)物雜志，7:63(1990)]所述的氧化免疫印跡方法的商用聚糖檢測(cè)系統(tǒng)(Boehringer)檢測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)合的糖類。按照廠家推薦的染色方案，除了蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上代替硝酸纖維素膜之外，封閉緩沖液在10mMTris緩沖液(pH7.4)和0.9％氯化鈉中包含了5％牛血清白蛋白。檢測(cè)用在tris緩沖鹽水中1∶1000稀釋的與堿性磷酸連接物(Boehringer)連接的抗洋地黃毒苷抗體進(jìn)行，使用在含100mM氯化鈉和50mM氯化鎂的100mMTris緩沖鹽水(pH9.5)中的磷酸酶底物，0.03％(w/v)4-氮藍(lán)四唑氯，和0.03％(w/v)5-溴-4氯-3-吲哚-磷酸。通常在大約10至15分鐘內(nèi)觀察含糖的蛋白質(zhì)帶。也可通過(guò)用肽-N-糖苷酶F消化分析糖類。根據(jù)該方法，殘留物懸浮于14μl含0.18％SDS,18mMβ-巰基乙醇，90mM磷酸鹽，3.6mMEDTA,pH8.6的緩沖液中，在100℃加熱3分鐘。冷卻到室溫后，樣品分成兩份相等的部分。一個(gè)等分樣品不作進(jìn)一步處理并用作對(duì)照。第二部分調(diào)節(jié)到含有大約1％NP-40去污劑，接著加入0.2單位的肽-N-糖苷酶F(Boehringer)。兩份樣品在37℃保溫2小時(shí)，然后用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。本發(fā)明的TNFR-Ig包含PEG化的TNFR-Ig，它是指共價(jià)連接到諸如聚(亞烷基)二醇(取代的或未取代的)，特別是聚乙二醇的多聚體上的TNFR-Ig分子。連接可以是直接的，但優(yōu)選借助于本領(lǐng)域已知的各種偶聯(lián)劑來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如在EP510346，EP593838，美國(guó)專利號(hào)4,766,106,4,917,888,4,902,502,4,847,325,4,179,337,5,832,657,Veronese等，應(yīng)用生物化學(xué)和生物技術(shù)，11:141(1985)和Monfardini等，生物偶聯(lián)化學(xué)6:62(1995)中所公開(kāi)的那些偶聯(lián)劑。PEG化的TNFR-Ig可以正如對(duì)TNFR-Ig所述的，用于哮喘治療和預(yù)防。本發(fā)明的TNFR-Ig制品對(duì)于在哮喘病人中抵抗哮喘有用。在治療具有哮喘病的病人時(shí)，這些制品可減輕疾病影響，如逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)生的炎癥，防止出現(xiàn)進(jìn)一步的炎癥。當(dāng)以預(yù)防的方式提供時(shí)，這些制品可延緩或防止哮喘病的發(fā)作，或當(dāng)疾病發(fā)生時(shí)，保證疾病的嚴(yán)重性降低。根據(jù)本發(fā)明，該制品可按任何常規(guī)方式施用給病人用于治療或預(yù)防。因此本發(fā)明的制品可在常規(guī)藥用組合物中施用，該組合物包括任何常規(guī)治療上的惰性載體。該藥用組合物可含有惰性的和藥物動(dòng)力學(xué)上有活性的添加劑。液體組合物可采用例如，與水混合的無(wú)菌溶液的形式。另外，也可有常規(guī)用作保護(hù)，穩(wěn)定，保濕和乳化劑的物質(zhì)以及改變滲透壓的物質(zhì)，如鹽，改變pH值的物質(zhì)，如緩沖液和其它添加劑。如果需要，在藥用組合物中可包括諸如生育酚，N-甲基-γ-生育胺，丁基化羥基苯甲醚或丁基化羥基甲苯的抗氧化劑。用于組合物的藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體包括鹽水，緩沖鹽溶液，葡萄糖或水。組合物也可包括特定的穩(wěn)定劑，例如糖，包括甘露糖和甘露醇，以及用于適合組合物(indictablecomposition)的局部麻醉劑，包括，例如，利度卡因鹽酸鹽。前面提到的載體物質(zhì)和稀釋劑可以是有機(jī)或無(wú)機(jī)物質(zhì)，例如，水，明膠，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，滑石粉，阿拉伯膠，聚(亞烷基)二醇等。前提是用于生產(chǎn)藥用組合物的所有佐劑和物質(zhì)是無(wú)毒的。本發(fā)明的制品可經(jīng)胃腸外(例如，通過(guò)皮下，靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，眼眶內(nèi)，囊內(nèi)的，脊柱內(nèi)，胸骨內(nèi)的注射)或噴霧吸入施用?？墒褂糜糜谀c胃外或噴霧吸入用藥的任何常規(guī)藥用制品。合適的藥用組合物的例子是輸注或注射溶液。優(yōu)選的用藥方式是通過(guò)靜脈內(nèi)注射。另一優(yōu)選的用藥方式是用氣溶膠?？墒褂萌我庥行Я康目瓜谋景l(fā)明的制品以減輕或逆轉(zhuǎn)疾病的影響或以防止或延緩疾病的發(fā)作。用于治療，防止或逆轉(zhuǎn)哮喘的本發(fā)明的用于腸胃外(注射)用藥的TNFR-Ig組合物的優(yōu)選劑量是每病人每千克體重大約0.1到大約5.0mg的TNFR-Ig制品(mg/kg)。特別優(yōu)選的劑量是從大約1.0到大約3.0mg/kg。用于相同目的且在噴霧用藥中的TNFR-Ig組合物的優(yōu)選劑量是占TNFR-Ig制品重量的0.03％至5.0％。在任一用藥方式中，治療劑量可在每個(gè)治療日中用藥一次，或分成更小的劑量在大約24小時(shí)期間內(nèi)用藥以達(dá)到總的所給劑量。為了經(jīng)腸胃外用藥快速治療哮喘病，可提供每病人每天0.1至5.0，特別是1.0-3.0mg/kg的單次劑量。為了經(jīng)腸胃外用藥預(yù)防哮喘，根據(jù)病人和狀態(tài)的不同從每天的間隔，但優(yōu)選以從每周兩次到每周一次到每月一次或其它間隔期間優(yōu)選提供0.1至5.0，特別是1.0-3.0mg/kg的這種劑量。同樣，對(duì)于經(jīng)噴霧用藥快速治療哮喘病，可每天吸入單次劑量。對(duì)于預(yù)防，根據(jù)病人和狀態(tài)的不同以每天的間隔，但優(yōu)選以從每周兩次到每周一次到每月一次或以其它間隔期間吸入這一劑量。施用組合物的精確劑量可根據(jù)使用的類型，使用的方式和病人的要求按技術(shù)人員的測(cè)定而變化。用于病人的精確劑量可由技術(shù)人員考慮癥狀的嚴(yán)重性，所用的具體配方和可能包含的其它藥物作具體修改。本發(fā)明的噴霧組合物可以是液體和粉末。它們可以通過(guò)鼻或通過(guò)口(鼻內(nèi)或口腔)用藥。噴霧組合物的一個(gè)例子是可針對(duì)鼻和口的噴霧劑，它由通過(guò)對(duì)TNFR-Ig制品的水或鹽溶液的機(jī)械作用從噴霧器產(chǎn)生。另一個(gè)例子是霧化噴霧劑，其中霧狀物從該溶液產(chǎn)生，然后可有效地被病人吸入(不是直接噴射進(jìn)鼻和口腔)。如果TNFR-Ig是粉末狀的，顆粒應(yīng)足夠大以便保存在呼吸道中而不會(huì)吸入后被病人呼出。根據(jù)用于快速治療或預(yù)防的醫(yī)療方案，該噴霧劑可按對(duì)病人介紹的每天吸入一次或多次或更少的頻率。對(duì)于噴霧用藥，可通過(guò)吸入對(duì)治療或防止如上所述的哮喘有效量的本發(fā)明的TNFR-Ig來(lái)給病人用藥。對(duì)于哮喘，以這種方式使呼吸道受影響的部分(鼻腔，氣管，低級(jí)氣體通道或細(xì)支氣管)接受合適量的TNFR-Ig。本發(fā)明的噴霧劑配方優(yōu)選地按重量比提供從制品的大約0.03％到5.0％，更優(yōu)選大約0.03到0.5％，特別是大約0.1到0.3％。優(yōu)選的噴霧配制品是氣溶膠配制品，一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于噴霧劑，優(yōu)選較低劑量范圍，例如霧化配制品，對(duì)于氣溶膠，優(yōu)選更高的劑量范圍。在本發(fā)明中可使用任何常規(guī)氣溶膠配制品以提供有效量的TNFR-IG制品，優(yōu)選提供上述制品量。通過(guò)當(dāng)病人呼吸時(shí)在病人口腔釋放測(cè)定劑量的氣溶膠霧狀物，將霧狀物吸入口腔并通過(guò)呼吸道進(jìn)入肺來(lái)最有效地施用該制品。