抗muc1單克隆抗體及其輕鏈和重鏈可變區(qū)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了抗MUC1單克隆抗體及其輕鏈和重鏈可變區(qū)。提供了具有生物學活性的抗MUC1單克隆抗體FMU-MUC1-No.1的輕鏈和重鏈可變區(qū)，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。通過采用基因工程技術和雜交瘤技術制備了一組小鼠抗MUC1mAbs，篩選出能穩(wěn)定分泌高特異性的抗MUC1mAb的雜交瘤細胞株，制備腹水獲得高特異性、高親和力的抗MUC1mAb?FMU-MUC1-No.1。確認該基因序列和相應蛋白序列的惟一性及其CDR序列；為研制和開發(fā)抗MUC1嵌合或人源化基因工程抗體或分子診斷和治療試劑提供支持。
【專利說明】抗MUC1單克隆抗體及其輕鏈和重鏈可變區(qū)【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學【技術領域】，涉及一種單克隆抗體，特別涉及高特異性抗MUCl單克隆抗體(FMU-MUCl-N0.1)及其輕鏈和重鏈可變區(qū)，包括其氨基酸序列和核苷酸序列以及抗體制備方法和其對乳腺癌等的診治用途?！颈尘凹夹g】
[0002]乳腺癌是嚴重危害女性健康的常見惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)，乳腺癌占所有癌癥發(fā)病率的10%，占女性癌癥發(fā)病率的32%、女性癌癥死亡率的15%。全世界每年約有120萬婦女罹患乳腺癌。在北美、西歐等發(fā)達國家，乳腺癌發(fā)病率占女性惡性腫瘤首位。中國是乳腺癌發(fā)病率增長速度最快的國家之一，近年來乳腺癌發(fā)病率正以每年3%的速度遞增，已成為城市女性的第一殺手，盡管有手術以及包括放療、化療、內(nèi)分泌治療等在內(nèi)的綜合治療措施，但乳腺癌復發(fā)、轉移病人終因不能治愈而死亡，因此，需要尋求新的診斷和治療方法。單克隆抗體技術的出現(xiàn)是免疫學領域的重大突破。利用單克隆抗體靶向病變組織或細胞表面抗原，已成為乳腺癌分子診斷和免疫治療的重要策略，而選擇理想的靶分子是其關鍵。MUCl特有的結構和功能特點，使其成為乳腺癌分子診斷和免疫治療的一種理想靶抗原。
[0003]1、MUC1分子與生物學功能
[0004]MUCl又名多形上皮粘蛋白(polymorphic epithelial mucin, PEM),它是最先與機體免疫系統(tǒng)接觸的細胞表面分子之一，是一種高度糖基化的I型跨膜蛋白，正常情況下主要表達于多種組織、器官中的上皮細胞腺腔面，呈頂端表達，極性分布；在癌細胞表面MUCl異常表達，呈非極性分布。研究表明=MUCl在乳腺癌等多種腫瘤組織中異常表達，并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關。
[0005]1.1MUCl 基因
[0006]MUCl基因最早是從乳腺癌等細胞系構建的cDNA表達文庫克隆而得到的，定位于lq21 (I號染色體長臂21帶處)，該基因也是唯一編碼跨膜黏蛋白的基因。人的MUCl基因cDNA全長為1821bp，含有7個外顯子，`不同外顯子作用各異。MUCl基因的一個重要特征是其多態(tài)性(polymorphism),即其第2個外顯子中含有數(shù)量不等的串聯(lián)重復序列(variablenumber of tandem repeats, VNTRs),從20~125不等,抗原表位即位于VNTRs區(qū)。每一個VNTR結構都含有60個堿基，富含GC，編碼20個氨基酸，它們是GVTSAPDTRPAPGSTAPPAH。其中APDTRPA部位是T細胞和B細胞共同識別的表位，對MUCl的免疫原性起決定作用。
[0007]1.2MUC1 分子結構
[0008]MUCl是一種高分子量的糖蛋白，由核心肽和糖鏈組成，糖鏈占50~90%，多以O型糖苷鍵與多肽骨架VNTR的Ser/Thr相連。串聯(lián)重復區(qū)是核心肽的典型結構，每個重復序列VNTR含有2個絲氨酸Ser、3個蘇氨酸Thr，這些都是糖基化的潛在位點。在MUCl羧基末端，包括由72個氨基酸組成的胞內(nèi)區(qū)、28個氨基酸組成的跨膜區(qū)和58個氨基酸組成的胞外區(qū)三部分。其中胞內(nèi)段和跨膜段在不同種屬間的結構具有高保守性，提示其重要的生物學功能。胞外段含有由20個氨基酸組成的串聯(lián)重復序列，決定了 MUCl的空間結構特異性及免疫原性。正常情況下，MUCl胞外段覆蓋著密集、高度分支的糖鏈，當細胞發(fā)生癌變時，MUCI的糖鏈變得稀疏，因而抗原表位肽骨架暴露出來，具有免疫原性。[0009]1.3MUC1在乳腺癌等腫瘤組織表達
