專利名稱：各試驗(yàn)化合物物種的具有預(yù)定頻率的組合文庫(kù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于在固相支持物上合成的試驗(yàn)化合物物種的組合文庫(kù)領(lǐng)域。組合文庫(kù)是由隨機(jī)選擇的亞單位組成的多種化合物的集合體。所說的文庫(kù)是有用的，因?yàn)榭蓪?duì)它們進(jìn)行篩選以鑒別興趣受體的配體。更具體地說，本發(fā)明涉及當(dāng)固相支持物是易于形成進(jìn)一步可分的片段時(shí)的用于構(gòu)建這樣的文庫(kù)的方法。
2.發(fā)明背景在用于產(chǎn)生新的藥學(xué)上的榜樣(lead)的現(xiàn)代方法中，組合化學(xué)技術(shù)贏得了廣泛的接受(Gallop，M.A等，1994，藥物化學(xué)雜志，371233-1251；Gordon，E.M等，1994，藥物化學(xué)雜志，371385-1401.)。正在使用的一種組合方法基于以下策略合成在固相支持物的每個(gè)粒子上包含一種不同結(jié)構(gòu)的文庫(kù)；使文庫(kù)與可溶性受體相互作用；鑒別與大分子靶相互作用的‘小珠’；確定鑒別的小珠所具有的結(jié)構(gòu)(Lam，K.S等，1991，自然，35482-84)。另一種這樣的方法是從固相支持物上順序釋放限定等分樣的化合物；爾后在溶液中測(cè)定活性；鑒別活性化合物從中釋放的粒子；通過直接測(cè)序(Salmon，S.E等，1993，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)，9011708-11712)或通過閱讀其密碼(Kerr，J.M等，1993，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志，1152529-2531；Nikolaiev，V等，1993，肽研究，6161-170；Ohlmeyer，M.H.J等，1993，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)，9010922-10926)闡明其結(jié)構(gòu)。
可使用首先由Furka描述的(Furka等，1988，藥物化學(xué)第五次國(guó)際專題研討會(huì)，1988，布達(dá)佩斯；Furka等，1988，第14次國(guó)際生物化學(xué)大會(huì)，1988，布拉格；Furka等，1991，國(guó)際肽蛋白質(zhì)研究雜志，37487-493)產(chǎn)生等摩爾混合物肽的簡(jiǎn)單的原理合成可溶性隨機(jī)組合文庫(kù)。用于反復(fù)篩選的可溶性文庫(kù)的構(gòu)建也已有描述(Houghten，R.Aal.1991，自然，35484-86)。K.S.Lam公開了使用不溶性隨機(jī)組合文庫(kù)的新的和意外有用的技術(shù)。Lam在固相支持物上合成了隨機(jī)組合文庫(kù)，這樣每種支持物上有一種單一分子結(jié)構(gòu)的試驗(yàn)化合物，而且，他還通過固相結(jié)合方案篩選了沒有預(yù)先從固相支持物除去試驗(yàn)的化合物的文庫(kù)(Lam，K.S等，1991，自然，35482-84)。
然而，當(dāng)合成了隨機(jī)組合文庫(kù)后，僅僅在用于合成的粒子數(shù)目至少比合成的結(jié)構(gòu)數(shù)目高一個(gè)數(shù)量級(jí)的情況下，所有可能的結(jié)構(gòu)的重現(xiàn)才有可能完成(Burgess，K.等，1994，藥物化學(xué)雜志，372985-2987)。
對(duì)于文庫(kù)構(gòu)建，需要的是在限定數(shù)目的固相粒子上進(jìn)行合成，固相粒子的數(shù)目確切地與組成文庫(kù)的化合物的數(shù)目相匹配。該數(shù)目通常是在每個(gè)預(yù)定數(shù)目的“隨機(jī)化”位置上亞單位類型數(shù)的數(shù)目的結(jié)果。例如，每個(gè)位置可由五類亞單位的一種占據(jù)的三個(gè)位置(三體)的文庫(kù)中有5×5×5＝125個(gè)物種。對(duì)于這種理想的狀態(tài)，我們能消除通過分裂和混合方法產(chǎn)生的文庫(kù)的統(tǒng)計(jì)不確定性。然后文庫(kù)的分析可在不“丟失”活性化合物或檢測(cè)同一結(jié)構(gòu)若干次進(jìn)行，這種分析在小文庫(kù)的情況下尤其有利(十個(gè)到一千種結(jié)構(gòu)的范圍)，其中經(jīng)常只發(fā)現(xiàn)一種活性化合物(參見，例如，(Stankova，M等，1994，藥物開發(fā)研究，33146-156))。這樣，在合成組合文庫(kù)的領(lǐng)域中需要按預(yù)定的次數(shù)合成具有每一潛在物種的文庫(kù)(優(yōu)選的是一次)的方法。