如上所述，有效量可一次或幾次以更小的劑量在一天內(nèi)經(jīng)口腔或鼻內(nèi)用藥，對(duì)于快速治療以每天的劑量用藥，對(duì)于預(yù)防以每周至每月的間隔用藥。合適的氣溶膠配制品包括適當(dāng)劑量的藥用活性化合物(例如，TNFR-Ig制品)和有效量的任何常規(guī)氣溶膠推進(jìn)劑。也可包括任何常規(guī)表面活性劑。TNFR-Ig可與作為溶液中的液體或作為粉末(例如，以熟知的方法凍干)的推進(jìn)劑組合。推進(jìn)劑可以是適當(dāng)液化的。在推進(jìn)劑中的可溶的或可分散的那些表面活性劑是更有效的。在推進(jìn)劑中可溶性更大的表面活性劑是最有效的。另外較重要的是，表面活性劑應(yīng)是非刺激性的且無(wú)毒性?？墒褂靡夯幕蚍且夯募夹g(shù)人員已知的用于藥用組合物的可接受的任何常規(guī)推進(jìn)劑。根據(jù)TNFR-Ig是粉末形式還是液體形式，推進(jìn)劑可以是適合于與粉末一起使用的推進(jìn)劑或是適合于與液體活性成分一起使用的推進(jìn)劑。采用的液化推進(jìn)劑可以是在室溫(65°F)和大氣壓(760mm汞柱)下為氣體的推進(jìn)劑，即，在大氣壓下它可具有低于65°F的沸點(diǎn)且無(wú)毒性?？刹捎玫暮线m的液化推進(jìn)劑包括含有多達(dá)5個(gè)碳原子的低級(jí)鏈烷，如丁烷和戊烷。液化推進(jìn)劑的例子是氟化的和氟氯化的低級(jí)鏈烷，如以商標(biāo)“Freon”銷售的推進(jìn)劑?？蛇m當(dāng)采用上述推進(jìn)劑的混合物?，F(xiàn)在已對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了一般性的描述，通過(guò)參考下面的實(shí)施例將更容易理解本發(fā)明，這些實(shí)施例以例證的方式提供并不是打算來(lái)限制本發(fā)明，除非另有說(shuō)明。實(shí)施例實(shí)施例1用于生產(chǎn)TNFR-Ig的編碼TNFR-Ig的質(zhì)粒A．細(xì)胞系用作哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系來(lái)源于CHO-K1(ATCC號(hào)CCL61CHO-K1)。然后使用命名為CHO-K1DUX-B11(DHFR-)的CHO-K1突變型二氫葉酸還原酶(DHFR-)缺陷型細(xì)胞系(獲自哥倫比亞大學(xué)L.Chasin博士；Simonsen,C.C和Levinson,A.D.,(1983)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)80:2495-2499；UrlaubG.,和Chasin,L.,(1980)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)77:4216-4220)通過(guò)用含胰島素原前體cDNA的載體(Sures等；(1980)科學(xué)，208:57-59〕轉(zhuǎn)染獲得胰島素需求減少的細(xì)胞系。命名為dp12.CHO的選擇克隆生長(zhǎng)需要甘氨酸，次黃嘌呤和胸苷，從而證實(shí)它們?yōu)镈HFR-基因型。B．可溶性1型TNFR-IgG1嵌合體的構(gòu)建通過(guò)將人1型TNFR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與IgG1重鏈鉸鏈區(qū)和CH2及CH3結(jié)構(gòu)域的基因融合(下文稱為TNFR1-IgG1)來(lái)構(gòu)建可溶性1型TNFR-IgG1嵌合體。作為選擇，也可使用IgG3重鏈的鉸鏈區(qū)和CH2及CH3結(jié)構(gòu)域。編碼人1型TNFR的DNA序列(見(jiàn)Loetscher等，出處同上)從質(zhì)粒pRF-TNFR[Schall等，細(xì)胞，61,361(1990)]獲得。為構(gòu)建該起始質(zhì)粒，將2.1kb胎盤cDNA克隆(Schall等，出處同上)插入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pRK5中，其構(gòu)建在EP公開(kāi)號(hào)307,247中描述。該cDNA開(kāi)始于Loetscher等所報(bào)道的序列的64位核苷酸處，起始甲硫氨酸位于下游118bp處。IgG1編碼序列的來(lái)源是CD4-IgG表達(dá)質(zhì)粒pRKCD42Fc1[Capon,D.J等，自然，337,525(1989)；Byrn等，自然，344,667(1990)]，該質(zhì)粒含有編碼與人IgG1序列融合的成熟人CD4蛋白質(zhì)1-180殘基(2個(gè)N-末端CD4可變結(jié)構(gòu)域)所組成的雜交多肽的cDNA序列，該IgG1序列在216位天冬氨酸起始(將114位氨基酸作為重鏈恒定區(qū)的第1個(gè)殘基)[Kabat等，免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)序列，第4版(1987)]，即在涉及重-輕鏈結(jié)合的半胱氨酸殘基后的IgG1鉸鏈的第1個(gè)殘基)并于441位殘基終止以包括IgG1的CH2和CH3Fc結(jié)構(gòu)域。也見(jiàn)EP227110。作為選擇，可使用pCD4-Hγ3載體(DSM5523，EP394,827)。通過(guò)SstⅠ酶切去掉CD4cDNA以獲得所需的IgG3序列。通過(guò)產(chǎn)生質(zhì)粒pRK-TNFR和pRKCD42Fc1的限制性片斷并連接它們，使用缺失誘變使成熟TNFR’s的171位蘇氨酸殘基與IgG1重鏈的216位天冬氨酸殘基并列[Kabat等，出處同上]來(lái)構(gòu)建TNFR1-IgG1。所得的質(zhì)粒pRKTNFR-IgG含有TNFR1-IgG1編碼序列的全部長(zhǎng)度。然后可通過(guò)諸如磷酸鈣沉淀的常規(guī)方法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)諸如CHO細(xì)胞的宿主細(xì)胞中?？捎贸Ｒ?guī)方法培養(yǎng)所得的細(xì)胞以表達(dá)TNFR-IgG，然后以常規(guī)方法分離之。實(shí)施例2具有大約每蛋白質(zhì)5-6M.唾液酸，每蛋白質(zhì)0.4-0.45MN-乙酰葡糖胺，5.5-7.5的pI的TNFR-Ig的生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)通過(guò)轉(zhuǎn)染將實(shí)施例1中編碼可溶性1型TNFR-IgG1的基因?qū)雂p12.CHO細(xì)胞中。使用將DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的磷酸鈣技術(shù)來(lái)完成轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染2天后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞并重新涂布到選擇培養(yǎng)基(加了2％的透析血清的無(wú)甘氨酸-次黃嘌呤和胸苷的Ham’sF-12DMEM,1∶1v/v)上。隨后，篩選出分泌TNFR1-IgG1的分離株。在氨甲喋呤中擴(kuò)增的表達(dá)TNFR1-IgG1的克隆在產(chǎn)生高表達(dá)克隆的，隨后調(diào)適到無(wú)血清中培養(yǎng)基。這些細(xì)胞處于連續(xù)選擇壓力下直到轉(zhuǎn)移至非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行接種物的生長(zhǎng)和擴(kuò)增。為了提供產(chǎn)生TNFR1-IgG1的細(xì)胞培養(yǎng)物，上述細(xì)胞種群通過(guò)在不斷增大體積的容器中進(jìn)行系列傳代培養(yǎng)從含氨甲喋呤的培養(yǎng)基擴(kuò)增至不含氨甲喋呤的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。對(duì)于該方法的這些步驟，非選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基是以DMEM/HAMF-12為基礎(chǔ)的配制品(例如，見(jiàn)美國(guó)專利5,122,469)，其中一些成分的濃度有所改變，如，葡萄糖，氨基酸，鹽，糖，維生素，甘氨酸，次黃嘌呤，和胸苷；重組人胰島素，水解蛋白胨(PrimatoneHS或PrimatoneRL)，細(xì)胞保護(hù)劑如PluronicF86(多聚醇)或同等物；慶大霉素；脂類和微量元素。