[0010]正常情況下，MUCl主要在乳腺、胰腺、消化道、呼吸道、生殖道等多種組織、器官中上皮細胞近管腔或腺腔面表達，呈頂端表達，極性分布，集中位于腺上皮細胞的腔面，胞質未見表達，不易被免疫系統(tǒng)識別。但在腫瘤細胞中MUCl異常表達:(I)MUCl在腫瘤細胞表面表達量顯著升高，呈過度表達，為正常表達量的100倍以上，且與腫瘤的惡性程度呈正相關；(2)MUCl在腫瘤細胞上表達呈非極性，分布在細胞的表面，且胞質中也可見；(3)在腫瘤細胞中由于糖基轉移酶活性增高，導致糖基化不完全，糖鏈變短，使正常隱蔽的核心肽表位暴露，使其具有免疫原性，并出現(xiàn)了新的糖鏈表位(如Tn、STn、TF等糖表位)。MUCl在正常乳腺上皮細胞和良性腫瘤組織中弱陽性表達，呈極性分布，核心肽表位被外周糖鏈所掩蓋，不能被識別；在癌變細胞表面，由于糖基化不全抗原肽表位得以暴露。研究發(fā)現(xiàn)，MUCl在乳腺癌組織中陽性表達率超過90%。此外，MUCl在胰腺癌、結直腸癌、肺癌、卵巢癌、甲狀腺癌等腫瘤組織細胞中廣泛表達。
[0011]1.4MUC1的生物學功能
[0012]早期的研究證明MUCl黏蛋白的主要生物學功能是對腺腔的上皮細胞起潤滑、保護作用以及黏性維持等。隨著對MUCl研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)MUCl分子具有多種功能，如黏附-抗黏附作用、免疫活化-免疫抑制作用等。MUCl還具有介導細胞間的信號轉導并參與機體免疫調(diào)節(jié)等功能。最新的研究表明:由于MUCl基因與信使RNA轉譯后調(diào)控有關聯(lián)，因此其異常表達可能與癌細胞的生長和轉移有關。
[0013]2、MUCl抗體研究現(xiàn)狀
[0014]單克隆抗體(monoclonal antibody, mAb)研究是21世紀生物學領域最熱門的研究方向之一，Cynthia等描述了一種MUCl單克隆抗體的制備方法與用途。Daniel Cheek等發(fā)明抗原結合和/或識別特性的抗mucin抗體以及用于改進抗mucin抗體的抗原結合和/或識別的方法，以用于癌癥的免疫治療。D.B Rubinstein等發(fā)明提供同時結合完整MUCl蛋白的α亞基和β亞基的抗體，以及制備和使用`這些抗體的方法。西村紳一郎等發(fā)現(xiàn):使用MUCl的2，3ST糖肽作為抗原對動物進行免疫，所得抗體可特異性地識別癌特異性的MUCl糖鏈，進而可以識別、殺傷表達MUCl糖鏈的癌細胞。該發(fā)明提供的抗體對MUCl的癌相關結構的特異性識別與對MUCl的正常組織相關結構的特異性識別二者有顯著差異。
[0015]國內(nèi)學者張立新等經(jīng)高速離心從正常人乳中獲得人乳汁顆粒膜(HMFGM)，經(jīng)進一步破碎、脫脂及純化，獲得含MUCl粘蛋白的組分，并經(jīng)SDS-PAGE、Western-bl0t及ELISA鑒定后，免疫家兔制備多抗。結果表明，制備獲得的多抗經(jīng)ELISA測定效價為1:64000~1:128000。馬忠良等以乳腺癌細胞系ZR75免疫Bulb / c小鼠，獲得恒定分泌抗ZR75單克隆抗體的雜交瘤細胞系BM109，具有一定的特異性。李媛等采用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達的8R-MUCl-6Histag為免疫原制備MUCl單克隆抗體，但以此得到的單抗無法識別腫瘤細胞表面MUCl表達，不能滿足制備高靈敏度及高特異性ELISA檢測試劑盒的要求。為獲得高特異性的MUCl單抗，改用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)表達MUCl蛋白，以期成為制備MUCl單抗的理想抗原。唐艷等以8R-MUC1核心肽重組蛋白為抗原免疫家兔，以ELISA法確定抗MUCl多克隆抗體效價，以Western blot和ELISA阻斷試驗鑒定抗體特異性。結果MUCl核心肽多克隆抗體效價為1:256000，能與MUCl核心肽特異性結合，但與單抗相比，多克隆抗體特異性較差。[0016]3、抗體改造與應用
