從水蛭凍干品中分離具有抗氧化活性的蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從水蛭凍干品中分離具有抗氧化活性的蛋白的方法。第一步將活體水蛭冷凍干燥，第二步超微粉碎，取凍干粉，第三步，向水蛭凍干粉中加入是凍干粉體積15倍的生理鹽水，第四步，攪拌均勻后放入冰水中經(jīng)過6小時冰浴，第五步，將溶液放入離心機中以每分鐘8000轉離心15分鐘，第六步，沉淀后收集上清液，第七步，收集的上清液用10000分子量透析袋透析后冷凍干燥?？梢灾苯訌乃沃刑崛〕隹寡趸钚愿摺o毒害的蛋白。通過實施該方法可以達到采集工序簡化、人工操作勞動強度低的優(yōu)點。
【專利說明】從水蛭凍干品中分離具有抗氧化活性的蛋白的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從水蛭凍干品中分離具有抗氧化活性的蛋白的方法，尤其是從寬體金線蛭中提取蛋白的方法。
【背景技術】
[0002]寬體金線蛭入藥歷史悠久，早在我國醫(yī)學名著《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》中就有記載，自古至今被中醫(yī)界稱為一種袪病救人的良藥，可以治療跌打損傷、高血壓、冠心病和腫瘤等，還可用于斷肢(指)再植的術后輔助治療。1996年召開的全國活血化瘀學術會上，水蛭被確定為35種活血化瘀的中藥材之一，目前，水蛭已成為中西藥及飼料工業(yè)不可缺少的原料，我國批準生產(chǎn)的以水蛭為主要原料的中藥有幾十種，水蛭體內含有的抗凝血物質即水蛭素，是拒絕“三高人群”的良藥?，F(xiàn)代科技發(fā)現(xiàn)，水蛭不但能制藥，而且能生產(chǎn)保健品、化妝品，甚至國內有些地區(qū)已將寬體金線蛭經(jīng)加工后走上餐桌。我們研究發(fā)現(xiàn)寬體金線蛭除了含有水蛭素外，還含有豐富的抗氧化活性的蛋白，能夠抑制超氧陰離子自由基(02-)、羥自由基(OH)的產(chǎn)生，防止紅細胞因過氧化氫氧化溶血和肝脂質過氧化?；钚匝踝杂苫鶎C體具有巨大的損傷作用，如會引起蛋白質損傷、酶失活、膜質過氧化，導致衰老、腫瘤、動脈粥樣硬化等許多疾病的發(fā)生。人工合成的二丁基羥基甲苯(BHT)、丁基羥基甲氧基(BHA)、丙二醇(PG)等具有較好的清除活性氧自由基的作用，常用作食品添加劑，但近年研究表明，BHT、BHA, PG具有致癌作用。因此篩選對人體安全、高效的活性氧清除劑有著重要的意義。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種提取水蛭中具有抗氧化活性的蛋白的方法。
[0004]為解決上述技術問`題，本發(fā)明采用如下技術方案:該從水蛭凍干品中分離具有抗氧化活性的蛋白的方法，
[0005]第一步將活體水蛭冷凍干燥，
[0006]第二步超微粉碎，取凍干粉，
[0007]第三步，向水蛭凍干粉中加入是凍干粉體積15倍的生理鹽水，
[0008]第四步，攪拌均勻后放入冰水中經(jīng)過6小時冰浴，
[0009]第五步，將溶液放入離心機中以每分鐘8000轉離心15分鐘，
[0010]第六步，沉淀后收集上清液，
[0011]第七步，收集的上清液用10000分子量透析袋透析后冷凍干燥。
[0012]本發(fā)明采用上述技術方案:可以直接從水蛭中提取出抗氧活性高、無毒害的蛋白。通過實施該方法可以達到采集工序簡化、人工操作勞動強度低的優(yōu)點。
【具體實施方式】
[0013]本實施例以提取寬體金線蛭中的蛋白為例，首先將活體寬體金線蛭冷凍干燥，接著利用超微粉碎機超微粉碎，取凍干粉。向取得的凍干粉中加入是凍干粉體積15倍的生理鹽水，攪拌均勻后放入冰水中經(jīng)過6小時冰浴。然后,將溶液放入離心機中以每分鐘8000轉離心15分鐘，待沉淀后收集上清液，收集的上清液用10000分子量透析袋透析后冷凍干燥即獲得所需的抗氧化活性蛋白。
[0014]通過下述方法測定抗氧化活性，