通過(guò)使用CO2氣體(酸)和/或Na2CO3(堿)將培養(yǎng)物控制在pH7.2+/-0.4。細(xì)胞生長(zhǎng)期間溫度控制在37℃左右。通過(guò)直接噴入空氣和/或氧氣使溶解氧維持在空氣飽和度的5％以上。接種物擴(kuò)增期間滲透壓維持在大約250mOsm和350mOsm之間。每次培養(yǎng)的生長(zhǎng)期后是第二期或過(guò)渡期，其中培養(yǎng)參數(shù)從最適生長(zhǎng)改變?yōu)樯a(chǎn)條件。在該過(guò)渡期期間培養(yǎng)系統(tǒng)的溫度一般降低到約30和35℃之間。加入丁酸鹽，從而保證一定的重量摩爾滲透壓濃度范圍。分析在該生產(chǎn)期期間積累的產(chǎn)物的唾液酸含量。在典型的生產(chǎn)程序中，從選擇期的接種物擴(kuò)增產(chǎn)生大約1.2×106個(gè)細(xì)胞，其中在生長(zhǎng)期生長(zhǎng)的起始重量摩爾滲透壓濃度為300-450mOsm，優(yōu)選大約300。生長(zhǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)加微量元素，重組人胰島素和水解蛋白胨。細(xì)胞在此條件下生長(zhǎng)兩天。第3天開(kāi)始時(shí)降低細(xì)胞培養(yǎng)物的溫度。溫度改變的同時(shí)或之后，向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入大約1至6mmol丁酸鈉，優(yōu)選6mmol且通過(guò)加入各種培養(yǎng)基成分保證生產(chǎn)所需的重量摩爾滲透壓濃度。在這些條件下培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)9-10天。當(dāng)需要時(shí)提供細(xì)胞各種培養(yǎng)基成分。高唾液酸化組合物的pI比低唾液酸化組合物的pI低。對(duì)組合物進(jìn)行等電聚焦。等電聚焦凝膠使用不同pH的兩性電解質(zhì)產(chǎn)生的pH梯度根據(jù)其等電點(diǎn)pI將組合物的糖蛋白分離。使用10至4的pH梯度進(jìn)行組合物分析。由層析聚焦測(cè)定上述組合物顯示的等電點(diǎn)范圍為大約5.5至大約7.5，其中pI對(duì)神經(jīng)氨酸酶處理敏感。TNFR-IgG的回收如Capon等自然，337:525,1989所述，可通過(guò)離心細(xì)胞培養(yǎng)物并將所得的培養(yǎng)物上清通過(guò)蛋白A柱來(lái)純化IgG融合蛋白。因此，離心上述獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物并將上清過(guò)蛋白A柱。這種親和層析法通過(guò)如由Capon等，出處同上所述的在固定化金黃色葡萄球菌蛋白A上的TNFR1-Ig制品可純化達(dá)到超過(guò)95％的同質(zhì)性。糖類分析A.唾液酸含量可用Warren,L.(1959)，生物化學(xué)雜志234:1971-1975的方法進(jìn)行分析。B．完整的中性和氨基糖的釋放可通過(guò)高pH陰離子交換層析結(jié)合脈沖安培計(jì)檢測(cè)來(lái)測(cè)定。使用如下的步驟進(jìn)行分析1．用TNFR1-IgG1(大約50μg/ml)和合適的參照樣進(jìn)行緩沖液交換，以使最終樣品包含于1％乙酸中。2．將大約90μgTNFR1-IgG1及參照樣品冷凍于干冰和乙醇浴中，冷凍樣品凍干過(guò)夜。3．凍干樣品在500μl三氟乙酸中重新配制并在120℃溫育1小時(shí)。4．酸水解后冷卻TNFR1-IgG1和參照樣品并蒸發(fā)干燥。5．樣品用水重新配制至終濃度大約為0.6mg/ml。6．通過(guò)使用DionexCarboPacPal(4×250mm)柱(Dionex公司，美國(guó)，加州，圣尼維爾)以脈沖安培計(jì)檢測(cè)的高pH陰離子交換層析在室溫下進(jìn)行單糖的分離。7．通過(guò)與參照單糖進(jìn)行比較確定每份單糖的量。實(shí)施例3．TNFR-Ig的制備1．使用磷酸鈣共沉淀法用質(zhì)粒pSV16B.TNFR-IgG(編碼TNFR1-IgG1)和pFD11(編碼DHFR)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞系DP12(EP307,247)。2．轉(zhuǎn)染獲得的細(xì)胞克隆用含2％滲濾牛血清和100nmol/L氨甲喋呤的選擇培養(yǎng)基擴(kuò)增至9升懸浮培養(yǎng)物。用無(wú)氨甲喋呤的無(wú)血清培養(yǎng)基將兩個(gè)9升培養(yǎng)物接種至100升發(fā)酵罐中。用1000倍的生產(chǎn)培養(yǎng)基洗滌以減少殘留的血清成份后，在將細(xì)胞接種到1000升生產(chǎn)培養(yǎng)容器之前，將100升培養(yǎng)物用無(wú)血清培養(yǎng)基接種進(jìn)400升培養(yǎng)物中。生產(chǎn)培養(yǎng)基為以DMEM/HAMF-12為基礎(chǔ)的配制品，補(bǔ)充有葡萄糖，氨基酸，甘氨酸，次黃嘌呤，胸苷，水解蛋白胨，pluronicF68，慶大霉素，脂類和微量元素。3．生產(chǎn)培養(yǎng)物用CO2氣體和/或Na2CO3維持在pH7.2+或-0.2條件下13天。在細(xì)胞濃度達(dá)到5×106細(xì)胞/ml后，培養(yǎng)溫度從37℃改變到30℃。在第2天和第4天通過(guò)加入培養(yǎng)基成份將培養(yǎng)物的重量摩爾滲透壓濃度調(diào)節(jié)至大約450mOsm/kg。加入丁酸鈉至最終濃度為12mM。通過(guò)向培養(yǎng)物噴入空氣和或氧氣使溶解氧濃度維持在60％氣體飽和度。4．13天后收集培養(yǎng)物，通過(guò)切向流動(dòng)過(guò)濾細(xì)胞從上清液中分離出來(lái)。該收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液(HCCF)用10KD的Maxisette膜濃縮約20倍。通過(guò)加入固體NaCl至1.0M，隨后通過(guò)0.22微米Durapore濾器過(guò)濾來(lái)澄清殘留物并控制其條件以進(jìn)行蛋白A層析。5．過(guò)濾后，將調(diào)耗條件的HCCF通過(guò)固定的蛋白A。上樣物質(zhì)在洗脫前洗滌幾次。TNFR-IgG用0.05M檸檬酸鈉/20％(w/v)甘油，pH3.0逐步洗脫。通過(guò)加入1M檸檬酸鈉將洗脫合并液調(diào)節(jié)為pH5.0。6．調(diào)節(jié)pH后，稀釋蛋白A合并液并上樣到S-SepharoseFastFlow上。樣品經(jīng)沖洗后用0.05MMOPS/0.05MNaClpH7.2分步洗脫。7．分步洗脫后，稀釋S-SepharoseFastFlow合并液，然后上樣到Q-SepharoseFastFlow柱上。使用在0.125MMOPS(pH7.2)中的從0.0125MNaCl至0.125MNaCl的線性梯度洗脫該柱。8．線性梯度洗脫后，通過(guò)加入1體積的0.1乙酸鈉/4.0M尿素/2.0M硫酸銨(pH5.0來(lái)調(diào)節(jié)Q-SepharoseFastFlow合并液，然后上樣到用0.05M乙酸鈉/2.0M尿素/1.0M硫酸銨(pH5.0)平衡過(guò)的苯基Toyopearl650M柱上。在這些條件下TNFR-IgG流過(guò)此柱。樣品隨后用平衡緩沖液沖洗，合并流出液和沖洗液，組成苯基Toyopearl合并液。9．合并兩個(gè)苯基toyophearl合并液并用10KDFiltronCentrassette膜濃縮。濃縮液通過(guò)用0.01M檸檬酸鈉/0.023M甘氨酸/0.023M甘露醇(pH6.0)中平衡過(guò)的G-25柱以產(chǎn)生TNFR-Ig組合物。下述實(shí)施例4-10所描述的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的TNFIg緩解哮喘發(fā)作效應(yīng)。TNF受體融合蛋白可TNFR-Ig明顯減輕，甚至在某些情況下消除過(guò)敏性肺炎動(dòng)物模型中抗原激發(fā)引起的反應(yīng)。TNFR-Ig抑制作用的程度可比得上用廣譜消炎藥地塞米松獲得的程度?？