用于產(chǎn)生免疫球蛋白樣分子的方法和手段的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于在單個(gè)宿主細(xì)胞中產(chǎn)生一種或更多種免疫球蛋白樣分子的手段和方法。也提供了能夠產(chǎn)生目的單特異性和/或雙特異性免疫球蛋白樣分子的新的CH3突變。
【專利說(shuō)明】用于產(chǎn)生免疫球蛋白樣分子的方法和手段

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和生物治療劑領(lǐng)域。尤其涉及用于治療多種疾病的 治療性抗體領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 許多目前使用的生物治療劑是分離的重組人或人源化單克隆抗體，其增強(qiáng)機(jī)體免 疫系統(tǒng)中和或消除參與疾病過(guò)程的細(xì)胞和/或分子或者消滅侵入的病原體或感染原的能 力。單克隆抗體與抗原的單個(gè)特定區(qū)域或表位結(jié)合，并且對(duì)于治療中的使用，通常根據(jù)期望 的功能性質(zhì)進(jìn)行選擇，例如殺死腫瘤細(xì)胞，阻斷受體-配體相互作用或病毒中和。目前，大 約有30種經(jīng)FDA批準(zhǔn)的單克隆抗體，這些單克隆抗體通常被大量生產(chǎn)，并且可詳細(xì)分析其 生物物理和生物化學(xué)特性以確保批與批之間的一致性，這有助于控制合格率（regulatory acc印tability)。盡管具有這些有利的特性，但是單克隆抗體也有許多缺點(diǎn)，其中一些 涉及到其單特異性的性質(zhì)和疾病的復(fù)雜性。疾病過(guò)程在性質(zhì)上常常是多因素的，并且涉 及疾病調(diào)節(jié)因素的繁多的或協(xié)同的作用或不同受體的上調(diào)，包括其信號(hào)網(wǎng)絡(luò)之間的串?dāng)_ (crosstalk)。因此，對(duì)參與病理的多種不同因素和途徑的阻斷可導(dǎo)致改善治療效果。由于 其單特異性的性質(zhì)，單克隆抗體可能僅干擾復(fù)雜疾病過(guò)程中的單個(gè)步驟，這往往不具有最 佳效果。除了不能完全解決疾病過(guò)程的多個(gè)方面外，已經(jīng)很清楚的是，靶向單個(gè)細(xì)胞蛋白質(zhì) 或可溶性蛋白質(zhì)或病原體的單個(gè)表位通常不足以有效地治療疾病，這是因?yàn)閷?duì)于單克隆抗 體來(lái)說(shuō)與之結(jié)合并發(fā)揮所預(yù)期效果的靶表位可能不再可利用。例如，腫瘤細(xì)胞經(jīng)常通過(guò)下 調(diào)、突變或屏蔽存在于生長(zhǎng)因子受體上的靶表位來(lái)逃避單克隆抗體的治療。通過(guò)激活替選 受體和/或其配體，腫瘤細(xì)胞然后可開(kāi)發(fā)出不同途徑來(lái)持續(xù)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。類似地，病毒和 其他病原體頻繁突變并失去或屏蔽靶表位，從而逃避單克隆抗體的治療。與單個(gè)表位結(jié)合 的單克隆抗體通常不招募由多克隆抗體誘發(fā)的全方位的效應(yīng)機(jī)制，其中包括：調(diào)理素作用 (增強(qiáng)抗原的吞噬作用）、位阻（包被抗體的抗原被阻止附著到宿主細(xì)胞或粘膜表面）、毒素 中和、凝集或沉淀（抗體結(jié)合多個(gè)可溶性抗原引起的聚集和隨后的清除），激活補(bǔ)體和抗體 依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性（抗體能夠通過(guò)自然殺傷細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞）。
[0003] 用于治療應(yīng)用的多克隆抗體可以從混合人血清中獲得。這種血清來(lái)源的治療性多 克隆抗體可例如用于治療或預(yù)防由病毒（例如狂犬病病毒、巨細(xì)胞病毒和呼吸道合胞體病 毒）引起的感染、中和毒素（例如破傷風(fēng)毒素和肉毒桿菌毒素）或預(yù)防Rhesus D同種異體 移植物免疫。以下事實(shí)阻止了血清來(lái)源的多克隆抗體制劑更廣泛的應(yīng)用：來(lái)源血漿僅可用 于有限范圍的靶標(biāo)，例如感染性疾病和毒素。此外，在數(shù)量和適宜性二者方面，產(chǎn)品高度依 賴于供體血液的可用性，導(dǎo)致批次之間相當(dāng)大的差異。此外，篩選技術(shù)跟不上不斷進(jìn)化的病 毒，因此，免疫球蛋白產(chǎn)品具有傳播傳染性疾病的潛在風(fēng)險(xiǎn)。最后，血液采集、篩選和免疫球 蛋白純化的漫長(zhǎng)過(guò)程意味著血漿來(lái)源的免疫球蛋白生產(chǎn)昂貴。