3.發(fā)明概述本發(fā)明包括在固相支持物(通過切割易于而可連續(xù)地形成分開的(separate)片段的基質(zhì))上制備組合文庫(kù)的方法。組合文庫(kù)的試驗(yàn)化合物由各種位置上的亞單位組成。組合文庫(kù)的試驗(yàn)化合物物種(species of testcompound)通過在試驗(yàn)化合物的每個(gè)位置由亞單位逐步添加合成。亞單位選自那個(gè)位置的一類亞單位。按照本發(fā)明，在逐步添加之前，把支持物基質(zhì)分割成相等于那一步添加的亞單位類型數(shù)目的片段。這一步驟可重復(fù)進(jìn)行，直到支持物基質(zhì)片段小得無法分割。
按照本發(fā)明的方法，操作者可構(gòu)建具有預(yù)定數(shù)目的物種和預(yù)定數(shù)目的片段(pieces)的固相支持物的組合文庫(kù)。在文庫(kù)中，僅有一種試驗(yàn)的化合物連接到任何固相支持物的一個(gè)片段上。按照本發(fā)明構(gòu)建的文庫(kù)包含在預(yù)定數(shù)目片段的固相支持物上的各預(yù)定的試驗(yàn)化合物物種。在一個(gè)更為理想的實(shí)施方案中，每一試驗(yàn)化合物物種存在于唯一的一個(gè)支持物上。
本發(fā)明不同于以前使用的合成組合文庫(kù)的方法，因?yàn)楸景l(fā)明的方法使用了預(yù)定的分割方案來代替混合和再次隨機(jī)分配的步驟。這樣，這些文庫(kù)稱為“非隨機(jī)”或“定向”文庫(kù)。
可以設(shè)計(jì)分割方法以便產(chǎn)生的片段肉眼可辨，例如，具有不同的長(zhǎng)度、寬度，或者在片段為平面的情況下，它們的側(cè)面和末端會(huì)形成不同的形狀。通過亞單位類型的逐步添加的配位，就可鑒別支持物的肉眼可辨的特征和亞單位的類型。
4.附圖簡(jiǎn)述

圖1定向文庫(kù)合成的總的圖解。具有三個(gè)位置的文庫(kù)例子在每個(gè)步驟中由兩種氨基酸隨機(jī)化，產(chǎn)生八種三肽文庫(kù)。
圖2在棉線上125種四肽混合物模型文庫(kù)的合成圖解。
圖32888種五肽膜文庫(kù)的合成圖解?！皀”＝在特定位置上隨機(jī)化的氨基酸的數(shù)目。
5.發(fā)明詳述本文使用的試驗(yàn)化合物物種可以是單一限定的分子結(jié)構(gòu)。另外，試驗(yàn)化合物物種可以是限定分子的混合物的基元物種(motif species)，其中多亞單位物種存在于這種試驗(yàn)化合物物種的一個(gè)或多個(gè)位置上?；膸?kù)是其中試驗(yàn)化合物物種是基元物種的組合文庫(kù)。當(dāng)構(gòu)建基元文庫(kù)時(shí)，本文使用的術(shù)語“亞單位的類型”指亞單位的化學(xué)物種或者指亞單位物種的有限的混合。關(guān)于基元文庫(kù)，試驗(yàn)化合物物種的位置(其中添加了混合的亞單位物種)稱為“混合位置”。與隨機(jī)組合文庫(kù)的命名法相一致，基元文庫(kù)或非基元文庫(kù)的試驗(yàn)化合物物種位置(其中存在一種亞單位)稱為“隨機(jī)位置”，除了文庫(kù)的所有物種在一個(gè)給定的位置有相同的亞單位物種之外，在這種情況下其中位置稱為不變量或固定位置?；膸?kù)在1994年5月20日提交的未決專利申請(qǐng)08/246,435中描述，本文一并參考。
為使得可以進(jìn)行連接到支持物基質(zhì)上的試驗(yàn)化合物物種的合成，提供了一種連接物(linking means)。連接物對(duì)亞單位的連接可有多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，亞單位是具有可移動(dòng)的保護(hù)基的雙功能亞單位；氨基酸是熟悉的例子。在這種情況下試驗(yàn)化合物是聚合物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，連接物包含多個(gè)正交封閉(orthogonallyblocded)反應(yīng)位點(diǎn)，其被稱為支架(scaffolds)。在這個(gè)實(shí)施方案中，亞單位提供了支架的取代基。這樣，試驗(yàn)化合物物種是替代支架的物種。在支架的每一點(diǎn)添加的亞單位可以是雙功能或單功能的，連接到支架反應(yīng)位點(diǎn)的取代基可由一種或多種亞單位組成。