s寫TNFα，腫瘤壞死因子-α；TNFR-Ig，重組的可溶性的TNF受體IgG1融合蛋白；BAL，氣管肺泡灌洗液；OA，卵清蛋白；RL，肺阻力；HBSS,Hanks平衡鹽溶液；物質(zhì)P，一種用于誘導(dǎo)急性支氣管痙攣的神經(jīng)肽，通常在文獻(xiàn)中稱為物質(zhì)P〔例如見(jiàn)Selig和Tocker，歐洲藥物學(xué)雜志213(3):331-336(1992)〕。數(shù)據(jù)分析每次實(shí)驗(yàn)所有數(shù)值均計(jì)算平均+/-SEM值。統(tǒng)計(jì)學(xué)差異通過(guò)兩種方法重復(fù)測(cè)量分析分級(jí)數(shù)據(jù)的方差，隨后通過(guò)使用學(xué)生Newman-Keulst-檢驗(yàn)或通過(guò)學(xué)生t-檢驗(yàn)的多重比較檢驗(yàn)來(lái)測(cè)定。P＜0.05認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著。計(jì)算用在PC機(jī)上運(yùn)行的微軟EXCEL5.0(softmart,Exton,PA,USA)和SigmaStat(JandelScientific,SanRafael,CA,USA)軟件包進(jìn)行。藥物所有藥物均以1mg/kg的劑量用藥。TNFR-Ig按實(shí)施例3所述生產(chǎn)和純化，貯液在檸檬酸鈉(10mM)，甘氨酸(23mM)和甘露醇(230mM)(pH6緩沖液中制備。貯液的等分樣品使用前在-20℃貯存并在無(wú)菌鹽水中進(jìn)行稀釋。下列物品從Sigma化學(xué)公司(St.Louis,MO,USA)購(gòu)買并在無(wú)菌鹽水中配制卵清蛋白，氫氧化鋁，烏拉坦，物質(zhì)P乙酸酯，(+/-)鹽酸普萘洛爾，地塞米松21-磷酸酯和伊文斯蘭。實(shí)施例4用TNFR-Ig緩解豚鼠哮喘癥狀(氣管過(guò)敏反應(yīng))本實(shí)施例使用對(duì)OA產(chǎn)生過(guò)敏的豚鼠，使得隨后接觸OA將誘導(dǎo)氣管過(guò)敏反應(yīng)的哮喘癥狀。該癥狀可被TNFR-Ig緩解，其作用也與地塞米松，一種已知緩解哮喘的類固醇，進(jìn)行了比較。雄性豚鼠在0天(10μg+1mgAl(OH)3于0.5ml鹽水中)的OA，皮下注射)敏化，在第14天后接受同樣劑量的OA作為加強(qiáng)注射。在第21天動(dòng)物用0.1％OA氣溶膠激發(fā)30分鐘。此敏化作用引起豚鼠哮喘樣癥狀，包括對(duì)物質(zhì)P的氣管過(guò)敏。為了測(cè)定TNFR-Ig對(duì)此癥狀的影響，在激發(fā)前施用TNFR-Ig，將其癥狀與未激發(fā)的動(dòng)物進(jìn)行比較且顯示為減輕。使用地塞米松(30mg/kg，腹腔注射，激發(fā)前1小時(shí)和后4小時(shí))對(duì)氣管過(guò)敏得到類似的效果。地塞米松是一種已知的哮喘治療劑。通過(guò)敏化，激發(fā)和治療處理的豚鼠用于如下實(shí)驗(yàn)。敏化重250-300克的雄性Hartley品系豚鼠(CharlesRiver,kingston,NY,USA)在第0天和第14天用單劑皮下注射(10μgOA+1mg氫氧化鋁于0.5ml無(wú)菌鹽水中)積極地對(duì)OA敏化，在第21天和28天之間用于實(shí)驗(yàn)。激發(fā)抗原激發(fā)方案以前已有描述(O’Donnell等，1994)。敏化的動(dòng)物放在有機(jī)玻璃箱中，用0.1％(w/v無(wú)菌鹽水)OA氣溶膠激發(fā)30分鐘。氣溶膠用DeVilbissUltra-Neb100超聲噴霧器(呼吸服務(wù)中心，Ephrata,PA,USA)以內(nèi)置風(fēng)扇驅(qū)動(dòng)的30L/分鐘的氣流速度傳遞。為了使過(guò)敏性反應(yīng)引起的死亡數(shù)降至最小，在最初的5分鐘給藥時(shí)，噴霧器進(jìn)行間隔60秒的開(kāi)關(guān)循環(huán)，在這些條件下動(dòng)物死亡率大約為5％。藥物治療在OA噴霧前18和1小時(shí)，動(dòng)物組或接受載體(見(jiàn)藥物)，或接受TNFR-Ig(1或3mg/kg，腹腔注射)。對(duì)于用地塞米松進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，在OA噴霧前1小時(shí)或之后4小時(shí)動(dòng)物組分別接受載體(鹽水)或地塞米松(30mg/kg，腹膜內(nèi))。根據(jù)初步的觀察結(jié)果確定TNFR-Ig和地塞米松的最佳劑量參數(shù)。本實(shí)施例的結(jié)果表明經(jīng)接觸OA對(duì)OA過(guò)敏的豚鼠在OA激發(fā)后6小時(shí)表現(xiàn)出對(duì)物質(zhì)P(1-10ug/kg靜脈注射)的氣管反應(yīng)增強(qiáng)。對(duì)物質(zhì)P的增強(qiáng)反應(yīng)是哮喘樣敏化的特性，表明豚鼠具有由上述實(shí)驗(yàn)條件誘導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)的哮喘癥狀。過(guò)敏反應(yīng)受TNFR-Ig(3mg/kg，腹膜內(nèi)，激發(fā)前18和1小時(shí))抑制。使用方法如下氣管對(duì)物質(zhì)P的反應(yīng)根據(jù)前述方法(Selig和Tocker,1992)在接觸OA氣溶膠后6小時(shí)的敏化的未激發(fā)的和激發(fā)的豚鼠中測(cè)定。動(dòng)物用烏拉坦(2g/kg，腹膜內(nèi))麻醉，用PE-50導(dǎo)管做頸動(dòng)脈(血壓)和頸靜脈(藥物注射)插管。氣管用15號(hào)針頭插管，動(dòng)物放入整體體積描記器(ModularInstruments,Malvern,PA,USA)中。用琥珀酰氯化膽堿(1.2mg/kg，靜脈注射)抑制自發(fā)呼吸，使用1ml/100g體重的潮氣量和60次呼吸/分鐘的頻率給動(dòng)物機(jī)械通氣(HarvardApparatusModel683；SouthNatick,MA,USA)。體積描記器總體積為2L，動(dòng)物和呼吸裝置間通氣管路的體積是10ml。體積描記器裝配有與Validyne分壓傳導(dǎo)器(DP45-14)相連的Fleisch呼吸速度描記器(Model#0000)用于測(cè)量氣流。通過(guò)連接在氣管插管側(cè)臂和插在第5和第6肋骨間的16號(hào)胸膜內(nèi)針頭之間的第二Validyne傳導(dǎo)器(DP45-28)測(cè)定跨肺壓。用由IBM486DX2PC驅(qū)動(dòng)的ModularInstruments(Malvern,PA,USA)M-3000數(shù)據(jù)獲得系統(tǒng)記錄氣流和跨肺壓。計(jì)算機(jī)根據(jù)AmdurMead(1958)的方法利用常規(guī)軟件(BioReport,ModularInstruments)進(jìn)行肺阻力(RL)的計(jì)算。讀數(shù)以平均10秒多的間隔連續(xù)進(jìn)行。校正RL值作為氣管的內(nèi)部阻力(0.11cm水柱/ml/秒)。動(dòng)物接受心得安(1mg/kg，靜脈注射)并在開(kāi)始施用物質(zhì)P前使其穩(wěn)定10分鐘。通過(guò)以大約5-10分鐘的間隔提供大劑量注射獲得物質(zhì)P(1,3,5和10μg/kg，靜脈注射)的劑量-反應(yīng)效應(yīng)。獲得每個(gè)劑量RL的最大變化并以施用物質(zhì)P前測(cè)定的基礎(chǔ)值的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示。ED200值定義為引起RL升高200％的物質(zhì)P的劑量，通過(guò)對(duì)每個(gè)動(dòng)物對(duì)數(shù)劑量-反應(yīng)曲線的線性回歸進(jìn)行測(cè)定。RL的基礎(chǔ)值為大約0.30cm水柱/ml/秒，組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。敏化的而未激發(fā)的豚鼠對(duì)物質(zhì)P相當(dāng)不敏感，需要30μg/kg的劑量使RL升高至少200％或更大(表1)。相反，OA激發(fā)后，氣管對(duì)物質(zhì)P的反應(yīng)顯著升高。用物質(zhì)P的最大劑量獲得的RL最大值升高大約5倍(表1)時(shí)，ED200值升高大約10倍(表1)。