[0004] 單克隆抗體的混合物可以提高單克隆抗體的效力，同時(shí)避免了與血清來(lái)源的多克 隆抗體有關(guān)的局限性。在本領(lǐng)域中，已經(jīng)在臨床前模型和臨床試驗(yàn)中測(cè)試了兩種人的或人 源化單克隆抗體的組合（例如針對(duì)J1ER2受體的兩種單克隆抗體的混合物，針對(duì)EGFR受體 的兩種抗體的混合物、針對(duì)狂犬病病毒的兩種單克隆抗體）。在本領(lǐng)域中，已經(jīng)顯示出兩種 單克隆抗體的組合可具有附加效應(yīng)或協(xié)同效應(yīng)，并且招募與任一單獨(dú)的抗體都不相關(guān)的效 應(yīng)機(jī)制。例如，針對(duì)EGFR或HER2的兩種單克隆抗體的混合物表現(xiàn)為基于下述活性的組合更 強(qiáng)效地殺傷腫瘤細(xì)胞，所述活性包括：加強(qiáng)受體內(nèi)化、提高對(duì)受體的下游信號(hào)通路的阻斷， 以及增強(qiáng)免疫效應(yīng)子介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。對(duì)于基于2種單克隆抗體的組合療法，組成抗體 可分別產(chǎn)生并且在蛋白質(zhì)水平上組合。這種方法的一個(gè)缺點(diǎn)是在臨床試驗(yàn)中單獨(dú)開(kāi)發(fā)2種 抗體并且（部分地）用組合重復(fù)該過(guò)程的費(fèi)用巨大。這導(dǎo)致基于抗體組合的治療的成本不 可接受?；蛘撸梢詫a(chǎn)生組成單克隆抗體的2種重組細(xì)胞系在發(fā)酵罐中混合，并且可將所 得抗體混合物純化作為單一制劑（W02004/061104)。這種方法的一個(gè)缺點(diǎn)是其組成的控制 性差，因此所得重組多克隆抗體制劑的再現(xiàn)性差，尤其是考慮到這樣的組成可能在細(xì)胞被 培養(yǎng)時(shí)隨著時(shí)間而改變，更是如此。
[0005] 在過(guò)去的十年中，出現(xiàn)了雙特異性抗體來(lái)作為使用2種抗體的組合的一種替代選 擇。雖然，2種抗體的組合代表了與相同或不同靶標(biāo)上的不同表位結(jié)合的2種不同的免疫 球蛋白分子的混合物，而在雙特異性抗體中，這通過(guò)單個(gè)免疫球蛋白分子實(shí)現(xiàn)。通過(guò)與相同 或不同靶標(biāo)上的2個(gè)表位結(jié)合，雙特異性抗體可具有與同相同表位結(jié)合之2種抗體的組合 相比類似的效果。此外，在單一制劑中由于IgG形式的雙特異性抗體與單個(gè)分子中的2個(gè) 不同的單價(jià)結(jié)合區(qū)組合以及2個(gè)IgG抗體的混合物與2個(gè)不同的二價(jià)結(jié)合分子組合，也已 經(jīng)觀察到了這些形式的不同效果。從技術(shù)和管理角度來(lái)看，由于制造、臨床前試驗(yàn)和臨床試 驗(yàn)涉及單一分子，這使得開(kāi)發(fā)單一雙特異性抗體的復(fù)雜性較低。因此，復(fù)雜性較低并且具有 成本效益的藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程同時(shí)提供更有效的抗體治療，促進(jìn)了基于單一雙特異性抗體的療 法。
[0006] 已通過(guò)多種方法產(chǎn)生了基于IgG形式的雙特異性抗體，其由兩條重鏈和兩條輕鏈 構(gòu)成。例如，可以通過(guò)使兩個(gè)抗體分泌性細(xì)胞系融合以產(chǎn)生新的細(xì)胞系或通過(guò)用重組DNA 技術(shù)在單個(gè)細(xì)胞中表達(dá)兩種抗體來(lái)產(chǎn)生雙特異性抗體。這些方法產(chǎn)生了多種抗體，這是因 為來(lái)自每個(gè)抗體的各自的重鏈可能形成單特異性二聚體（也稱為同二聚體），其包含兩個(gè) 相同的具有相同特異性的配對(duì)重鏈，以及雙特異性二聚物（也稱為異二聚體），其包含兩個(gè) 不同的具有不同特異性的配對(duì)重鏈。此外，來(lái)自各個(gè)抗體的輕鏈和重鏈可隨機(jī)配對(duì)形成不 適當(dāng)?shù)?、非功能性的組合。這個(gè)問(wèn)題被稱為重鏈和輕鏈的錯(cuò)配對(duì)，可以通過(guò)選擇用具有共同 輕鏈的抗體表達(dá)為雙特異性來(lái)解決。但即使在使用共同輕鏈時(shí)，在單個(gè)細(xì)胞中表達(dá)兩種重 鏈和一種共同輕鏈也將產(chǎn)生3種不同的抗體種類，即2種單特異性的"親本"抗體和所述雙 特異性抗體，所以需要從所得抗體混合物中純化目的雙特異性抗體。雖然已經(jīng)使用技術(shù)來(lái) 進(jìn)一步提高雙特異性抗體在親本抗體和雙特異性抗體之混合物中的百分率并降低重鏈和 輕鏈錯(cuò)配對(duì)的百分率，但仍需要消除或最小化上面提到的一些缺點(diǎn)的雙特異性形式。