按照本發(fā)明，取代支架的文庫(kù)的雙功能和單功能亞單位以及聚合物文庫(kù)的雙功能亞單位可以通過許多化學(xué)鍵連接到增長(zhǎng)的試驗(yàn)化合物上，下列是一些非限制性的例子酰胺鍵、酯鍵、脲鍵、氨基甲酸乙酯鍵、碳-碳酰鍵、碳-氮鍵、碳-碳單鍵、烯烴鍵、硫醚鍵以及二硫鍵。支架中的試驗(yàn)化合物和非肽聚合物文庫(kù)的產(chǎn)生化學(xué)在1994年5月24日提交的未決專利申請(qǐng)08/249,830中描述，本文一并參考。
肽的固相合成通常在串珠狀的聚合物上進(jìn)行(Merrifield，R.B.，1963，美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志，852149-2154)，然而，可以使用固相支持物的替代形式。固相支持物包括膜(Daniels，S.B等，1989，TetrahedronLett.304345-4348)、紙片(Frank，R.，1992，Tet rahedron，489217-9232；Frank，R.和R.Doring，1988，Tetrahedron，4460316040)或棉(Eichler，J.和R.A.Houghten，1993，生物化學(xué)，3211035-11041；Lebl，M.和J，Eichler，1989，肽研究，2232-235)。多個(gè)合成技術(shù)的回顧參見Frank，R.，1993，Bioorg.Med.Chem.Lett.3425430；J ung，G.和A.G.Beck-Sickinger，1992，Angew.Chem.T.Ed.Engl.31367-383。先前用棉進(jìn)行的試驗(yàn)(Eichler，J.等，1991，肽研究，4296-307)導(dǎo)致選擇棉線作為一種合成“定向”或“非隨機(jī)”文庫(kù)的實(shí)驗(yàn)固相支持物。這種文庫(kù)的簡(jiǎn)單原理在圖1中說明。連續(xù)的支持物被分割成和使用在隨機(jī)化第一步的亞單位類型的數(shù)目相同的部分，片段分別和適當(dāng)?shù)臍埢磻?yīng)。反應(yīng)完成后，支持物基質(zhì)的每一片段分成和使用在隨機(jī)化第二步的亞單位類型的數(shù)目相同的部分，收集每一片段的適當(dāng)片段用于偶聯(lián)。
以這種方式，合成可以繼續(xù)到亞單位添加到試驗(yàn)化合物的所有位置或直到達(dá)到操作支持物的機(jī)械限制。棉線常規(guī)的機(jī)械限制是幾毫米的直徑，這限定了棉線文庫(kù)的實(shí)際容量在10個(gè)試驗(yàn)化合物和50,000個(gè)試驗(yàn)化合物之間。這些比例的文庫(kù)是實(shí)質(zhì)上有價(jià)值的，尤其在非肽文庫(kù)的情況下。這樣，具有少達(dá)二、三、四和五種隨機(jī)位置的文庫(kù)(亞單位類型的數(shù)目在2或3和19或更多之間)在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述基質(zhì)可以是功能化的膜。適合的支持物基質(zhì)的非限制例子包括聚丙烯和聚四氟乙烯(特氟隆)。最小的操作區(qū)域是大約1mm2，由于膜僅僅10μm厚，當(dāng)使用這種方法的自動(dòng)化方法時(shí)，很容易構(gòu)建幾百萬化合物的文庫(kù)。使用膜支持基質(zhì)構(gòu)建的文庫(kù)大小僅僅由篩選文庫(kù)的經(jīng)濟(jì)、效率和花費(fèi)的考慮所限制，而不受其合成的任何技術(shù)限制。
本發(fā)明的第三個(gè)實(shí)施方案是“可重構(gòu)的牙刷(toothbrush)”，該牙刷具有成束功能化的比棉機(jī)械性質(zhì)更好的物質(zhì)的線。不同刷子的線束可以解裝配并重裝配成不同的組合以進(jìn)行亞單位的逐步添加。單束線可在兩或三輪的添加步驟之后解裝配并為進(jìn)行下一步而重組。對(duì)于最后的隨機(jī)化步驟，線可按照本發(fā)明上述方法切割成片段。
定向文庫(kù)構(gòu)建方法的公開使得可以結(jié)合簡(jiǎn)單的編碼方案，該方案在文庫(kù)中使用支持物的重要結(jié)構(gòu)特征的簡(jiǎn)單(即肉眼可辨的)鑒別，它基于支持物的物理特征，如顏色(Campian，E.等，1993，第13次腺苷酰硫酸大會(huì)，Edmonton，加拿大)、大小和材料的形狀(在線的情況下為長(zhǎng)度)。