表1TNFR-Ig和地塞米松影響OA敏化的豚鼠對(duì)物質(zhì)Pa的氣管應(yīng)答反應(yīng)的總結(jié)。治療b-logED200c最大應(yīng)答反應(yīng)dne(RL升高％)未受激發(fā)f4.86+/-0.08139+/-286TNFR-Ig載體5.82+/-0.041811+/-22871mg/kg5.87+/-0.011344+/-19563mg/kg5.48+/-0.05*714+/-69*5地塞米松載體5.87+/-0.05935+/-91530mg/kg5.35+/-0.04*596+/-66*6a物質(zhì)P的劑量-反應(yīng)效應(yīng)在用0.1％OA氣溶膠激發(fā)30分鐘后6小時(shí)測(cè)定。檢查氣管對(duì)物質(zhì)P的應(yīng)答反應(yīng)前，用心得安(1mg/kg，靜脈注射)預(yù)處理動(dòng)物10分鐘。b使用1ml/kg的劑量，用各自的載體，TNFR-Ig(OA激發(fā)前18和1小時(shí))或地塞米松(OA激發(fā)前1小時(shí)和之后4小時(shí))經(jīng)腹膜內(nèi)預(yù)處理動(dòng)物。c值代表肺阻力(RL)增加了基礎(chǔ)值的200％所需的物質(zhì)P劑量(以g/kg)的負(fù)對(duì)數(shù)(平均+/-S.EM.值)。d值(平均+/-S.E.M.值)代表由物質(zhì)P(10μg/kg，靜脈注射)引起的基礎(chǔ)RL的升高百分?jǐn)?shù)。e每組動(dòng)物數(shù)。f物質(zhì)P的劑量-反應(yīng)效果曲線在未用OA氣溶膠激發(fā)的敏化動(dòng)物組中測(cè)定。*相應(yīng)載體和藥物處理組之間的值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著(P＜0.05)的差異。給敏化動(dòng)物施用TNFR-Ig(3mg/kg)顯著(P＜0.05)抑制OA誘導(dǎo)的呼吸道對(duì)物質(zhì)P的過(guò)敏反應(yīng)。物質(zhì)P的ED200值降低大約3倍，RL最大值減少大約60％(表1)。較小劑量的TNFR-Ig(1mg/kg)對(duì)物質(zhì)的敏感性無(wú)影響(表1)。在敏化豚鼠中用地塞米松(30mg/kg)處理也以用較大劑量的TNFR-Ig所獲得的相似程度(表1)顯著(P＜0.05)抑制OA誘導(dǎo)的呼吸道過(guò)敏反應(yīng)。實(shí)施例5用TNFR-Ig緩解的豚鼠哮喘癥狀(炎癥細(xì)胞流入)本實(shí)施例使用實(shí)施例4所述的對(duì)OA過(guò)敏的豚鼠以便隨后接觸OA時(shí)將誘導(dǎo)哮喘癥狀，即炎癥細(xì)胞流入。該癥狀被TNFR-Ig緩解，也將其與地塞米松，一種已知緩解哮喘的類固醇，進(jìn)行了比較。如實(shí)施例4中，使雄性豚鼠對(duì)OA敏化且按所述進(jìn)行激發(fā)以誘導(dǎo)哮喘癥狀，包括激發(fā)后6,24,48，和72小時(shí)定量的呼吸道炎癥細(xì)胞累積。如實(shí)施例4中，為了測(cè)定TNFR-Ig對(duì)這些癥狀的影響，在激發(fā)前施用TNFR-Ig，與未激發(fā)的動(dòng)物比較，這些癥狀且顯示出癥狀減輕。也在激發(fā)前施用TNFR-Ig用于炎癥，結(jié)果顯示逆轉(zhuǎn)炎癥細(xì)胞流入。用地塞米松(30mg/kg，腹膜內(nèi)，激發(fā)前1小時(shí)和之后4小時(shí))在6和24小時(shí)獲得對(duì)炎癥細(xì)胞累積的相似影響。使用方法如下在OA激發(fā)后6和24小時(shí)根據(jù)以前所述方法(Selig和Tocker,1992)通過(guò)BAL測(cè)定呼吸道炎癥細(xì)胞流入。簡(jiǎn)單地說(shuō)，豚鼠用烏拉坦(2g/kg，腹膜內(nèi))麻醉，用15號(hào)插管作氣管切口。用3×5ml不含Ca2+和Mg2+的無(wú)菌Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)(Gibco,GrandIsland,NY,USA)灌洗肺。樣品在25℃,200g離心10分鐘，用蒸餾水(1ml,30分鐘)從所得的沉淀中溶開(kāi)血紅細(xì)胞，然后加入10mlHBSS恢復(fù)重量摩爾滲透壓濃度。第二次離心(25℃下，200g,10分鐘)樣品，所得的沉淀重新懸浮于1mlHBSS中。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器從細(xì)胞懸浮液的等分樣品以臺(tái)盼蘭(Sigma化學(xué)公司，St.Louis,MO,USA)排斥法測(cè)定總細(xì)胞數(shù)。為分類細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸浮液的等分樣品在Cytospin中離心(5分鐘，1300rpm；ShandonSouthernInstruments,Sewickey,PA,USA)，涂片，固定，用改良瑞氏染液(Leukostat；FisherScientific,Pittsburgh,PA,USA)染色。在光鏡下分類至少300個(gè)細(xì)胞中采用標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)學(xué)準(zhǔn)則。數(shù)據(jù)表示為BAL細(xì)胞×106/動(dòng)物。用TNFR-Ig處理(1-3mg/kg，腹膜內(nèi)，18和1小時(shí)及1小時(shí)預(yù)處理，對(duì)于BAL，在6和24小時(shí)，分別顯著(P＜0.05)抑制了OA后6和24小時(shí)BAL中中性細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)的累積)。TNFR-Ig(3mg/kg，腹膜內(nèi))也顯著(P＜0.05)減少2個(gè)時(shí)間點(diǎn)BAL的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目，而低劑量(1mg/kg，腹膜內(nèi))無(wú)影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明過(guò)敏原誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中中性粒細(xì)胞成分是由TNF介導(dǎo)的。最明顯的是，在抗原激發(fā)后24小時(shí)，TNFR-Ig幾乎消除了敏化豚鼠的BAL的中性粒細(xì)胞的流入，其中中性粒細(xì)胞數(shù)占BAL中細(xì)胞總數(shù)的大約2％。此外用TNFR-Ig而不是地塞米松處理，在激發(fā)后6小時(shí)，引起豚鼠中性粒細(xì)胞大量下降。通過(guò)TNFR-Ig或類似拮抗劑阻斷TNF，可引起已知的有助于中性粒細(xì)胞回流進(jìn)肺的因素的間接下降。敏化的，未激發(fā)的豚鼠BAL的細(xì)胞組成以前已被描述(Selig和Tocker,1992)。這些動(dòng)物中總的細(xì)胞計(jì)數(shù)平均為大約1×106/動(dòng)物，其中大約2-3％是嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。OA處理后6小時(shí)，在TNFR-Ig或地塞米松的載體處理的動(dòng)物中含有分別含總細(xì)胞計(jì)數(shù)的至少40和20％的嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。BAL中嗜酸性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)在24小時(shí)保持恒定，而中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)則下降至總細(xì)胞數(shù)的大約10％。炎癥細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)在TNFR-Ig和地塞米松的各自載體組之間無(wú)差異(P＞0.05)。炎癥細(xì)胞流入敏化的，激發(fā)的豚鼠BAL也受地塞米松(30mg/kg)的抑制，OA處理后6小時(shí)，BAL中嗜酸性粒細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)有顯著(P＜0.05)的下降，這與TNFR-Ig所引起的情況類似。