[0017]抗體單體分子是由兩條相同的重鏈(H鏈)和兩條相同的輕鏈(L鏈)，通過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。H鏈和L鏈包括氨基(N)端和羧基(C)端，靠近N端的可變區(qū)(V區(qū))由高變區(qū)/互補決定區(qū)(HVR/⑶R)和骨架區(qū)(FR)組成；靠近C端為恒定區(qū)(C區(qū))。重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)形成的蛋白質折疊是抗原結合部位，其中的CDR/HVR是抗體與抗原決定基互補結合的部位，C區(qū)引發(fā)抗原抗體識別后的反應?？贵w根據(jù)FR/C區(qū)不同可分為人源、鼠源等，鼠源性抗體在人體內(nèi)使用時具有免疫原性，易引起人體的免疫反應，這些免疫反應可引起對鼠源性抗體的清除以及免疫復合物介導的超敏反應。為了克服鼠源性抗體的缺陷，需要構建高親和力的特異性嵌合抗體、單鏈抗體或人源化抗體。
[0018]在改造過程中，最為重要的是首先必須獲得具有良好特異性、親和力的鼠源性親本抗體，克隆其輕鏈和重鏈可變區(qū)基因，然后將這兩條基因進行改造，構建重組抗體基因。因此，篩選出高特異性、高親和力的鼠源性抗MUClmAb，從中克隆出輕、重鏈可變區(qū)基因，對進一步研制具有完全自主知識產(chǎn)權的MUCl基因工程抗體制劑，作為乳腺癌分子診斷和免疫治療的重要手段以填補我國在該領域的空白，不僅對于提升我國乳腺癌防治應對能力具有極其重大的重要意義，而且在MUCl陽性表達的胰腺癌、肺癌、胃腸道腫瘤及甲狀腺癌的分子診斷與免疫治療方面也具有十分重要的實際應用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019]本發(fā)明解決的問題在于提供抗MUCl單克隆抗體及其輕鏈和重鏈可變區(qū)，該抗體為與乳腺癌細胞特異性結合、不與正常乳腺細胞結合的抗體，為構建高特異性的抗MUCl嵌合或人源化基因工程抗體提供支持。
[0020]本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn):
[0021]一種抗MUCl單克隆抗體，包括輕鏈和重鏈，所述輕鏈可變區(qū)的3個互補決定區(qū)(⑶R)序列分別為:`[0022]CDRl:Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Asn-Tyr-Trp ；
[0023]CDR2:IIe-Arg-Leu-1Ie-Ser-Asn-Asn-Tyr-Val-Pro ；
[0024]CDR3:Ser-Phe-Gly-Asn-Ser-Phe-Ala-Tyr ；
[0025]所述重鏈的可變區(qū)的3個互補決定區(qū)(⑶R)序列分別為:
[0026]CDRl:Ser-Ser-Val-Ser-Tyr ；
[0027]CDR2: Leu-Thr-Ser ；
[0028]CDR3:Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-Asn-P;ro-Leu-Th;r。
[0029]所述的抗MUCl單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ.1D.N0.1，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ.1D.N0.2所示。
[0030]所述的編碼MUCl單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ.1D.N0.3所示，編碼重鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ.1D.N0.4所示。
[0031]所述的抗MUCl單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)應用于構建針對MUCl的基因工程抗體或分子診斷和治療試劑的制備。
[0032]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果:
[0033]1、本發(fā)明提供的抗MUCl單克隆抗體，是一種高特異性抗MUCl單克隆抗體:與乳腺癌等MUCl陽性表達腫瘤細胞特異性結合，表現(xiàn)出高親和力、高特異性；與乳腺癌細胞特異性結合、不與正常乳腺細胞結合的抗體?？蛇M一步用于乳腺癌的分子診斷和免疫治療等方面的研究，為乳腺癌的早期診斷與免疫治療提供新方法、新策略。