與文庫(kù)不同，其物種以固定的排列構(gòu)建(其中所說的每個(gè)物種的位置與其結(jié)構(gòu)一致)，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，試驗(yàn)化合物物種的全部結(jié)構(gòu)不是由肉眼可辨的特征確定的。相反，在篩選試驗(yàn)之后選擇的試驗(yàn)化合物物種的結(jié)構(gòu)通過結(jié)構(gòu)分析確定。結(jié)構(gòu)分析可以通過使用如Edman降解法或通過質(zhì)譜法(在肽試驗(yàn)化合物的情況下)進(jìn)行。分析的結(jié)構(gòu)可以是試驗(yàn)化合物自身或結(jié)構(gòu)可以是除試驗(yàn)化合物外連接到每個(gè)固相支持物上的編碼分子。連接到固相支持物上的編碼分子的結(jié)構(gòu)首先是任意地和系統(tǒng)地連接到支持物上的試驗(yàn)化合物物種有關(guān)，以便于鑒別試驗(yàn)化合物，其次，這樣選擇便于測(cè)定。在組合文庫(kù)中任意的編碼分子的選擇和使用在1994年5月24日提交的未決專利申請(qǐng)08/249,830中描述，本文一并參考。
6.實(shí)施例下列實(shí)施例作為本發(fā)明的某些實(shí)施方案的說明性實(shí)施例，無意于作為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
我們制備了兩個(gè)“非隨機(jī)”肽文庫(kù)模型。每個(gè)這樣的文庫(kù)的制備和篩選首先簡(jiǎn)要概述如下。這兩個(gè)文庫(kù)中每一個(gè)的材料和方法、篩選的合成的更詳盡描述在6.1-6.5部分。
第一個(gè)文庫(kù)在棉線上制備，僅包含125種肽混合物(參見圖2)。通過β-丙氨酸(Eichler，J.等，1991，肽研究，4296-307)和甘氨酸修飾的棉線(125cm)連接到它之上。然后把線分割成五個(gè)部分，甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸分別偶聯(lián)到每一片段上。在完全的偶聯(lián)和Fmoc脫保護(hù)之后，把L-氨基酸的混合物偶聯(lián)到所有線上。其后是兩個(gè)連續(xù)的步驟，每條線段切成5個(gè)片段，每一片段用一個(gè)選自上述五個(gè)氨基酸的組的氨基酸?；＝又亟M、脫保護(hù)、中和、洗滌和干燥產(chǎn)生的125個(gè)片段；這就導(dǎo)致了125種四肽基元物種的基元文庫(kù)的產(chǎn)生(具有作為隨機(jī)位置的位置1，2和4和作為混合位置的位置3的每種粒子上的19種肽混合物)。
每片段切割成兩半，然后把兩半置于兩個(gè)相配對(duì)的微滴定平板中，其中之一裝備有濾膜。然后使濾膜平板在真空干燥器中接觸氨氣以從棉上釋放肽。選擇較早描述的氣體氨解裂解(Bray，A.m.等，1994，J.Org.Chem.592197-2203；Bray，A.M.等，1993，Tetrahedron Lett.344411-4414)作為裂解方式，因?yàn)樵跀嗔阎?，肽保留在干燥的支持物粒子的表面。肽可溶解進(jìn)試驗(yàn)的緩沖液中。
在用緩沖液抽取肽之后，把肽轉(zhuǎn)移到另一個(gè)平板上，進(jìn)行抗-β-內(nèi)啡肽抗體結(jié)合測(cè)定。一個(gè)孔用于觀察陽性反應(yīng)，相應(yīng)棉段的測(cè)序鑒別出序列Tyr-Gly-Mix-Phe(Mix是所有氨基酸的混合物)，這片段序列相對(duì)應(yīng)于已知的抗-β-內(nèi)啡肽抗體的基元。進(jìn)一步的分析表明1cm的棉線可產(chǎn)生400nmol的釋放肽，可以制備40ml的10μM試驗(yàn)化合物溶液，足夠進(jìn)行多重測(cè)定。
第二個(gè)實(shí)施例是2888種肽的文庫(kù)，該文庫(kù)使用16×16cm功能化的聚四氟乙烯(“特氟隆”)膜合成。膜通過N-保護(hù)的β-丙氨酸?；?，然后構(gòu)建β-丙氨酸和甘氨酸的重復(fù)序列組成的接頭。合成圖解在圖3中給出。文庫(kù)的試驗(yàn)化合物物種具有下列結(jié)構(gòu)Xxx-Xxx-Pro/Gly-Gln/Phe-Phe/Leu(Xxx是用于隨機(jī)化的19種L氨基酸之一)，這種結(jié)構(gòu)包含具有鏈霉抗生物素蛋白的已知基元His-Pro-Gln的Leu-His-Pro-Gln-Phe序列的一個(gè)拷貝(Xxx-His-Pro-Gln-Xxx的38個(gè)拷貝)、和包含抗-β-內(nèi)啡肽單克隆抗體的已知基元的Tye-Gly-Xxx-Phe序列的Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu的一個(gè)拷貝(Barrett，R.W.等，1992，Ana l.Biochem.204357-364；Cwirla，S.E.等，1990，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)，876378-6382；Devlin，J.J.等，1990，科學(xué)，249404-40625；Lam，K.S.等，1993，Bioorg.Med.Chem.Lett.3419-424；Lam，K.S.等，1991，自然，35482-84；McLafferty，M.A.，1993，基因，1282936；Pinilla，C.，1993，基因，12871-76)。然后文庫(kù)使用固相結(jié)合方案用兩個(gè)模型目標(biāo)(鏈霉抗生素蛋白和抗β-內(nèi)啡肽)篩選。