6小時(shí)時(shí)間點(diǎn)時(shí)對(duì)中性粒細(xì)胞數(shù)無(wú)影響。OA處理后24小時(shí)，BAL中嗜酸性粒細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)被地塞米松顯著(P＜0.05)地抑制。與TNFR-Ig相比，地塞米松處理的動(dòng)物嗜酸性粒細(xì)胞降低大約5倍(P＜0.05)。相反，盡管地塞米松處理降低了BAL中的中性粒細(xì)胞數(shù)，但是在不同細(xì)胞中這些細(xì)胞百分比保持不變(P＞0.05)，為約總細(xì)胞數(shù)的8％。在敏化豚鼠中檢查TNFR-Ig逆轉(zhuǎn)活動(dòng)性炎癥反應(yīng)的能力。使動(dòng)物對(duì)OA敏化，然后如上所述進(jìn)行激發(fā)。OA激發(fā)30分鐘后施用TNFR-Ig(3mg/kg，腹膜內(nèi))。在激發(fā)后24,48和72小時(shí)通過(guò)BAL檢測(cè)炎癥。對(duì)于48和72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，TNFR-Ig每日給藥。激發(fā)后用TNFR-Ig處理明顯逆轉(zhuǎn)敏化豚鼠BAL中炎癥細(xì)胞的流入。實(shí)施例6:TNFR-Ig緩解豚鼠的哮喘癥狀(肺水腫)本實(shí)施例使用實(shí)施例4所述的，對(duì)OA過(guò)敏的豚鼠以便隨后接觸OA將誘導(dǎo)哮喘癥狀，即肺水腫。該癥狀被TNFR-Ig緩解，也將其與地塞米松，一種已知緩解哮喘的類固醇，進(jìn)行了比較。如實(shí)施例4中，使雄性豚鼠對(duì)OA敏化且按所述進(jìn)行激發(fā)以誘導(dǎo)哮喘癥狀，包括在激發(fā)后6小時(shí)定量的水腫。如實(shí)施例4中，為了測(cè)定TNFR-Ig對(duì)這些癥狀的影響，激發(fā)前施用TNFR-Ig，將這些癥狀與未激發(fā)的動(dòng)物進(jìn)行比較并表明有所減輕。使用方法如下OA處理后6小時(shí)使用以前所述的方法(Wasserman等，前列腺素，血栓烷，白三烯研究進(jìn)展，23:271-273,1995)以伊文斯蘭染色液外滲法定量作為肺水腫標(biāo)志的呼吸道毛細(xì)血管滲漏。豚鼠用烏拉坦(2g/kg，腹膜內(nèi))麻醉并作頸靜脈插管。然后動(dòng)物接受在60秒期間內(nèi)給藥的伊文斯蘭染色液(30mg/kg，靜脈注射)。10分鐘后打開(kāi)胸腔并將導(dǎo)管(PE-240管)通過(guò)左心室插入主動(dòng)脈。交叉夾住心室，切開(kāi)右心房并通過(guò)使用藥筒泵(Masterflex；Cole-Parmer,Chicago,IL,USA)用100ml鹽水以100ml/分鐘的速度灌注動(dòng)物來(lái)排出血液。通過(guò)在肺動(dòng)脈內(nèi)插管并切開(kāi)左心房，再用50ml鹽水灌注肺循環(huán)。整體取出肺，切下氣管(末端5mm)和主支氣管，在濾紙間吸干并稱重。在甲酰胺中提取伊文斯蘭染料(37℃,24小時(shí))并通過(guò)用分光光度計(jì)(BeckmanInstrumentsModelDU-64,Somerset,NJ,USA)在620nm下測(cè)吸光率進(jìn)行定量。組織染料含量由伊文斯蘭染料濃度(0.5-10μg/ml)標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得并以ng/mg組織濕重來(lái)表示。使用伊文斯蘭染料作為氣管毛細(xì)血管滲透標(biāo)記時(shí)，敏化的，未激發(fā)的豚鼠氣管和主支氣管的基礎(chǔ)值平均為10-20ng/mg組織濕重。OA激發(fā)后6小時(shí)，氣管和主支氣管中伊文斯蘭染料含量升高了大約5倍。用TNFR-Ig(1或3mg/kg)或地塞米松(30mg/kg)處理在激發(fā)后6小時(shí)減弱了(P＜0.05)氣管和主支氣管中OA誘導(dǎo)的呼吸道滲透。TNFR-Ig(1或3mg/kg.腹膜內(nèi))消除了敏化豚鼠氣管和主支氣管中OA誘導(dǎo)的呼吸道水腫(以伊文斯蘭染料的組織含量來(lái)定量)。實(shí)施例7用TNFR-Ig緩解褐色挪威大鼠哮喘癥狀與實(shí)施例4中使用的豚鼠相似，在大鼠中誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞積累(一種哮喘癥狀)并用TNFR-Ig治療。本模型與豚鼠的區(qū)別在于褐色挪威大鼠的過(guò)敏反應(yīng)由IgE介導(dǎo)。使用方法如下使雄性褐色挪威大鼠在第0,1和2天對(duì)OA(1mgOA+100mgAl(OH)3溶于0.5mg鹽水中，腹膜內(nèi))敏化。在第21天，用1％OA氣溶膠激發(fā)動(dòng)物30分鐘。激發(fā)后24小時(shí)以BAL來(lái)定量炎癥細(xì)胞積累。敏化，激發(fā)和BAL的方案相似于上文對(duì)豚鼠所述，但有如下例外。體重200至250g的雄性褐色挪威大鼠(CharlesRiver,Kingston,NY)在第1,2,3天用單劑腹膜內(nèi)注射(1mgOA+100mg氫氧化鋁溶于1ml無(wú)菌鹽水中)激活其對(duì)OA敏化用于在第21天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(Elwood等，1992)。OA噴霧前1小時(shí)，各組大鼠分別接受各自的載體，TNFR-Ig(1或3mg/kg，腹膜內(nèi))或地塞米松(0.3mg/kg，腹膜內(nèi))。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，大鼠用1％OA氣溶膠激發(fā)30分鐘。激發(fā)后24小時(shí)，通過(guò)用2×1ml/100g的HBSS灌洗肺來(lái)進(jìn)行BAL。用0.5ml蒸餾水溶解紅細(xì)胞，用5mlHBSS恢復(fù)重量摩爾滲透壓濃度。用TNFR-Ig(3mg/kg，腹膜內(nèi)，激發(fā)前1小時(shí))處理上述大鼠基本上消除了BAL中中性粒細(xì)胞的積累并引起嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)顯著下降。用地塞米松(0.3mg/kg，腹膜內(nèi)，激發(fā)前l(fā)小時(shí))獲得類似的結(jié)果。較低劑量的TNFR-Ig(1mg/kg，腹膜內(nèi))也明顯降低了BAL中的中性粒細(xì)胞數(shù)，但對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)無(wú)影響。更詳細(xì)地說(shuō)，敏化的，未激發(fā)的褐色挪威大鼠在BAL中總細(xì)胞計(jì)數(shù)基礎(chǔ)值為大約1×106/動(dòng)物，其中按比例1-2％是嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。OA激發(fā)后24小時(shí)，載體處理的動(dòng)物BAL中細(xì)胞總數(shù)升高了大約3倍，其中嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分別占細(xì)胞總數(shù)的至少40％和25％。BAL中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)和總細(xì)胞數(shù)在各自載體處理組之間無(wú)差異(P＞0.05)。用TNFR-Ig(3mg/kg，腹膜內(nèi))或地塞米松(0.3mg/kg，腹膜內(nèi))處理都以相似的程度顯著(P＜0.05)降低了BAL中嗜酸性粒細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)的積累。用較低劑量的TNFR-Ig(1mg/kg，腹膜內(nèi))處理也顯著(P＜0.05)抑制了BAL中中性粒細(xì)胞數(shù)，但對(duì)BAL中嗜酸性粒細(xì)胞或總細(xì)胞數(shù)的積累無(wú)影響。實(shí)施例8受傷大鼠肺中中性粒細(xì)胞的減少Sephadex(葡聚糖凝膠)顆粒誘導(dǎo)的大鼠肺炎模型顯示肺中嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)上升及肉芽腫形成，這與慢性哮喘中所見(jiàn)的近似。該模型用于顯示TNFR-Ig緩解此慢性癥狀。