[0034]2、本發(fā)明克隆抗MUCl單克隆抗體的輕鏈、重鏈可變區(qū)基因和氨基酸序列，序列分析證實了該抗體序列的惟一性。
[0035]3、分析獲得輕鏈、重鏈可變區(qū)的⑶R區(qū)，在此基礎上為構建高特異性、高親和力的抗MUCl嵌合或人源化基因工程抗體提供支持。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1是FMU-MUCl-N0.1mAb的免疫熒光檢測結果；
[0037]圖2是FMU-MUCl-N0.1mAb的流式細胞術鑒定結果；
[0038]圖3 是 FMU-MUCl-N0.1mAb 的 Western blot 鑒定結果；
[0039]圖4是FMU-MUCl-N0.1mAb免疫組化結果；
[0040]圖5 是 FMU-MUCl-N0.1mAb 基因 PCR 結果；
[0041]圖6是FMU-MUCl-N0.1mAb輕鏈可變區(qū)基因同源性序列檢測結果；
[0042]圖7是FMU-MUCl-N0.1mAb重鏈可變區(qū)基因同源性序列檢測結果；
[0043]圖8是FMU-MUCl-N0.1mAb輕鏈可變區(qū)氨基酸同源性序列檢測結果；
[0044]圖9是FMU-MUCl-N0.1mAb重鏈可變區(qū)氨基酸同源性序列檢測結果；
[0045]圖10是FMU-MUCl-N0.1m`Ab輕鏈和重鏈可變區(qū)氨基酸序列結構。
【具體實施方式】
[0046]本發(fā)明用合成的MUCl重復序列免疫Balb/c小鼠，篩選出能穩(wěn)定分泌高特異性抗MUCl單抗FMU-MUCl-N0.1mAb雜交瘤細胞株，制備腹水獲得高特異性抗MUClmAb ;并確認該基因序列和相應蛋白序列的惟一性及其CDR序列；為抗MUCl嵌合或人源化基因工程抗體提供支持。下面結合具體單克隆抗體的制備方法、抗體特異性和活性檢測，以及序列的檢測和唯一性的確定對本發(fā)明做詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。本發(fā)明具體按以下步驟實施:
[0047]1、抗MUCl單抗FMU-MUCl-N0.1mAb的制備及其特異性鑒定
[0048]1.1MUCl短肽合成與抗原制備
[0049]合成的MUCl 兩個重復序列為 C GVTSA PDTRP APGST APPAH GVTSA PDTRP APGSTAPPAH0合成序列N — C，純度>95%。多肽合成后，為增強其免疫性，將多肽與鑰孔血藍蛋白(KLH)及牛血清白蛋白(BSA)交聯(lián)。MUCl重復序列的短肽合成及其與KLH、BSA蛋白偶聯(lián)由上海紫域生物科技有限公司完成。合成的MUCl兩個重復序列短肽與KLH、BSA蛋白偶聯(lián)后作為制備單克隆抗體的免疫原。
[0050]1.2單克隆抗體的制備、純化
[0051]按單克隆抗體制備方法(細胞和分子免疫學實驗技術第一版，P9-P17)，用MUCl抗原免疫Balb/c小鼠(每只小鼠20 μ g /次，購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心)。初次免疫，使用弗氏完全佐劑，后續(xù)免疫使用弗氏不完全佐劑，每次間隔3周，均為皮下多點注射，共免疫4次。末次免疫7~10天后采血測其效價，檢測免疫效果。間隔2~3周后，經(jīng)腹腔注射抗原再加強免疫，3天后處死動物取脾進行細胞融合。
[0052]取對數(shù)生長的小鼠骨髓瘤細胞SP2/0計數(shù)，同時制備免疫脾細胞懸液。將骨髓瘤細胞與脾細胞按1:10比例混合進行細胞融合。融合后細胞懸液加入含有飼養(yǎng)細胞(正常Balb/c小鼠腹腔巨噬細胞)的96孔板，37°C、5%C02孵箱培養(yǎng)。待克隆出現(xiàn)后，間接ELISA檢測，挑選陽性克隆。對含有陽性克隆孔的細胞采用有限稀釋法進行克隆化，直至獲得能夠穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞系(體外連續(xù)培養(yǎng)超過6個月)。
[0053]誘導產(chǎn)生腹水及抗體純化:在獲得能夠穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株后，按常規(guī)制備腹水(細胞和分子免疫學實驗技術第一版，P9-P17)。腹水經(jīng)45%飽和硫酸銨沉淀后，采用QFF陰離子交換層析法純化，純化的FMU-MUCl-N0.1mAb純度達95%。抗體的IgG亞型的鑒定按Sigma檢測試劑盒說明書操作。對其分泌的抗體進行Ig亞類測定(結果為IgGl亞類，K型輕鏈)。