用鏈霉抗生素蛋白篩選產(chǎn)生了55個(gè)陽性方形(squares)。肽的特異性通過添加已知的競(jìng)爭(zhēng)性生物素測(cè)定。17個(gè)方形包含在生物素存在時(shí)不和鏈霉抗生素蛋白進(jìn)行反應(yīng)的肽，然而，所有的17個(gè)方形在缺少生物素的情況下用大約相等的強(qiáng)度可再次陽性染色。對(duì)3個(gè)方形上的肽分別測(cè)序，結(jié)果在表1中給出。所有方形的小片段立即切割下來并放置測(cè)序。這種多測(cè)序?qū)嶒?yàn)(Lebl，M.等，1993，見C.H.Schneider和A.N.Eberle的肽，1992，Proc.22.EPS Eds.ESCOM，Leiden)揭示了對(duì)肽鏈的個(gè)別位置的需要。
用抗-β-內(nèi)啡肽溫育提供了21個(gè)染色的方形。使這些陽性相互作用的粒子脫色，使用另外的檢測(cè)方案與抗-β-內(nèi)啡肽抗體重新溫育。在第一次染色中，抗體通過生物素標(biāo)記，然后結(jié)合的靶的檢測(cè)通過和鏈霉抗生素蛋白-堿性磷酸酶復(fù)合物溫育來達(dá)到。第二輪的檢測(cè)通過和抗小鼠抗體-堿性磷酸酶復(fù)合物溫育進(jìn)行。按這種方法，消除了第一種檢測(cè)方案的非特異性相互作用，因?yàn)榈诙喌臋z測(cè)僅和選擇性粒子進(jìn)行；檢測(cè)非特異性相互作用(檢測(cè)系統(tǒng)的特異性相互作用)的可能性顯著降低。第二輪的溫育僅檢測(cè)出三個(gè)陽性方形。對(duì)它們進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得的序列在表1中給出。發(fā)現(xiàn)了有基元Tyr-Gly-_-Phe的預(yù)期序列。
表1.在選擇用于結(jié)合鏈霉抗生素蛋白和抗-β-內(nèi)啡肽的陽性方形上的發(fā)現(xiàn)的序列鏈霉抗生素蛋白抗-β-內(nèi)啡肽Gly-His-Pro-Gln-PheTyr-Gly-Gly-Phe-LeuMet-His-Pro-Gln-PheTyr-Gly-Gly-Phe-Phe
Lys-His-Pro-Gln-PheTyr-Gly-Pro-Phe-Leu6.1.材料和方法儀器使用1cm的石英杯記錄在Hewlett Packard HP 8452A二極管排列分光光度計(jì)上的UV/VIS吸收譜。通過Edman降解法測(cè)序在ABI 4778蛋白質(zhì)測(cè)序儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)和Porton PI 3010儀器(Porton Instruments，Tarzana，CA)上進(jìn)行。
材料使用沒有進(jìn)一步純化的商業(yè)級(jí)溶劑。保護(hù)的氨基酸從Bachem(Torrance，CA)、Advanced ChemTech(Louisville，KY)或Propeptide(Vert-le-Petit，法國(guó))獲得。單克隆的抗-β-內(nèi)啡肽抗體(克隆3-E7)從Boehringer Mannheim購(gòu)買。綴合到堿性磷酸酶上的鏈霉抗生素蛋白從Pierce(Rockford，IL)獲得，山羊-抗-小鼠堿性磷酸酶復(fù)合物從Bio-Rad(Richmond，CA)獲得。d-生物素從Sigma(St.Louis，MO)購(gòu)買。
一般過程固相合成在聚丙烯注射器中人工進(jìn)行(Krchnak，V.和J.Vagner，1990，肽研究，3182-193)。Fmoc保護(hù)基用50％六氫吡啶/DMF裂解1×10分鐘。在DMF中的DIC用于Nα-Fmoc氨基酸的激活。每個(gè)濃縮反應(yīng)的完成通過溴酚藍(lán)方法監(jiān)測(cè)(Krchnabk，V.等，1988，Collect.Czech.Chem.Commun.532542-2548)。偶聯(lián)方案包括在偶聯(lián)和脫保護(hù)之間以及脫保護(hù)和偶聯(lián)之間以DMF洗滌(6-8次)。最后的脫保護(hù)由混合物K完成(King，D.S.等，1990，國(guó)際肽蛋白質(zhì)研究雜志，36255-266)。
