沼水蛙抗菌肽及其制備與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種沼水蛙的抗菌肽的氨基酸序列、分離純化、制備方法及其在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用。該抗菌肽序列為FLGALFKVASKLVPAAIRSISKK，經(jīng)檢測(cè)可抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。本發(fā)明所涉及的抗菌肽具有結(jié)構(gòu)新穎、抗菌活力強(qiáng)等特點(diǎn)，在新型多肽抗菌藥物開(kāi)發(fā)和應(yīng)用方面具有重要價(jià)值。
【專利說(shuō)明】沼水蛙抗菌肽及其制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及沼水蛙抗菌肽及其制備與應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]由于抗生素的濫用，許多微生物對(duì)抗生素產(chǎn)生了耐藥性，出現(xiàn)了許多能夠抵抗常用抗生素的超級(jí)細(xì)菌。尋找抑菌機(jī)理不同的抗菌藥物成了醫(yī)療領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。 [0003]兩棲動(dòng)物抗菌肽是生物抗菌肽研究中的一個(gè)重要組成部分，其特殊的結(jié)構(gòu)和廣譜抗菌活性使其具有重要的理論研究?jī)r(jià)值和開(kāi)發(fā)成新型抗生素的潛力。自研究者從非洲爪蟾皮膚分泌物中發(fā)現(xiàn)第一個(gè)兩棲動(dòng)物皮膚抗菌肽開(kāi)始，研究者已通過(guò)分離純化和分子克隆手段從兩棲動(dòng)物皮膚分泌物中發(fā)現(xiàn)了上千種抗菌肽，這些多肽由10-50個(gè)氨基酸構(gòu)成。目前研究者根據(jù)兩棲動(dòng)物抗菌肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)將其分成100多個(gè)不同的家族，這些不同家族的抗菌肽在分子量大小，電荷，疏水性，結(jié)構(gòu)和功能上都不相同。通過(guò)這些抗菌肽的結(jié)構(gòu)和功能的研究，不僅得到了許多高活性，具有廣譜抗菌作用的多肽，而且利用抗菌肽結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系，研究者設(shè)計(jì)改進(jìn)了許多天然抗菌肽。
[0004]不同來(lái)源的蛙皮膚抗菌肽在氨基酸組成和序列上存在顯著差異，但是其二級(jí)結(jié)構(gòu)卻有很多相似性。研究者通過(guò)圓二色譜研究發(fā)現(xiàn)，許多抗菌肽，如來(lái)源于Ι?/7θ/7?5.Iaevis的 23 妝 Magainin2,來(lái)源于Tfeaa nigromaculata 的抗菌妝 temporin-lRNa、temporin_lRNb等在模擬細(xì)胞膜環(huán)境下會(huì)自發(fā)折疊成兩親的α-螺旋結(jié)構(gòu)。這些抗菌肽通過(guò)作用于細(xì)菌細(xì)胞膜上的磷脂雙分子層，破壞細(xì)胞膜完整性并在細(xì)胞膜上形成跨膜通道，造成細(xì)胞內(nèi)容物溶出而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。隨著對(duì)抗菌肽結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的深入研究，抗菌肽的醫(yī)學(xué)價(jià)值越發(fā)明顯，開(kāi)發(fā)抗菌活性強(qiáng)，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的抗菌肽已成為一個(gè)緊迫的任務(wù)。
[0005]沼水娃iHylarana guentheri)是中國(guó)南部地區(qū)常見(jiàn)兩棲動(dòng)物,其皮膚分泌物中含有多種抗菌肽。有研究表明，蛙科動(dòng)物至少需要20-30種抗菌肽才能形成較好的抗菌屏障，而目前已報(bào)道的沼水娃抗菌肽有9個(gè),分別屬于brevinin、temporin和guentherin家族，仍然有許多沼水蛙皮膚抗菌肽未被發(fā)現(xiàn)。沼水蛙皮膚抗菌肽的分離純化和抗菌活性研究還需要進(jìn)一步的加強(qiáng)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究還未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供沼水蛙抗菌肽及其制備與應(yīng)用，具體提供了一種制備簡(jiǎn)單，抑菌活性強(qiáng)的沼水蛙抗菌肽，并且可以將該抗菌肽應(yīng)用于抗菌類藥物的研制與開(kāi)發(fā)。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種沼水蛙抗菌肽，其氨基酸序列為SEQ ID N0.1:FLGALFKVASKLVPAAIRSISKK。