[0054]1.3抗MUCl單克隆抗體FMU-MUCl-N0.1的效價測定
[0055]用間接ELISA方法測定純化前腹水以及純化后mAb的相對親和力。其中包被抗原為合成MUCl免疫原，待測樣品為系列稀釋的腹水以及純化后mAb，檢測抗體為羊抗鼠-HRP酶標記抗體，底物使用ABTS。所篩選出的高親和力FMU-MUCl-N0.1mAb，腹水效價為I X 10_6，純化后效價達IX 10_8，而一般采用間接ELISA檢測腹水效價達IX 10_5以上的抗體即可使用。
[0056]1.4抗MUCl單克隆抗體FMU_MUCl_N0.1的免疫熒光檢測
[0057]用制備的抗MUClmAb對乳腺癌細胞(MCF-7)和肝癌細胞0fepG2)做免疫熒光分析MUCl的表達情況。步驟如下:取出長有細胞的蓋玻片，棄培養(yǎng)液，用PBS洗2次，加入40g/L多聚甲醛，室溫固定lOmin，PBS洗滌后，加入lmL100g/L的BSA/PBS，室溫封閉lh。使用100g/L的BSA/PBS稀釋抗FMU-MUCl-N0.1，室溫孵育3h。使用100g/L的BSA/PBS稀釋的四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)標 記的山羊抗小鼠IgG室溫避光孵育lh。PBS洗6次。加入lug / mL用PBS稀釋的DAPI，孵育2min。用PBS洗4次，避光，自然風干。封片后觀察。
[0058]檢測結果圖1所示，可以看到乳腺癌細胞發(fā)出了熒光(右)，而肝癌細胞未發(fā)出熒光(左)。
[0059]免疫熒光染色檢測證實:抗MUCl單克隆抗體可與MUCl陽性表達的乳腺癌細胞特異性結合，與MUCl表達陰性的肝癌細胞不結合。
[0060]1.5抗MUCl單克隆抗體FMU-MUCl-N0.1的流式細胞術鑒定
[0061]將乳腺癌細胞MCF-7用0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，計數(shù)IXlO6個細胞，用PBS洗滌2次，1000r / min離心5min，棄去上清液，然后加入單克隆抗體FMU-MUCl-N0.1 (200 μ g / mL)孵育45min,使用同型單抗IgG-PE做陰性對照。用PBS洗滌2次，再加入羊抗鼠PE熒光二抗避光孵育30min。PBS洗滌2次，加入多聚甲醛固定液400 μ L，上機檢測與分析，使用儀器為流式細胞儀。
[0062]流式細胞檢測結果如圖2所示，可以看到結合了 FMU-MUCl-N0.1之后的細胞落到了目標區(qū)域(右圖)，而未看到對照IgG落入到目標區(qū)域(左圖);結果表明:與對照組相比，抗MUCl單克隆抗體與MUCl陽性表達乳腺癌細胞MCF-7高特異性結合反應。
[0063]1.6 抗 MUCl 單克隆抗體 FMU-MUCl-N0.1 的 Western blot 鑒定
[0064]收集乳腺癌細胞(MCF-7)，肝癌細胞0fepG2)，裂解細胞，SDS-PAGE后按Westernblot步驟用制備的抗MUCl的FMU-MUCl-N0.1mAb分析不同腫瘤細胞中MUCl的表達情況。
[0065]Western blot步驟:收集細胞，將細胞裂解后制樣，SDS-PAGE電泳后轉膜。50g /L的脫脂奶粉37°C封閉2h，TBST洗膜3次；加入制備的抗MUCl的mAb (1:2000)，4°C過夜，TBST洗膜。加入山羊抗小鼠IgG孵育Ih ;加入ECL底物，顯影。
[0066]結果顯示如圖3所示，可以看到FMU-MUCl-N0.1能夠識別乳腺癌細胞裂解后特定的蛋白(泳道1)，而未能識別肝癌細胞裂解物中的蛋白，結果表明:抗MUCl單克隆抗體可以特異性識別乳腺癌組織細胞裂解物中天然的MUCl蛋白，相對分子量為220kDa，與MUCl陰性表達肝癌細胞裂解物不結合。
[0067]1.7抗MUCl單克隆抗體FMU_MUCl_N0.1的免疫組化鑒定
[0068]乳腺癌組織切片脫蠟、水化。PBS洗5min。將切片浸入0.01mol / L檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中，高壓鍋2min或水浴加熱，自然冷卻，PBS洗；30mL / L過氧化氫孵育IOmin ；PBS洗切片；滴加抗MUCl —抗，37°C水浴箱中孵育lh。PBS洗5次；滴加生物素標記的山羊抗小鼠IgG，37°C孵育30min。PBS洗5次；DAB顯色I~3分鐘；蘇木素襯染，脫水、透明、封片、光鏡觀察。實驗中以空白試驗和替代試驗作為陰性對照，以確保實驗的特異和可靠性。