使用方法如下通過(guò)施用Sephadex(葡聚糖凝膠)顆粒懸液(7.5mg/kg,.iv.)在雄性Sprague-Dawley大鼠中誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞向肺中的累積。施用Sephadex(葡聚糖凝膠)后24小時(shí)和72小時(shí)，在BAL液中白細(xì)胞總數(shù)顯著升高。在24小時(shí)時(shí)，中性粒細(xì)胞數(shù)占白細(xì)胞總數(shù)的50％左右，到72小時(shí)時(shí)則下降到總數(shù)的10％左右。嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)維持在白細(xì)胞總數(shù)的10％左右。用TNFR-Ig(1和3mg/kg,.ip.,激發(fā)前1小時(shí))或地塞米松(0.1和0.3mg/kg，腹膜內(nèi))預(yù)處理在施用Sephadex(葡聚糖凝膠)后24小時(shí)抑制中性粒細(xì)胞，盡管TNFR-Ig對(duì)細(xì)胞總數(shù)無(wú)明顯影響。施用Sephadex(葡聚糖凝膠)后72小時(shí)，TNFR-Ig(1和3mg/kg，腹膜內(nèi)，每日)明顯減少流入BAL液的中性粒細(xì)胞，但對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)無(wú)抑制作用。相反，地塞米松(0.1和0.3mg/kg，腹膜內(nèi)，每日)基本上消除中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞向BAL液的滲入。TNFR-Ig(1和3mg/kg，腹膜內(nèi))或地塞米松(0.1和0.3mg/kg，腹膜內(nèi))在72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)明顯減少總細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)施例9靈長(zhǎng)類特異反應(yīng)性哮喘的緩解采用對(duì)Ascarissuum抗原表現(xiàn)出天然呼吸道敏感的野外捕捉的彌猴建立的特異反應(yīng)性哮喘靈長(zhǎng)類模型用于證明TNFR-Ig緩解哮喘癥狀呼吸道過(guò)敏反應(yīng)的效應(yīng)。重復(fù)接觸抗原誘導(dǎo)呼吸道的哮喘癥狀，尤其是增加了肺阻力(RL)。當(dāng)用TNFR-Ig處理時(shí)猴子顯示RL下降。當(dāng)給予重復(fù)接觸A.suum抗原時(shí)，野外捕捉的野生蛔蟲(chóng)屬敏感型彌猴顯示了增強(qiáng)的對(duì)吸入的乙酰甲膽堿的呼吸道反應(yīng)和增多了呼吸道嗜酸性粒細(xì)胞。因此使用該抗原誘導(dǎo)在這些猴中的過(guò)敏反應(yīng)和隨后產(chǎn)生的哮喘癥狀的呼吸道過(guò)敏反應(yīng)性。下列方案用于檢查TNFR-Ig對(duì)呼吸道過(guò)敏反應(yīng)的影響。第1天測(cè)定一種類似物質(zhì)P的氣管痙攣誘導(dǎo)劑乙酰甲膽堿(MCh)的劑量，其產(chǎn)生了100％(PC100)的升高的肺阻力(RL)。第3天用產(chǎn)生至少加倍的RL的一個(gè)蛔蟲(chóng)屬抗原吸入劑量激發(fā)猴子。第5天和第8天重復(fù)第3天的實(shí)驗(yàn)。第10天重復(fù)第1天的實(shí)驗(yàn)，測(cè)定第1天和第10天之間PC100對(duì)數(shù)值的變化。在第1,3,5和8天施用TNFR-Ig(3mg/kg，靜脈注射)減弱了呼吸道對(duì)MCh的過(guò)敏反應(yīng)。實(shí)施例10:TNFR-Ig緩解小鼠過(guò)敏性呼吸道炎癥使用OA誘導(dǎo)小鼠過(guò)敏性肺炎的鼠類模型證明TNFR-Ig減輕炎癥細(xì)胞流入的哮喘癥狀。反復(fù)接觸OA的敏變化小鼠逐漸形成呼吸道過(guò)敏且BAL中嗜酸性粒細(xì)胞流入增加。此模型與IgE水平升高相聯(lián)系且表現(xiàn)出典型的Th2細(xì)胞因子特征(如IL-4和IL-5水平升高)。在本模型中評(píng)價(jià)了TNFR-Ig減弱活動(dòng)性過(guò)敏炎癥反應(yīng)的能力。過(guò)敏性肺炎的鼠類模型與靈長(zhǎng)類相似，為誘導(dǎo)呼吸道過(guò)敏反應(yīng)和炎癥細(xì)胞流入，需要敏化的動(dòng)物多次接觸過(guò)敏原。雌性C57BL/6小鼠在第0天用OA(10μg，含1mgAl(OH)3凝膠，0.1ml，腹膜內(nèi))敏化，然后，從第14-20天，每天用1％OA氣溶膠激發(fā)30分鐘。呼吸道對(duì)MCh的過(guò)敏反應(yīng)和BAL在最后一次OA激發(fā)后24小時(shí)完成。固定一些來(lái)自敏化的，激發(fā)的肺用于組織學(xué)檢查，其它被勻漿用于測(cè)定TNF水平。在敏化的，激發(fā)的小鼠中炎癥細(xì)胞累積和TNF水平在用OA氣溶膠最后一次激發(fā)(第20天)后達(dá)到高峰。本實(shí)驗(yàn)中，在最后一次接觸OA后立即施用TNFR-Ig(3mg/kg，腹膜內(nèi))。TNFR-Ig減弱了OA誘導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)，但對(duì)BAL中炎癥細(xì)胞流入無(wú)影響。在激發(fā)期間每日施用TNFR-Ig對(duì)BAL細(xì)胞計(jì)數(shù)也無(wú)影響。然而施用TNFR-Ig(3mg/kg，腹膜內(nèi)，第20天)明顯減少了敏化的，激發(fā)的小鼠肺組織中的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)且清除了肺組織中的TNF水平。實(shí)施例11氣溶膠組合物下面是含有本發(fā)明的TNFR-Ig制品的實(shí)施例實(shí)施例A-氣溶膠TNFR-Ig(顆粒大小范圍1-5微米)3.0％Span85(脫水山梨醇三油酸酯)1.0氟利昂11(三氯單氟甲烷)30.0氟利昂114(二氯四氟乙烷)41.0氟利昂12(二氯二氟甲烷)25.0實(shí)施例B-氣溶膠TNFR-Ig0.5％Span850.5％推進(jìn)劑B199.0％1推進(jìn)劑B由10％氟利昂11,50.4％氟利昂114,31.5％氟利昂12，和8.0％丁烷組成。實(shí)施例C-氣溶膠TNFR-Ig1.00％Span850.25％氟利昂115.0％氟利昂W193.75％1氟利昂W由61.5％氟利昂114和38.5％氟利昂12組成。實(shí)施例D-氣溶膠TNFR-Ig0.50％Span850.50％推進(jìn)劑(C)199.0％1推進(jìn)劑C由30.0％氟利昂11和70％氟利昂W組成。實(shí)施例E-氣溶膠TNFR-Ig0.88％硫酸鈉(無(wú)水)，粉末0.88％Span851.00％推進(jìn)劑，由50％氟利昂12，97.24％25％氟利昂11，和25％氟利昂114組成實(shí)施例F-氣溶膠TNFR-Ig0.06％Span850.05％氟利昂1120.0％氟利昂12/氟利昂114(20/80)78.9％實(shí)施例12注射組合物下面是含有本發(fā)明的TNFR-Ig制品的注射組合物的一個(gè)例子。成份每ml含有TNFR-IgG1*無(wú)水檸檬酸，USP1.92mg甘氨酸，USP1.70mg甘露醇，無(wú)熱源，USP41.90mg氫氧化鈉適量，pH6.0鹽酸適量，pH6.0注射水，USP適量，至1.0ml***本配方中使用的TNFR-IgG1濃度可以是1.0mg/ml至20mg/ml。該配方中TNFR-IgG1的最終量以每瓶的組合物濃度和體積為基礎(chǔ)來(lái)選擇。**通過(guò)凍干轉(zhuǎn)移．1mg藥瓶(用1.0mg/ml配方1ml)2.5mg藥瓶(用2.5mg/ml配方1ml)5.0mg藥瓶(用5.0mg/ml配方1ml)10mg藥瓶(用5.0mg/ml配方2ml)10mg藥瓶(用10.0mg/ml配方1ml)20mg藥瓶(用8.0mg/ml配方2.5ml)20mg藥瓶(用5.0mg/ml配方4ml)50mg藥瓶(用20mg/ml配方2.5ml)參考文獻(xiàn)Ackerman,V.,Marini,M.,Vittori,E.,Bellini,A.,Vassali,G.,和Mattoli,S。哮喘病人支氣管活檢標(biāo)本中細(xì)胞因子及其細(xì)胞來(lái)源的檢測(cè)。呼吸道過(guò)敏反應(yīng)的特異反應(yīng)狀況，癥狀和水平的關(guān)系。