6.2.在棉線上的定向文庫(kù)的合成棉線于在二氯甲烷(DCM)中的25％三氟醋酸(TFA)里處理1小時(shí)。用DCM洗滌(3×)，用在DCM中的5％二異丙基乙胺(diisopropylethylamine)中和(5分鐘)，再用DMF和DCM洗滌(3×)。Fmoc-β-丙氨酸(2mmol)在加入N-甲基咪唑的同時(shí)通過DIC(2mmol)和HOBt(2mmol)激活偶聯(lián)過夜(3.5mmol)。棉線用DMF洗滌，取代通過裂解的Fmoc基-0.41mmol/g(683 nmol/cm)的光度測(cè)定法測(cè)定。五段(每段25cm)棉線置于聚丙烯注射器中，F(xiàn)moc保護(hù)的氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸(But)、丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸)通過DIC/HOBt方案偶聯(lián)。偶聯(lián)完成后(用溴酚藍(lán)方法監(jiān)測(cè))棉線用DMF洗滌并置于一個(gè)注射器中，然后裂解Fmoc基。以DMF和在DMF中的2％HOBt溶液洗滌之后，調(diào)整摩爾比率以用于不同反應(yīng)(以試點(diǎn)試驗(yàn)測(cè)定)的19種L(除了半胱氨酸之外)Fmoc氨基酸的混合物(Eichler，J.和R.A.Houghten，1993，生物化學(xué)，3211035-11041；Geysen，H.M.等，1986，分子免疫學(xué)，23709-715；Pinilla，C.等，1992，生物技術(shù)，13901-905)偶聯(lián)到所有的棉段上。在此偶聯(lián)完成之后，洗滌棉段，裂解Fmoc基，洗滌的棉線以下列方法分割給五個(gè)注射器。從每條線上切割下5cm的棉線并置于不同的注射器中。按這種方法，所有注射器中僅有一段從每條25cm的棉線上切割下來的5cm棉段，沒有一個(gè)注射器中有一個(gè)以上的棉段。進(jìn)行了五種氨基酸衍生物(同上)的偶聯(lián)，洗滌棉線，除去Fmoc基，再次細(xì)分棉線。在這種情況下，1cm的片段從所有5cm的片段上切割下來并置于五個(gè)注射器中。進(jìn)行了相同的五種氨基酸的偶聯(lián)，裂解Fmoc基，側(cè)鏈保護(hù)基通過TFA、DCM和茴香醚(50∶45∶5)的混合物裂解2小時(shí)。棉段用DCM、MeOH洗滌并干燥。一個(gè)樣品片段的氨基酸定量分析表現(xiàn)出400nmol/cm的取代。
6.3.在棉線上的定向文庫(kù)的篩選把棉段切割成兩半，并置于兩個(gè)相配對(duì)的微滴定板(一個(gè)裝備有濾膜底，一個(gè)為常規(guī)平板-“結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)平板”)的配對(duì)位置上。濾膜平板放置到用氣體氨重復(fù)真空和充滿的干燥器中。在接觸20小時(shí)的氨之后，使干燥器真空，然后除去氨。釋放緩沖液PBS/Tween添加到每個(gè)孔中(100μl)，平板在室溫下振蕩過夜。溶液過濾到試驗(yàn)平板上。
為了抑制ELISA，使用了96-孔的免疫平板(Dynatech)。每個(gè)孔最初用在碳酸氫鹽緩沖液(pH 9.4)中的50μl鏈霉抗生素蛋白(20μg/ml)(Pierce)中包被過夜，其后用PBS洗滌三次?？资褂?00μl在PBS中的牛血清蛋白(BSA，3mg/ml)處理以防止非特異性連接，然后孔用PBS/Tween洗滌三次，加入50μl的生物素化的Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu(Salmon，S.E.等，1993，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)，90∶11708-11712)(10ng/ml)。1小時(shí)之后，以PBS/Tween洗滌平板，加入從棉段上釋放的50μl溶液(或Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu，陽性對(duì)照)，然后加入50μl的抗-β-內(nèi)啡肽(40ng/ml)。在室溫下溫育1小時(shí)之后，以PBS/Tween洗滌平板，加入50μl的山羊-抗小鼠IgG辣根過氧化物酶綴合物(Bio-Rad)的1∶1000稀釋液。又一個(gè)小時(shí)后，洗滌平板，加入100μl的在10ml 2，2-疊氮基雙(3-乙基苯并噻唑磺酸)底物中的30μl 30％的H2O2的溶液(溶液在檸檬酸緩沖液中，pH 4.2)。15分鐘后，ELISA平板在405nm下讀數(shù)。僅一個(gè)孔表現(xiàn)出了明顯的抑制。對(duì)來自“結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)平板”上相配對(duì)孔中的棉段樣品(0.3mm)測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了Tyr-Gly-Mix-Phe序列。