[0007] 總之，本領(lǐng)域提供了多種用于產(chǎn)生隨后可用于患者中的治療應(yīng)用的單克隆抗體、 雙特異性抗體、單克隆抗體的混合物、或單特異性抗體和雙特異性抗體的混合物的技術(shù)和 方法。然而，如上面所討論的，每一種這些現(xiàn)有的技術(shù)和方法都有其缺點(diǎn)和局限性。因此， 需要用于產(chǎn)生祀向多種疾病調(diào)節(jié)分子（disease-modifying molecule)的混合物形式或雙 特異性方式的生物治療劑的改進(jìn)的和/或替代的技術(shù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了用于改進(jìn)和/.或替選的技術(shù)之方法和手段，所述方法和手段用于 產(chǎn)生靶向多種疾病調(diào)節(jié)分子的混合物形式或雙特異性方式的生物治療劑，以及由這些方法 和手段得到的產(chǎn)品和用途。
[0009] 在本領(lǐng)域中描述了多種方法來(lái)促進(jìn)某種目的雙特異性抗體的形成，從而減少所得 混合物中不希望的抗體的含量。
[0010] 對(duì)于抗體，眾所周知的是CH3-CH3相互作用是Fc二聚化的主要驅(qū)動(dòng)力（Ellerson JR 等，J.I 臟 unol 1976(第 116 卷）第510-517 頁(yè)；Deisenhofer J. biochemistry 1981 (第 20卷）第2361-2370頁(yè)）。另外眾所周知的是，當(dāng)兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域彼此相互作用時(shí)，它們 在包含"接觸"殘基（也稱為接觸氨基酸、界面殘基或界面氨基酸）的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)界面 接觸。第一 CH3結(jié)構(gòu)域的接觸氨基酸與第二CH3結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或更多個(gè)接觸氨基酸相互 作用。在抗體三維結(jié)構(gòu)中，接觸氨基酸彼此通常在5. 5埃（優(yōu)選在4. 5埃）內(nèi)。來(lái)自一個(gè) CH3結(jié)構(gòu)域的接觸殘基與來(lái)自不同的CH3結(jié)構(gòu)域的接觸殘基之間的相互作用可能通過(guò)例如 范德華力、氫鍵、水介導(dǎo)的氫鍵、鹽橋或其他靜電力、芳香族側(cè)鏈之間的吸引相互作用、二硫 鍵，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他力。之前已經(jīng)表明，在人IgGl的CH3結(jié)構(gòu)域界面處大約 三分之一的接觸氨基酸側(cè)鏈可能是結(jié)構(gòu)域折疊和締合的主要貢獻(xiàn)者?？梢赃M(jìn)一步設(shè)想，其 他（相鄰）的氨基酸殘基可能影響蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)界面中的相互作用。
[0011] 在本領(lǐng)域中已應(yīng)用了干擾抗體重鏈二聚化的方法。在CH3結(jié)構(gòu)域中進(jìn)行特定改造 以比同二聚化更有利于異二聚化。CH3-CH3界面的這樣改造的實(shí)例包括引入互補(bǔ)的突起突 變和空腔突變，也被稱為"結(jié)進(jìn)孔（knob-into-hole) "方法，例如W01998/050431、Ridgeway 等（1996)和Merchant等（1998)中所描述的。
[0012] 通常，該方法包括在第一多肽的界面引入突起以及在第二多肽的界面引入對(duì)應(yīng)的 空腔，這樣所述突起可置于所述空腔中，從而促進(jìn)異多聚體的形成而阻礙同多聚體的形成。 "突起"或"結(jié)"通過(guò)用較大側(cè)鏈（例如酪氨酸或色氨酸）替換第一多肽界面的小的氨基酸 側(cè)鏈而構(gòu)建。與突起相同或相似大小的補(bǔ)償性的（compensatory) "空腔"或"孔"通過(guò)用 較小的氨基酸側(cè)鏈（例如丙氨酸或蘇氨酸）替換大氨基酸側(cè)鏈而在第二多肽界面產(chǎn)生。突 起和空腔可以通過(guò)合成手段（例如改變?cè)摼幋a多肽的核酸）或通過(guò)肽合成而制得。