[0069]乳腺癌石蠟組織切片免疫組織化學染色分析結果如圖4所示，結果證實:抗MUClmAb與乳腺癌細胞高特異性強烈結合(圖4A、B、C，陽性染色主要出現(xiàn)在乳腺癌細胞膜上，部分胞漿染色)，而不與癌旁正常乳腺組織結合(圖4D )。
[0070]2、抗MUCl單抗FMU-MUCl-N0.1mAb輕鏈和重鏈可變區(qū)基因的克隆
[0071]2.lFMU-MUCl-N0.1mAb 雜交瘤細胞的培養(yǎng)
[0072]按常規(guī)方法復蘇(細胞培養(yǎng)，第一版，P88)分泌FMU-MUCl-N0.1mAb的雜交瘤細胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37°C，5%C02孵箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。
`[0073]2.2總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成
[0074]采用TRIZOL Reagent (購自美國GIBCO公司)提取總RNA，具體操作步驟按說明書進行；cDNA第一鏈合成試劑盒購自美國GIBCO公司，在得到總RNA后按說明書進行反轉錄合成cDNA第一鏈。
[0075]2.3RT-PCR 法擴增 FMU-MUCl-N0.1mAb 的 VL 和 VH 基因
[0076]一步法RT-PCR擴增試劑盒購自TakaRa公司，按試劑盒說明書擴增FMU-MUCl-N0.1mAb 的 VL 和 VH 基因；
[0077]引物如下:
[0078]擴增抗體Fd片段及輕鏈全長基因的引物(括號內(nèi)為簡并堿基)
[0079]小鼠重鏈V區(qū)5’端引物:
[0080]VHl: 5，-GGG GAT ATC CAC CAT GG (AG) ATG (CG) AG CTG (TG) GT (CA) AT (CG) CTCTT-3，
[0081]VH2:5，-GGG GAT ATC CAC CAT G(AG)A CTT CGG G(TC)T GAG CT(TG)GGT TTT-3，
[0082]VH3:5， -GGG GAT ATC CAC CAT GGC TGT CTT GGG GCT GCT CTT CT-3’
[0083]VH4:5，-GGG GAT ATC CAC CAT GAT(AG)GT GTT(AG)AG TCT T(CT)T GT(AG)CCT G3，
[0084]Fd3，:5，-AGG CTT ACT AGT ACA ATC CCT GGG CAC AAT-3，；
[0085]小鼠輕鏈V區(qū)5’端引物
[0086]VLl:5， -GGG GAT ATC CAC CAT GGA GAC AGA CAC ACT CCT GCT AT-3，[0087]VL2:5， -GGG GAT ATC CAC CAT GGA TTT TCA AGT GCA GAT TTT CAG-3’
[0088]VL3:5’ -GGG GAT ATC CAC CAT GGA G(AT)C ACA(GT) (AT)C TCG GGTCTT T(GA)TA-3’
[0089]VL4:5’-GGG GAT ATC CAC CAT G(GT)C CCC(AT) (AG)C TCA G(CT)T C(CT)C T(TG)G T-3，
[0090]VL5:5， -GGG GAT ATC CAC CAT GAA GTT GCC TGT TAG GCT GTT G_3’
[0091]輕鏈3’端引物:
[0092]MLC-3，:5，-GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CAT TCC TGT TGA A_3，；
[0093]反應體積50 μ I，反應條件為:94°C 5min ；95°C 30s，58°C lmin,72°C lmin，循環(huán) 35次；72°C 7min。
[0094]2.4PCR擴增產(chǎn)物的克隆和篩選