[0008]所述抗菌肽能夠抑制常見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，包括革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌。
[0009]所述抗菌肽在模擬細(xì)胞膜環(huán)境下會(huì)折疊成兩親性的α-螺旋結(jié)構(gòu)。
[0010]抗菌肽衍生物為所述抗菌肽的一個(gè)或者幾個(gè)氨基酸被取代，或者環(huán)化，或者L-型氨基酸變?yōu)镈-型氨基酸，或者缺失，或者加入而得到同等功能的多肽。[0011]一種與所述抗菌肽SEQ ID N0.1具有80%及以上同源性的多肽，該多肽功能與SEQID N0.1相同或相似；
一種抗菌肽序列的前端，中端或者末端包含權(quán)利要求1所述抗菌肽，該多肽與權(quán)利要求I所述抗菌肽功能相同或者相似；
所述抗菌肽可以從天然沼水蛙皮膚分泌物分離純化或人工合成方法得到。
[0012]具體制備步驟為:
1)提取皮膚分泌物:捕捉福建地區(qū)野生沼水蛙，充分洗凈，采用市售9V直流電池對(duì)沼水蛙耳后腺及背部腺體發(fā)達(dá)部分皮膚適度電刺激，待實(shí)驗(yàn)個(gè)體皮膚表面產(chǎn)生大量分泌物，用體積比為0.05%三氟乙酸的去離子水沖洗分泌物，收集沖洗液冷凍干燥，即為沼水蛙皮膚分泌物粗提物； 2)分離純化:取沼水蛙皮膚分泌物粗提物利用S^hadexG-50凝膠色譜進(jìn)行分離，以去離子水為洗脫液，流速0.3 mL/min，測(cè)量洗脫組分214 nm波長(zhǎng)處的吸光值。收集具有最佳抗菌活性的峰，利用反相高效液相色譜進(jìn)一步分離。反相高效液相色譜的洗脫梯度為O~5min, O ~20% (v/v)乙腈；5 ~40min, 20 ~70% (v/v)乙腈；流速為 1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm,收集體積分?jǐn)?shù)為50%乙腈濃度的洗脫峰，冷凍干燥即得所述抗菌肽。
[0013]一種沼水蛙抗菌肽的應(yīng)用于抗菌類藥物的研制與開(kāi)發(fā)。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
該沼水蛙抗菌肽具有廣譜抗菌活性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都有強(qiáng)抑制作用，表明其在抗菌藥物開(kāi)發(fā)和應(yīng)用方面有重要價(jià)值。該抗菌肽對(duì)細(xì)菌的抑制作用見(jiàn)實(shí)施實(shí)例2與實(shí)施實(shí)例3。
[0015]本發(fā)明所述的抗菌肽在疏水環(huán)境中可形成α-螺旋結(jié)構(gòu)，利用圓二色譜(CD)測(cè)定抗菌肽在不同濃度三氟乙醇(TFE，細(xì)胞膜疏水環(huán)境模擬)中的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明該抗菌肽的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量隨著TFE濃度提高而增加。該結(jié)構(gòu)特征對(duì)研究抗菌肽的抑菌機(jī)理有重要意義。
[0016]鑒于上述抗菌肽的性質(zhì)和功能，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以以該抗菌肽為模板，通過(guò)改變?cè)摽咕牡囊患?jí)結(jié)構(gòu)或合成其衍生物以提高其抗菌活性，用于藥物研發(fā)和臨床治療。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1:沼水蛙皮膚分泌物S印hedex G-50凝膠過(guò)濾色譜圖。
[0018]圖2:凝膠色譜洗脫峰峰I反相高效液相色譜圖。
[0019]圖3:沼水蛙抗菌肽對(duì)大腸桿菌(A)和金黃色葡萄球菌(B)的抑制作用。
[0020]圖4:沼水蛙抗菌肽在不同濃度TFE溶液中的圓二色譜吸收。