[0013] 單獨(dú)使用結(jié)進(jìn)孔技術(shù)，目的雙特異性抗體在2種親本抗體和雙特異性抗體混合物 中的比例最多為87%。通過(guò)在CH3-CH3界面的兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域之間引入另外的二硫鍵， Merchant等人成功地將雙特異性抗體的比例提高至混合物的95%。盡管如此，為了將這樣 的雙特異性抗體用作藥物，還必須將雙特異性抗體從同二聚體中被純化（分離）出來(lái)，并配 制到可藥用稀釋劑或賦形劑中。由于同二聚體和異二聚體的物理化學(xué)性質(zhì)的相似性，從這 種混合物中純化異二聚體是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于在單個(gè)細(xì)胞克隆 中產(chǎn)生雙特異性抗體并且雙特異性抗體在混合物中的比例的方法。因此，根據(jù)本發(fā)明，可使 用結(jié)進(jìn)孔技術(shù)作為一種手段（單獨(dú)或與其他手段一起）來(lái)實(shí)現(xiàn)在混合物中所述進(jìn)一步提高 的雙特異性比例。
[0014] CH3-CH3界面的這種改造的另一個(gè)實(shí)例由異二聚體Fc技術(shù)提供，通過(guò)設(shè)計(jì)鏈交換 改造結(jié)構(gòu)域（strand-exchange engineered domain，SEED) CH3異二聚體，其支持雙特異性 并且不對(duì)稱的融合蛋白的設(shè)計(jì)。這些SEED CH3異二聚體是由人IgA和IgG的CH3序列的 交替片段組成的人IgG和IgA CH3結(jié)構(gòu)域的衍生物，其導(dǎo)致了互補(bǔ)的人SEED CH3異二聚 體的配對(duì)，即所謂的 SEED-體（Davis JH?等，Protein Engineering，Design&Selection 2010 (第 23 卷）第 1%_2〇2 頁(yè)；W〇2〇〇7/ll〇2〇5)。
[0015] 用于產(chǎn)生給定的目的雙特異性抗體的另一種方法是基于CH3-CH3界面內(nèi)天然 帶電的接觸殘基的靜電性改造，例如在EP01870459或US2010/0015133、W02007/147901、 W02010/129304, Gunasekaran 等（2010)和 W02009/089004 中所描述的。這些出版物描述 了在重鏈CH3結(jié)構(gòu)域中的突變，其中天然存在的帶電氨基酸的接觸殘基被相反電荷的氨基 酸殘基替換（即電荷逆轉(zhuǎn)策略）。這就造成跨Fc二聚體界面改變的電荷極性，這樣靜電匹 配的Fc鏈的共表達(dá)支持有利的吸引性相互作用，從而促進(jìn)所需要的Fc異二聚體的形成，而 不利的排斥性電荷相互作用抑制不期望的Fc同二聚體的形成。
[0016] 根據(jù)描述，CH3-CH3界面內(nèi)四個(gè)獨(dú)特的帶電殘基對(duì)參與了結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域的相互 作用。這些是0356/1(439'4357/1(370'、1(392/1)399'和0399/1(409'（根據(jù)1^&3丨（1991)編 號(hào)，其中第一鏈中的殘基與第二鏈的殘基通過(guò)"/"分開(kāi)，并且其中的撇號(hào)（'）表示第二鏈中 的殘基編號(hào)）。由于CH3-CH3界面顯示了二次對(duì)稱性，每個(gè)獨(dú)特的電荷對(duì)在完整的IgG中表 示兩次（即，在界面中也存在1(439/1)356'，1(370/^357'，0399/1(392'和1(409/1)399'電荷相 互作用）。利用這種二次對(duì)稱性，已證實(shí)單個(gè)電荷逆轉(zhuǎn)（例如第一鏈中的K409D，或者第二 鏈中的D399'K)導(dǎo)致同二聚體因相同電荷的排斥而形成減少。不同的電荷逆轉(zhuǎn)的組合進(jìn)一 步增強(qiáng)了這種排斥效果。已證實(shí)包含不同的互補(bǔ)的電荷逆轉(zhuǎn)的不同CH3結(jié)構(gòu)域的表達(dá)，可 以驅(qū)動(dòng)異二聚化，導(dǎo)致雙特異性種類在混合物中的比例增加。
[0017] 使用上述方法，可在單個(gè)細(xì)胞中產(chǎn)生比例在約76%至約96%的雙特異性抗體。本 發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于在單個(gè)細(xì)胞中產(chǎn)生雙特異性抗體并且期望的雙特異性抗 體的百分率進(jìn)一步提高的方法。根據(jù)本發(fā)明，可使用靜電改造技術(shù)作為手段之一，單獨(dú)地或 與其他手段（例如結(jié)進(jìn)孔方法）一起，以實(shí)現(xiàn)所述進(jìn)一步提高所期望的（雙特異性）抗體 的百分率。
[0018] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于從單個(gè)宿主細(xì)胞中產(chǎn)生至少兩種不同的免疫 球蛋白樣（Ig-like)分子的方法，其中所述的兩種免疫球蛋白樣分子各自包含能夠形成界 面的兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域，所述方法包括在所述細(xì)胞中提供：