胸科105(3):687-96,1994。Amdur,M.O.和Mead,J。未麻醉豚鼠呼吸機(jī)制。美國(guó)生理學(xué)雜志192:364-372,1958。Amrani,Y.,Martinet,N.和Bronner,C。人氣管平滑肌中腫瘤壞死因子α增強(qiáng)緩激肽和氯化氨甲酰膽堿誘導(dǎo)的鈣信號(hào)。英國(guó)藥理學(xué)雜志114(1):4-5,1995。Anderson,JA.,Miller,F.N.,Sims,D.E.和Edwards,M.J。腫瘤壞死因子不依賴于中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞引起毛細(xì)血管蛋白質(zhì)滲漏。外科研究雜志56(6):485-90,1994。Ashkenazi,A.,Marsters,S.A.,Capon,D.J,Chamow,S.M.,Figsri,I.S.,Pennica,D.Goeddel,D.V.,Palladino,MA.和Smith,D.H。腫瘤壞死因子受體免疫粘連蛋白防止內(nèi)毒素休克。美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)88:10535-10539,1991。Bloemen,P.G,vandenTweel,M.C.,Henricks,P.A.,Engels,F.,Wagenaar,S.S.,Rutten,A.A.和Nijkamp,F.P。人支氣管上皮細(xì)胞粘連分子的表達(dá)和調(diào)節(jié)。美國(guó)呼吸細(xì)胞分子生物學(xué)雜志9(6):586-593,1993。Boschetto,P.,Rogers,D.F.,Fabri,L.M.,和Bames,P.J.。呼吸道毛細(xì)血管滲漏的coritcosteroid抑制。美國(guó)呼吸道疾病回顧143(3):605-609,1991。Bradding,P.,Roberts,JA.,Britten,K.M.,Montefort,S.,Djukanovic,R.,Mueller,R.,Heusser,C.H.,Howarth,P.H.和Holgate,S.T。正常和哮喘呼吸道中的白細(xì)胞介素-4,-5和-6及腫瘤壞死因子-α證明人肥大細(xì)胞是這些細(xì)胞因子的來(lái)源。美國(guó)呼吸細(xì)胞分子生物學(xué)雜志10(5):471-480,1994。Broide,D.H.,Lotz,M.,Cuomo,A.J.,Coburn,D.A.,Federman,E.C.和Wasserman,S.I。癥狀性哮喘呼吸道中的細(xì)胞因子。過(guò)敏反應(yīng)臨床免疫學(xué)雜志89(5):958-967,1992。Cembrzynska-Nowak,M.,Szklarz,E.,Inglot,A.D.和Teodorczyk-Injeyan,JA。支氣管哮喘患者支氣管毛細(xì)血管白細(xì)胞促進(jìn)腫瘤壞死因子α和r-干擾素的釋放。美國(guó)呼吸道疾病回顧147(2):291-295,1993。Costa,J.J.,Matossian,K.,Resnick,M.B.,Beil,W.J.,Wong,D.T.,Gordon,J.R.,Dvorak,A.M.,Weller,P.F.和GAlli,S.j。人嗜酸性粒細(xì)胞能表達(dá)細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α和吞噬炎癥蛋白-1α。臨床研究雜志91(6):2673-2684,1993。Cromwell,O.,Hamid,Q.,Corrigan,C.J.,Barkans,J.,Meng,Q.,Collins,P.D.和Kay,A.B。支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)和產(chǎn)生白細(xì)胞介素-8,IL-6和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子及IL-1b和腫瘤壞死因子α的增強(qiáng)。免疫學(xué)77:330-337,1992。Devalia,J.L.,Campbell,A.M.,Sapsford,R.J.,Rusznak,C.,Quint,D.,Godard,P.,Bousquet,J.和Davies,R.J。體外二氧化氮對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)的炎癥細(xì)胞因子合成的影響。美國(guó)呼吸細(xì)胞分子生物學(xué)雜志9(3):271-278,1993。Elwood,W.,Lotvall,J.O.,Barnes,P.J.和Chung,K.F。地塞米松和環(huán)孢A對(duì)過(guò)敏原誘導(dǎo)的敏化褐色挪威大鼠呼吸道過(guò)敏反應(yīng)和炎癥細(xì)胞反應(yīng)的影響。美國(guó)呼吸病回顧145(6):1289-1294,1992。Finotto,S.,Ohno,I.,Marshall,J.S.,Gauldie,J.,Denburg,JA.,Dolovich,J.,Clark,DA.和Jordana,M。上呼吸道炎癥(鼻息肉病)嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子α。免疫學(xué)153(5):2278-2289,1994。Gater,P.R.,Wasserman,MA.,Paciorek,p.M..和Renzetti,L.M。TNFR-Ig,腫瘤壞死因子受體融合蛋白對(duì)Sephadex誘導(dǎo)的大鼠肺損傷的抑制。美國(guó)呼吸細(xì)胞分子生物學(xué)雜志1996(待出版)。Gordon,J.R和Galli,S.J。肥大細(xì)胞作為先天的和免疫學(xué)可誘導(dǎo)的TNFα/惡質(zhì)病的來(lái)源。自然(倫敦)，346:274-276,1990。Gosset,P.,Tsicopoulos,A.,Wallaert,B.,Vannimenus,C.,Joseph,M.,Tonnel,A.B.和Capron,A。與延遲哮喘反應(yīng)形成相連續(xù)的肺泡巨噬細(xì)胞增加了腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素-6的分泌。過(guò)敏反應(yīng)臨床免疫學(xué)雜志88:561-571,1991。Gosset,P.,Tsicopoulos,A.,Wallaert,B.,Joseph,M.,Capron,A.和TonnelA.B。依賴IgE刺激后，過(guò)敏哮喘病人單核吞噬細(xì)胞腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素-6的產(chǎn)生。美國(guó)呼吸道疾病回顧146:768-774,1992。Gundel,RH.,Wegner,C.D.,Torcellini,CA.和Letts,L.G。慢性氣管炎細(xì)胞間粘連分子-1的作用。臨床實(shí)驗(yàn)過(guò)敏反應(yīng)，22(5):569-574,1992。Kips,J.C.,Tavernier,J.和Pauwels,R.A。腫瘤壞死因子引起大鼠支氣管過(guò)敏反應(yīng)。美國(guó)呼吸道疾病回顧145(2):332-336,1992。Kwon,O.J.,Au,B.T.,Collins,P.D.,Adcock,I.M.,Mak,J.C.,Robbins,R.R.,Chung,K.F.和Barnes,P.J。腫瘤壞死因子誘導(dǎo)培養(yǎng)的人呼吸道上皮細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞介素-8。美國(guó)生理學(xué)雜志267(4):L398-405,1994。Lesslauer,W.,Tabuchi,H.,Reiner,G.,brockhaus,M.,Schlaeger,E.J.,Grau,G.,Piguet,P.F.,Pointaire,P.,Vassali,P.和Loetscher,H。重組可溶性腫瘤壞死因子受體蛋白保護(hù)小鼠抵抗脂多糖誘導(dǎo)的致死。歐洲免疫學(xué)雜志21(11):2883-2886,1991。Levine,S.J.,Larivee,P.,Logun,C.,Angus,C.W.,Ognibene,F.P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