[0095]PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用小量膠回收試劑盒(購自上海華舜生物工程有限會司)回收PCR擴增片段，用DNA連接試劑盒(購自TakaRa公司)將該片段按說明書，利用加A尾插入pMD-T18載體(購自TakaRa公司)中，連接物轉化E.coli (購自中國普通微生物菌種保藏中心，CGMCC,北京)，接種在Amp抗性LB瓊脂培養(yǎng)平皿中37°C培養(yǎng)過夜。抗MUCl單抗FMU-SEB-N0.1mAb基因PCR結果如圖5所示。
[0096]挑取LB瓊脂培養(yǎng)平皿中克隆，在Amp抗性LB培養(yǎng)基中37°C搖菌過夜，以I μ I菌液為模板，通過上述針對輕鏈、重鏈可變區(qū)設計的引物，用PCR法篩選重組陽性Ε.coli克隆。
`[0097]將所獲得重組陽性Ε.coli克隆搖菌，菌液送交上海生物工程技術服務有限公司完成基因序列測定，輕鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ ID N0.3所示，重鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ ID N0.4 所示。
[0098]3、FMU-MUCl-N0.1mAb輕鏈和重鏈可變區(qū)的核苷酸序列及同源性分析
[0099]3.1確定測序無誤后，在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫中，進行核苷酸序列同源性分析(Blastn )。
[0100]在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫中，進行核苷酸序列同源性分析(Blastn)。
[0101]如圖6所示，F(xiàn)MU-MUCl-N0.1mAb輕鏈可變區(qū)基因與同源性最高對比序列可達289/299(98%)；
[0102]如圖7所示，F(xiàn)MU-MUCl-N0.1mAb重鏈可變區(qū)基因與同源性最高對比序列可達283/286(99%)。
[0103]同源性分析表明，編碼FMU-MUCl-N0.1mAb的輕、重鏈可變區(qū)的核苷酸序列，盡管與其它基因序列有一定同源性，但未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明完全相同的基因序列，表明本發(fā)明在基因序列上具有惟一性。
[0104]3.2將可變區(qū)基因翻譯成氨基酸序列，進行氨基酸序列分析
[0105]單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.1，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如 SEQ ID N0.2 所示。
[0106]在non-redundant Genbank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF 蛋白質數(shù)據(jù)庫中，進行氨基酸序列同源性分析(Blastp )。
[0107]分析結果表明:[0108]如圖8所示，F(xiàn)MU-MUCl-N0.1mAb輕鏈氨基酸序列與同源性最高對比序列可達91/99(92%)；
[0109]如圖9所示，F(xiàn)MU-MUCl-N0.1mAb重鏈氨基酸序列與同源性最高對比序列可達81/98(83%)。
[0110]同源性分析表明，F(xiàn)MU-MUCl-N0.1mAb輕、重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，盡管與其它蛋白氨基酸序列有一定同源性，但未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明完全相同的氨基酸序列，表明本發(fā)明在氨基酸序列上也具有惟一性。
[0111]3.3利用MGT/V-QUEST分析可變區(qū)結構，確定⑶R區(qū)。
[0112]將測序所得FMU-MUCl-N0.1mAb輕鏈和重鏈可變區(qū)序列，在IMGT/V-QUEST網(wǎng)站(http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest)進行分析，得出其 CDR 區(qū)。
[0113]輕鏈可變區(qū)的3個互補決定區(qū)(⑶R)序列，如SEQ ID N0.1劃線部分所示，具體為:
[0114]CDRl:Gly-Phe-Thr-Phe-Asn-Tyr-Trp ；
[0115]CDR2:IIe-Arg-Leu-1Ie-Ser-Asn-Asn-Tyr-Val-Pro ；