[0019] a)編碼第一含 CH3 結(jié)構(gòu)域之多肽鏈（CH3domain_comprising polypeptide chain)的第一核酸分子，
[0020] b)編碼第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的第二核酸分子，
[0021] c)編碼第三含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的第三核酸分子，以及
[0022] d)編碼第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的第四核酸分子，
[0023] 其中所述核酸分子中的至少兩種具有用于使所述第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈與 所述第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽以及使所述第三含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽與所述第四含CH3結(jié)構(gòu) 域之多肽優(yōu)先配對(duì)的手段，所述方法還包括培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以及使所述至少四種核酸分 子能夠表達(dá)并且從培養(yǎng)物中收獲所述至少兩種不同的免疫球蛋白樣分子的步驟。
[0024] 通常希望產(chǎn)生超過(guò)一種（雙特異性）抗體以例如更有效地干擾參與疾病過(guò)程的多 種生物途徑或者干擾病原體的入侵、復(fù)制和/或傳播。
[0025] 超過(guò)一種雙特異性抗體的混合物對(duì)于某些疾病的治療也特別有用。例如，在用抗 體或小分子藥物的治療過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞使用許多不同的策略發(fā)展出抗性。抗性可能涉及 多種細(xì)胞表面受體以及可溶性分子，并且其被認(rèn)為有利于開(kāi)發(fā)同時(shí)解決多種此類疾病相關(guān) 分子和逃避相關(guān)分子的基于抗體的癌癥治療。在包含超過(guò)2種此類疾病相關(guān)靶分子或表位 和逃避相關(guān)靶分子或表位的情況下，雙特異性抗體的混合物提供一種創(chuàng)新的和有吸引力的 治療形式。優(yōu)選地，由單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生這種雙特異性抗體的混合物以有利于藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程， 即，從管理角度看復(fù)雜性較低，從藥物制造和臨床開(kāi)發(fā)的角度看具有成本效益并且可行。在 基于單個(gè)細(xì)胞的方法中，希望使用能夠進(jìn)行控制并且有效產(chǎn)生雙特異性抗體的方法，從而 減少或甚至完全消除對(duì)從不期望單特異性的IgG分子中分離期望雙特異性IgG分子的混合 物的需求。在現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)由單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生了單特異性抗體和雙特異性抗體的混合物 (W02004/009618)，但這些混合物代表多種不同的雙特異性和單特異性抗體種類的復(fù)雜混 合（concoction)。本發(fā)明的另一個(gè)目是提供用于在單個(gè)細(xì)胞中產(chǎn)生限定的雙特異性抗體 混合物的手段和方法。優(yōu)選地，不論單體副產(chǎn)物的量如何，提供的方法使得（雙特異性）抗 體的混合物占二聚體IgG分子的比例為至少95%、至少97%或甚至超過(guò)99%，參見(jiàn)本文下 文。通常，在產(chǎn)生多個(gè)完整的IgG分子的細(xì)胞中，可能存在能夠通過(guò)本領(lǐng)域已知的尺寸排阻 色譜法簡(jiǎn)單地除去的半分子（單體副產(chǎn)物）。
[0026] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于在單個(gè)細(xì)胞中產(chǎn)生至少兩種不同的免疫球蛋 白樣分子的限定混合物而不是單一目的（雙特異性）抗體的方法，其中其他的不期望二聚 抗體種類的形成減少或者甚至不存在。所得混合物是良好限定的，并且其組成由CH3結(jié)構(gòu) 域突變體的設(shè)計(jì)來(lái)控制。此外，表達(dá)水平和/或用于表達(dá)的不同轉(zhuǎn)染比率的調(diào)節(jié)影響混合 物的組成。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，第一核酸分子編碼優(yōu)先與由第二核酸分子編碼的CH3 結(jié)構(gòu)域配對(duì)的CH3結(jié)構(gòu)域，而第三核酸分子編碼優(yōu)先與由第四核酸分子編碼的CH3結(jié)構(gòu)域 配對(duì)的CH3結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還提供了可由本發(fā)明的方法獲得的至少兩種不同的免疫球蛋白 樣分子的混合物。