6.4.在功能化的交聯(lián)特氟隆膜上的定向文庫(kù)的合成有大約35nmol/cm2取代的親水的氨丙基功能化膜(UV交聯(lián)的氨丙基異丁烯酸氨、N，N-二甲基丙烯和亞甲基-雙-丙烯酰胺，16×16cm，Perseptive Biosystem，Bedford，MA)置于50ml的Falcon試管中，使用DIC/HOBt方法在DMF中通過Fmoc-β-丙氨酸?；?。與Fmoc-甘氨酸、Fmoc-β-丙氨酸、Fmoc-甘氨酸先后偶聯(lián)。在脫保護(hù)之后，把膜分割成兩部分，F(xiàn)moc-苯丙氨酸和Fmoc-亮氨酸分別和它們相偶聯(lián)。在偶聯(lián)完成(溴酚藍(lán)監(jiān)測(cè))和脫保護(hù)之后，再次把棉段分割成兩部分，為進(jìn)行Fmoc-谷氨酰胺和Fmoc-苯丙氨酸偶聯(lián)而重組。在下一次的偶聯(lián)中，膜再次分割成兩片段，為進(jìn)行Fmoc-脯氨酸和Fmoc-甘氨酸的偶聯(lián)而重組。從這些偶聯(lián)物(8×4cm)產(chǎn)生的棉段分割成19條(8×0.21)，條帶置于19個(gè)小聚丙烯試管中。十九種天然氨基酸(除了半胱氨酸之外)用于這個(gè)階片段的偶聯(lián)。在偶聯(lián)完成和Fmoc脫保護(hù)之后，條帶再次切割成19片段(4×2.1 mM)，分到19個(gè)容器中。同組的19種Fmoc氨基酸用于最后的偶聯(lián)。重組所有的棉段，除去Fmoc基，通過混合物K裂解側(cè)鏈保護(hù)基(King，D.S.等，1990，國(guó)際肽蛋白質(zhì)研究雜志，36255-266)。用TFA(2×)、DCM(5×)、MeOH(3×)、水(5×)洗滌膜片段?；谧詈蟮腇moc釋放的吸收率測(cè)量的取代為43.3nmol/cm2。
6.5.在交聯(lián)的特氟隆膜上的定向文庫(kù)的篩選肽文庫(kù)按照公開的方案篩選(Lam，K.S.和M.Lebl，1992，免疫方法，111-15)。肽方形首先以雙蒸水洗滌。在徹底洗滌之后，再洗滌方形并用0.05％明膠(w/v)封閉非特異性結(jié)合。在以PBS/Tween(137mM NaCl，2.7mMKCl，4.3Na2HPO4，1.4mM KH2PO4，pH 7.2和0.1％Tween-20)和2×PBS/Tween/明膠(2×PBS，0.1％Tween-20(v/v)和(w/v))洗滌之后，再和在2×PBS/Tween/明膠中的20nM鏈霉抗生素蛋白-堿性磷酸酶一起溫育。文庫(kù)再用PBS/Tween、2×PBS/Tween/明膠和TBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，25mM Tris base，pH 7.4)洗滌。加入標(biāo)準(zhǔn)底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽，然后再加入一次。接著，將文庫(kù)和底物轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿上顯色。收集55個(gè)顯色方形，用PH 1.0的6M鹽酸胍硫胺素洗滌，用DMF脫色，用明膠包被，與100nM的d-生物素和在2×PBS/Tween/明膠中的20nM鏈霉抗生素蛋白-AD競(jìng)爭(zhēng)。與底物溫育產(chǎn)生了17個(gè)無色的、競(jìng)爭(zhēng)性的方形。在用底物處理之后再和20nM的鏈霉抗生素蛋白-AD溫育產(chǎn)生17個(gè)陽性反應(yīng)的方形。
然后其余的文庫(kù)以6M鹽酸胍硫胺素、pH 1.0、DMF和明膠包被循環(huán)。以PBS/Tween和2×PBS/Tween/明膠洗滌之后，加入在2×PBS/Tween/明膠中的250ng/ml生物素化的抗-β-內(nèi)啡肽抗體。在徹底洗滌之后，加入鏈霉抗生素蛋白-堿性磷酸酶。然后如上所述進(jìn)行文庫(kù)洗滌、底物加入和顯色。有21個(gè)方形顯色，爾后循環(huán)制備它們用于特異性測(cè)定。使用2×PBS/Tween/明膠作為緩沖液，加入200ng/ml的抗-β-內(nèi)啡肽抗體，然后以1.5nM山羊-抗-小鼠-AP徹底洗滌。然后方形以PBS/Tween、2×PBS/Tween/明膠和TBS洗滌，加入底物。結(jié)果3個(gè)方形顯出了表明結(jié)合的顏色。