[0116]CDR3:Ser-Phe-Gly-Asn-Ser-Phe-Ala-Tyr ；
[0117]重鏈可變區(qū)的3個互補決定區(qū)(⑶R)序列，如SEQ ID N0.2劃線部分所示，具體為:
[0118]CDRl:Ser-Ser-Val-Ser-Tyr ；
[0119]CDR2: Leu-Thr-Ser ；
[0120]CDR3:Gln-Gln- Trp-Ser-Ser-Asn-P;ro-Leu-Th;r。
[0121]4.基因工程抗體設計
[0122]基于抗MUCl單抗FMU-MUCl-N0.1mAb的表達、純化以及序列分析，設計構建以下生物制品
[0123]I)單鏈抗體的構建:可將本發(fā)明的FMU-MUCl-N0.1mAb輕、重鏈可變區(qū)基因通過linker連接,插入原核或真核表達載體，轉化宿主菌或轉染真核細胞，用于制備可對MUCl有靶向作用的單鏈抗體。
[0124]2)人-鼠抗MUCl嵌合抗體的構建:可將本發(fā)明的FMU-MUCl-N0.1mAb輕、重鏈可變區(qū)基因插入通用型嵌合抗體表達載體中，獲得含嵌合基因的載體轉染真核細胞，用于制備可對MUCl有靶向作用的嵌合抗體。
[0125]3)人源化抗體的構建:可將本發(fā)明的FMU-MUCl-N0.1mAb輕、重鏈可變區(qū)基因的CDR區(qū)移植到人源抗體可變區(qū)的骨架區(qū)(FR)中，形成互補決定區(qū)(CDR)移植抗體(CDR-grafted antibody),也稱重構抗體(reshaping antibody)或人源化抗體(humanizedantibody)。
[0126]利用CDR移植技術改造抗體，可以獲得既保持鼠源性親本mAb特異性，又更加接近人抗體的新型抗體，用于制備可對MUCl有靶向作用的人源化抗體。
[0127]4)可根據(jù)本發(fā)明的基因序列及其編碼的氨基酸序列，制備針對MUCl功能表位的其它生物制品。
[0128]5)可應用本發(fā)明的高特異性、高親和力FMU-MUCl-N0.1mAb制備測定MUCl表達陽性的乳腺癌以及胰腺癌、肺癌、胃腸道癌、甲狀腺癌等腫瘤的ELISA診斷試劑盒，可望在乳腺癌等MUCl陽性表達腫瘤的早期 診斷檢驗中有廣泛的應用價值。
【權利要求】
1.一種抗MUCl單克隆抗體，包括輕鏈和重鏈，其特征在于，所述輕鏈的可變區(qū)的3個互補決定區(qū)(CDR)序列分別為:
CDRl:Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Asn-Tyr-Trp ；
CDR2:IIe-Arg-Leu-1Ie-Ser-Asn-Asn-Tyr-Val-Pro ；
CDR3:Ser-Phe-Gly-Asn-Ser-Phe-Ala-Tyr ； 所述重鏈的可變區(qū)的3個互補決定區(qū)(⑶R)序列分別為:
CDRl:Ser-Ser-Val-Ser-Tyr ；
CDR2:Leu-Thr~Ser ；
CDR3:Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-Asn-Pro-Leu-Thr。
2.如權利要求1所述的抗MUCl單克隆抗體，其特征在于，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ.1D.N0.1，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ.1D.N0.2所示。
3.如權利要求1所述的抗MUCl單克隆抗體，其特征在于，編碼輕鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ.1D.N0.3所示，編碼重鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ.1D.N0.4所示。
4.權利要求1所述的抗MUCl單克隆抗體在構建針對MUCl的基因工程抗體或分子診斷和治療試劑中的應用。`
【文檔編號】C07K16/28GK103880956SQ201410085655
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月10日 優(yōu)先權日:2014年3月10日
【發(fā)明者】袁時芳, 李航, 張英起, 王輝, 李郁, 宋朝君, 凌瑞, 易軍 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學