[0027] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"所述第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽與所述第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多 肽優(yōu)先配對(duì)"是指基本上所有包含第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽和/或第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多 肽的所得二聚體都是由與一個(gè)第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽配對(duì)的一個(gè)第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多 肽組成的二聚體。同樣，術(shù)語(yǔ)"所述第三含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽和所述第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多 肽優(yōu)先配對(duì)"是指基本上所有包含第三含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽和/或第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多 肽的所得二聚體都是由與一個(gè)第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽配對(duì)的一個(gè)第三含CH3結(jié)構(gòu)域之多 肽組成的二聚體。結(jié)果是，當(dāng)向單個(gè)細(xì)胞中引入編碼四種不同的（A、B、C、D)含CH3結(jié)構(gòu)域 之多肽的核酸分子時(shí)，產(chǎn)生的主要是兩種特定的免疫球蛋白樣分子的混合物，而不是10種 不同免疫球蛋白樣的二聚體仏4、483(：、40、88、8(：、80、0：、0)和00)的混合物。
[0028] 如下文更詳細(xì)地解釋的，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多 肽鏈包含氨基酸替換T366K，并且所述第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈包含氨基酸替換L351D。 這些氨基酸改變是用于使所述第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈與所述第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽 鏈優(yōu)先配對(duì)的優(yōu)選手段。所述第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈優(yōu)選還包含氨基酸替換L351K。此 夕卜，所述第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈優(yōu)選還包含選自Y349E、Y349D和L368E的氨基酸替換， 最優(yōu)選L368E。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第三含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈包含氨基酸替 換E356K和D399K，并且所述第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈包含氨基酸替換K392D和K409D。