[0015]第一步，羥基自由基清除活性測定，向試管中加入一系列不同濃度的蛋白溶液 1.0ml, FeSO4 (0.98mmol/l),溶液 2.0mL,水楊酸-乙醇 1.5ml (1.8mmol/l),最后加H2O2 (0.03%) 0.1ml啟動反應，振蕩混合，水浴37°C，保溫30min，在波長510nm測定各組吸光度值。用純凈水調零，對照管用Iml純凈水代替樣品。
[0016]羥基自由基清除率計算公式為:
[0017]D= [(A0-As) / A0] *100%
[0018]式中，Atl為空白管的吸光度，As為加入自由基清除劑后的吸光度，以抗壞血酸做陽性對照。
[0019]第二步，超氧陰離子自由基清除活性測定，利用鄰苯三酚自氧化體系測定樣品對超氧陰離子自由基的清除能力。取2.5mL50mmol/L pH8.2的Tris-HCl緩沖溶液，加入2mL不同濃度的樣品溶液，于25°C保溫20min。然后加入20ul25°C預溫的30mmol/L鄰苯三酚，混勻后迅速加入干燥的比色皿中，在波長325nm處，從吸光度值達到0.2起，每隔30s測定I次吸光度值，測定4min內的吸光度變化值。以等量的lOmmol/L HCl代替鄰苯三酚調零?？瞻捉M以等量的純凈 水代替樣液。
[0020]超氧陰離子自由基清除率XAVse-AVg) /AV空白*100%
[0021 ] 以抗壞血酸做陽性對照。
[0022]第三步，總抗氧化能力測定。使用總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS法)。ABTS工作母液配制后，室溫避光存放12-16h后，用PBS稀釋成ABTS工作液。96孔板的每個檢測孔中加入200 μ L ABTS工作液。空白對照孔中加入10 μ L蒸餾水；標準曲線檢測孔內加入10 μ L0.15,0.3,0.6,0.9、1.2、1.5mmol/L 的 Trolox 標準溶液；樣品檢測孔內加入 10 μ L 的樣品溶液。輕輕混勻。室溫孵育4min后，于734nm下測定吸光值。根據(jù)標準曲線計算出樣品的總抗氧化能力。維生素C的抗氧化能力為1.0。
[0023]第四步蛋白濃度測定。使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒。分別取0.5mg/ml蛋白標準品O、1、2、4、8、12、16、20uI加到96孔板的標準品孔中，各孔加入200uI G250染色液，室溫靜止3min，用酶標儀測定A595，做出標準曲線。樣品孔中加入20ul—定濃度的蛋白樣品，步驟同上，根據(jù)標準曲線計算樣品濃度。
[0024]如圖1所示，蛋白標準曲線。
[0025]如圖2所示，水蛭凍干品清除羥基自由基清除活性。
[0026]如圖3所示，水蛭凍干品清除羥基自由基活性較抗壞血酸強。
[0027]如圖4所示，水蛭凍干品清除超氧陰離子自由基活性。
[0028]如圖5所示，水蛭凍干品清除超氧陰離子自由基活性較抗壞血酸弱。
[0029]水蛭凍干品總抗氧化活性，如圖6所示，總抗氧化能力標準曲線，經(jīng)計算水蛭凍干品總抗氧化活性為0.14mmol/ug。
【權利要求】
1.一種從水蛭凍干品中分離具有抗氧化活性的蛋白的方法，其特征在于:第一步將活體水蛭冷凍干燥，第二步超微粉碎，取凍干粉，第三步，向水蛭凍干粉中加入是凍干粉體積15倍的生理鹽水，第四步，攪拌均勻后放入冰水中經(jīng)過6小時冰浴，第五步，將溶液放入離心機中以每分鐘8000轉離心15分鐘，第六步，沉淀后收集上清液，第七步，收集 的上清液用10000分子量透析袋透析后冷凍干燥。
【文檔編號】C07K1/14GK103755779SQ201410001919
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月2日 優(yōu)先權日:2014年1月2日
【發(fā)明者】徐海圣, 尹娜, 陸萍, 彭彩娥 申請人:浙江大學湖州市南太湖現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技推廣中心