[0021]圖5:沼水蛙抗菌肽α -螺旋輪狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]實(shí)施實(shí)例I
本發(fā)明所述抗菌肽的分離純化包括Sephadex G_50凝膠過(guò)濾色譜和反相高效液相色譜(RP-HPLC)兩個(gè)步驟。[0023]提取沼水蛙皮膚分泌物:成年沼水蛙，清水洗凈，市售9 V直流電池電擊沼水蛙耳后腺及背部腺體發(fā)達(dá)部分皮膚，待實(shí)驗(yàn)個(gè)體皮膚表面產(chǎn)生大量分泌物，用體積比0.05%三氟乙酸的去離子水沖洗并收集分泌物，12000rpm離心15min，取上清液冷凍干燥，-80°C低
溫保存。
[0024]Sephadex G_50凝膠過(guò)濾色譜:按上述方法獲得沼水蛙皮膚分泌物凍干粉，溶解于去離子水中，12000rpm離心15min。取上清液用0.22 μ m孔徑微濾膜過(guò)濾。Sephadex G-50凝膠柱(1.6cmX 100cm)用去離子水平衡，將已過(guò)濾的樣品上柱。用去離子水洗脫，流速
0.3mL/min，于214nm波長(zhǎng)處檢測(cè)洗脫液吸光值，繪制洗脫曲線，如圖1所示。收集洗脫峰峰1，冷凍干燥，_80°C低溫保存?zhèn)溆谩?br> [0025]高效液相色譜:去離子水溶解上述峰I凍干粉，采用RP-HPLC進(jìn)一步分離。液相色譜系統(tǒng)為 LC-20A,裝配 Gemini 5 μ C18 (250mmX 10mm)反相柱(Phenomenex, UK)，用水和乙腈(含0.05%三氟乙酸)構(gòu)成的洗脫系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫。洗脫梯度:0~5min，0~20%(v/v)乙腈；5~40min,20~70% (v/v)乙腈；洗脫流速1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)214nm,洗脫曲線如圖2所示。收集體積分?jǐn)?shù)為50%乙腈濃度的洗脫峰AMP-5 (保留時(shí)間為24.8min),冷凍干燥即為本發(fā)明所述抗菌肽。
[0026]將收集到的抗菌組分AMP-5冷凍干燥，采用高效液相色譜檢驗(yàn)所得到的組分純度。經(jīng)檢測(cè)，該抗菌肽組分純度達(dá)到95%，可測(cè)定其氨基酸序列。用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列，得到AMP-5的氨基酸序 列(見(jiàn)SEQ ID N0.1)。
[0027]實(shí)施實(shí)例2
瓊脂涂布法檢測(cè)本發(fā)明所述天然抗菌肽抑菌活性:
所用菌種為大腸桿菌(Escherichia coli ATCC8099)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC26003)。具體操作如下:選取單菌落接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜振搖培養(yǎng)(37°C，130rpm)，將200 μ L過(guò)夜培養(yǎng)菌液接種于20mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，振搖培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)好的菌懸液稀釋1000倍，取100 μ L加入平板培養(yǎng)基表面，涂布均勻。在涂布好菌液的平板培養(yǎng)基表面均勻地貼上直徑為5_的圓形濾紙片，每個(gè)濾紙片上加IOyL待測(cè)樣品。慶大霉素作為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌水做陰性對(duì)照。將加完樣品的平板倒置于37 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~20h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，添加慶大霉素(標(biāo)記為“ + ”)和上述抗菌肽樣品(標(biāo)記為“I”)的濾紙片周圍出現(xiàn)明顯的抑菌圈，而加無(wú)菌水(標(biāo)記為的濾紙片周圍細(xì)菌正常生長(zhǎng)，表明本發(fā)明所述抗菌肽對(duì)大腸桿菌(圖3A)和金黃色葡萄球菌(圖3B)都有明顯的抑制作用。
[0028]實(shí)施實(shí)例3
利用液體生長(zhǎng)抑制法檢測(cè)本發(fā)明所述合成多肽對(duì)細(xì)菌的抑制活力:
本實(shí)施實(shí)例所用抗菌肽由上海吉爾生化有限公司根據(jù)序列SEQ ID N0.1合成，純度為95%。采用96孔板法測(cè)定樣品最小抑菌濃度(MIC)，具體操作如下:
菌種復(fù)蘇，接種斜面37°C培養(yǎng)過(guò)夜，挑單菌落接種于普通LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，稀釋菌液使菌濃度為104-105CFU/mL，按每孔100 μ L菌液接種于96孔板中，加入10 μ L以一定比例稀釋后的多肽，將96孔板置于37°C過(guò)夜培養(yǎng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)630nm波長(zhǎng)的吸光值，結(jié)果見(jiàn)表一。
[0029]含有抗菌肽的細(xì)菌生長(zhǎng)濃度(OD63tl)與不加抗菌肽的細(xì)菌生長(zhǎng)濃度的比值大于90%時(shí)的抗菌肽濃度即為最小抑菌濃度(MIC，定義為顯著抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度)。
[0030]由檢測(cè)結(jié)果可知，該抗菌肽對(duì)常見(jiàn)的細(xì)菌的最小抑菌濃度均達(dá)到微克級(jí)，具有極強(qiáng)的抑菌活力。
[0031]表一:沼水娃抗菌肽最小抑菌濃度
【權(quán)利要求】
1.一種沼水蛙抗菌肽，其特征在于:所述抗菌肽氨基酸序列為SEQ ID N0.1:FLGALFKVASKLVPAAIRSISKK。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種沼水蛙抗菌肽，其特征在于:所述抗菌肽能夠抑制常見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，包括革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種沼水蛙抗菌肽，其特征在于:所述抗菌肽在模擬細(xì)胞膜環(huán)境下會(huì)折疊成兩親性的α-螺旋結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種沼水蛙抗菌肽，其特征在于:抗菌肽衍生物為所述抗菌肽的一個(gè)或者幾個(gè)氨基酸被取代，或者環(huán)化，或者L-型氨基酸變?yōu)镈-型氨基酸，或者缺失，或者加入而得到同等功能的多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種沼水蛙抗菌肽，其特征在于:一種與所述抗菌肽SEQIDN0.1具有80%及以上同源性的多肽，該多肽功能與SEQ ID N0.1相同或相似。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種沼水蛙抗菌肽，其特征在于:一種抗菌肽序列的前端，中端或者末端包含權(quán)利要求1所述抗菌肽，該多肽與權(quán)利要求1所述抗菌肽功能相同或者相似。
7.—種如權(quán)利要求1所述的一種沼水蛙抗菌肽的制備方法，其特征在于:所述抗菌肽可以從天然沼水蛙皮膚分泌物分離純化或人工合成方法得到。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種沼水蛙抗菌肽的制備方法，其特征在于:具體制備步驟為: 1)提取皮膚分泌物:捕捉福建地區(qū)野生沼水蛙，充分洗凈，采用市售9V直流電池對(duì)沼水蛙耳后腺及背部腺體發(fā)達(dá)部`分皮膚適度電刺激，待實(shí)驗(yàn)個(gè)體皮膚表面產(chǎn)生大量分泌物，用體積比為0.05%三氟乙酸的去離子水沖洗分泌物，收集沖洗液冷凍干燥，即為沼水蛙皮膚分泌物粗提物； 2)分離純化:取沼水蛙皮膚分泌物粗提物利用S^hadexG-50凝膠色譜進(jìn)行分離，以去離子水為洗脫液，流速0.3 mL/min，測(cè)量洗脫組分214 nm波長(zhǎng)處的吸光值。收集具有最佳抗菌活性的峰，利用反相高效液相色譜進(jìn)一步分離。反相高效液相色譜的洗脫梯度為O~5min,0~20% v/v乙臆；5~40min, 20~70% ￥八乙臆；流速為1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，收集體積分?jǐn)?shù)為50%乙腈濃度的洗脫峰，冷凍干燥即得所述抗菌肽。
9.一種如權(quán)利要求1所述的一種沼水蛙抗菌肽的應(yīng)用于抗菌類藥物的研制與開(kāi)發(fā)。
【文檔編號(hào)】C07K1/16GK103724416SQ201410019848
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】洪晶, 俞世宏, 陳濤濤, 戶佩, 汪少蕓 申請(qǐng)人:福州大學(xué)