[0029] 在根據(jù)本發(fā)明的方法中，每一種含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈優(yōu)選還包含識(shí)別靶表位的 可變區(qū)。作為含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的一部分的該可變區(qū)優(yōu)選地具有共同的輕鏈。在這種 情況下，只有可變區(qū)的VH不同，而所有可變區(qū)中的VL基本相同。因此，在一個(gè)優(yōu)選方面，提 供了一種根據(jù)本發(fā)明的方法，其還包括為所述宿主細(xì)胞提供編碼共同輕鏈的核酸分子。在 一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述4個(gè)含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的4個(gè)可變區(qū)各自識(shí)別不同 的靶表位。舉例來(lái)說(shuō)，如果所述第一核酸分子編碼的重鏈還包含抗原A特異性的可變結(jié)構(gòu) 域，所述第二核酸分子編碼的重鏈還包含抗原B特異性的可變結(jié)構(gòu)域，所述第三核酸分子 編碼的重鏈還包含抗原C特異性的可變結(jié)構(gòu)域，所述第四核酸分子編碼的重鏈還包含抗原 D特異性的可變結(jié)構(gòu)域，那么然后，將產(chǎn)生含有AB特異性的雙特異性免疫球蛋白樣分子和 CD特異性的雙特異性免疫球蛋白樣分子的混合物。由于使所述第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽與 第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽優(yōu)先配對(duì)以及使所述第三含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽與第四含CH3結(jié)構(gòu) 域之多肽優(yōu)先配對(duì)的手段，單特異性抗體（具有AA、BB、CC或DD特異性）或具有AC、AD、BC 或BD特異性的雙特異性抗體的形成被降低或甚至不存在。當(dāng)然，可使用另外的核酸分子， 例如編碼第五含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽和第六含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽的核酸分子以產(chǎn)生包含超過(guò) 兩種不同免疫球蛋白樣分子的限定混合物。
[0030] 值得注意的是，在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的核酸的比率未必是1 : 1 : 1 : 1， 并且所表達(dá)得到的免疫球蛋白樣分子的比率未必是1 : 1。可使用本領(lǐng)域中已知的手段來(lái) 產(chǎn)生具有最佳比率的抗體混合物。例如，通過(guò)使用不同的遺傳元件（例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和 抑制子）或通過(guò)控制編碼抗體的DNA構(gòu)建體的基因組整合位點(diǎn)的拷貝數(shù)，可以調(diào)節(jié)核酸分 子的表達(dá)水平并由此調(diào)節(jié)所產(chǎn)生得到的免疫球蛋白樣分子的比率。
[0031] 用于優(yōu)先配對(duì)的所述手段優(yōu)選地可包括經(jīng)改造的互補(bǔ)結(jié)進(jìn)孔突變、二硫鍵、電荷 突變（包括電荷逆轉(zhuǎn)突變），或它們的組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以在某些類型的突 變中選擇所述用于優(yōu)先配對(duì)的手段，即，所有至少4種編碼含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的核酸分 子全部可以包含例如電荷突變作為用于優(yōu)先配對(duì)的手段。另外，在某些情況下，未經(jīng)改造的 野生型CH3也可用于使兩種野生型的含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈優(yōu)先配對(duì)。在一個(gè)特別優(yōu)選的 實(shí)施方案中，所述用于優(yōu)先配對(duì)的手段包括選自表B中的至少一種CH3突變，如在本申請(qǐng)的 其他部分中所解釋的。因此，一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案提供了根據(jù)本發(fā)明的一種方法，其中所有 4種核酸分子均具有用于使所述第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽與所述第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽 以及使所述第三含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽與所述第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽優(yōu)先配對(duì)的手段，其 中用于使所述第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽與所述第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽優(yōu)先配對(duì)的所述手 段不同于用于使所述第三含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽與所述第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽優(yōu)先配對(duì)的 那些手段。