權(quán)利要求
1.一種多個(gè)試驗(yàn)化合物物種的組合文庫(kù)，其包含a)預(yù)定數(shù)目的分開的固相支持物；每種支持物包括i.容易而可連續(xù)地分割的基質(zhì)的單片，ii.共價(jià)連接物；b)通過連接物連接到支持物上的預(yù)定數(shù)目的預(yù)定的試驗(yàn)化合物物種；每一物種包含預(yù)定數(shù)目的亞單位，所說的每個(gè)亞單位占有一個(gè)預(yù)定的位置；其中每一試驗(yàn)化合物物種連接到預(yù)定數(shù)目的支持物上，并且每一支持物連接單一的試驗(yàn)化合物物種。
2.權(quán)利要求1的文庫(kù)，其中對(duì)于每一試驗(yàn)化合物物種，在第一位置的亞單位的類型的等同性不依賴于在第二位置的亞單位的類型的等同性。
3.權(quán)利要求1的文庫(kù)，其中所說的固相支持物的肉眼可辨別的特征和連接到支持物上的試驗(yàn)化合物位置上的亞單位類型一致。
4.權(quán)利要求3的文庫(kù)，其中所說的肉眼可辨別的特征是支持物的大小。
5.權(quán)利要求3的文庫(kù)，其中所說的肉眼可辨別的特征是支持物的形狀。
6.權(quán)利要求3的文庫(kù)，其中所說的肉眼可辨別的特征是支持物的顏色。
7.權(quán)利要求1的文庫(kù)，其中所說的試驗(yàn)化合物物種的每個(gè)位置是隨機(jī)位置或固定位置。
8.權(quán)利要求1的文庫(kù)，其中所說的試驗(yàn)化合物物種是基元物種(motifspecies)。
9.權(quán)利要求1的文庫(kù)，其中所說的試驗(yàn)化合物物種是聚合物。
10.權(quán)利要求1的文庫(kù)，其中所說的連接物包括許多正交封閉的(orthogonally blocked)位點(diǎn)。
11.權(quán)利要求1的文庫(kù)，其中所說的試驗(yàn)化合物的亞單位通過選自酰胺鍵、酯鍵、脲鍵、氨基甲酸乙酯鍵、碳-羰基鍵、碳-氮結(jié)合鍵、碳-碳單鍵、烯烴鍵、硫醚鍵和二硫鍵的化學(xué)鍵連接。
12.權(quán)利要求1的文庫(kù)，其中所說的每種類型的亞單位包含氨基部分和羧基部分。
13.權(quán)利要求1的文庫(kù)，該文庫(kù)還包含多種編碼分子，其中連接到固相支持物上的編碼分子和連接到支持物上的試驗(yàn)化合物物種一致。
14.一種制備組合文庫(kù)的方法，該方法包括至少兩個(gè)連續(xù)的重復(fù)步驟a)選擇由兩類或多類亞單位組成的組；b)把連續(xù)可分的、具有反應(yīng)位點(diǎn)的固相支持物分割成數(shù)目相等于選擇的亞單位類型的片段；c)把一類亞單位連接到固相支持物相應(yīng)片段的實(shí)質(zhì)上所有的反應(yīng)位點(diǎn)上；d)除去保護(hù)基以便提供反應(yīng)位點(diǎn)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所說的保護(hù)基是一類固相支持物的接頭的保護(hù)基，所說的接頭具有正交保護(hù)基類型的多樣性。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所說的亞單位是雙功能的亞單位，所說的保護(hù)基是亞單位的取代基。
全文摘要
本發(fā)明公開了在固相支持物上產(chǎn)生非隨機(jī)組合文庫(kù)的技術(shù),其中一組預(yù)定的試驗(yàn)化合物物種中的每種存在于預(yù)定數(shù)目的固相支持物上,優(yōu)選地是存在于一種固相支持物上,每一種固相支持物僅有單個(gè)的試驗(yàn)化合物物種。每種預(yù)定的試驗(yàn)化合物物種有絕對(duì)把握制備,因?yàn)樗f的技術(shù)不使用任何固相支持物的隨機(jī)分割。更確切地說,所述方法基于在各個(gè)合成步驟之前對(duì)連續(xù)的固相支持物基質(zhì)逐步分割,在所述各合成步驟中添加多于一種類型的亞單位。固相支持物基質(zhì)的非限制性例子包括聚丙烯膜、聚四氟丙烯膜和棉線。本發(fā)明也公開了用所說的技術(shù)制備的組合文庫(kù)。
文檔編號(hào)C07B61/00GK1173225SQ95197350
公開日1998年2月11日 申請(qǐng)日期1995年12月7日 優(yōu)先權(quán)日1994年12月12日
發(fā)明者M·萊博 申請(qǐng)人:西萊克泰德公司