[0032] 本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種根據(jù)本發(fā)明的方法，其中用于使所述第一含CH3結(jié) 構(gòu)域之多肽與所述第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽優(yōu)先配對(duì)的所述手段不同于用于使所述第三 含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽與所述第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽優(yōu)先配對(duì)的所述手段。"不同于"意指， 設(shè)計(jì)用于使所述第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽與所述第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽優(yōu)先配對(duì)的所述 手段，以使得有利于第一鏈和第二鏈的優(yōu)先配對(duì)。該設(shè)計(jì)使得基本上不發(fā)生第一含CH3結(jié) 構(gòu)域之多肽鏈與第三和/或第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈之間的相互作用。換句話說(shuō)，所述 第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽與所述第三多肽或第四多肽之間的二聚化被降低到基本為零，等 等。第三含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽和第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽可以是野生型的，或者可以包含 用于優(yōu)先配對(duì)的手段，其中所述手段不同于用于使第一 CH3結(jié)構(gòu)域與第二CH3結(jié)構(gòu)域優(yōu)先 配對(duì)的手段。目前的研宄集中在使用例如結(jié)進(jìn)孔技術(shù)或使存在于CH3結(jié)構(gòu)域中的帶電接觸 氨基酸突變（逆轉(zhuǎn)）來(lái)產(chǎn)生單種雙特異性抗體。然而，在本發(fā)明之前，還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生至少 兩種（雙特異性）免疫球蛋白樣分子的限定混合物而沒(méi)有顯著共產(chǎn)生其他二聚物副產(chǎn)物。
[0033] 本發(fā)明提供了用于高效并且可控地產(chǎn)生良好限定的免疫球蛋白樣分子的混合物 并且在混合物中具有高的雙特異性比例的方法。在需要兩種雙特異性的系統(tǒng)中，甚至獲得 了至少95%、至少97%或更高的（兩種）雙特異性的比例。這意味著，僅獲得了至多5%、 至多3%或更少的單特異性二價(jià)副產(chǎn)物。值得注意的是，單體副產(chǎn)物（即半分子）的量不那 么重要，因?yàn)檫@些半分子可利用其大小差異容易地從二聚體中分離。
[0034] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一和第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變區(qū)識(shí)別不 同的靶表位，而第三和第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變區(qū)識(shí)別相同的靶表位。這將導(dǎo)致 主要產(chǎn)生一種雙特異性免疫球蛋白樣分子和一種單特異性免疫球蛋白樣分子。例如，如果 第一和第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變區(qū)識(shí)別不同的靶表位，并且如果第三和第四含 CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變區(qū)二者識(shí)別不同于第一和第二CH3結(jié)構(gòu)域所識(shí)別靶表位的相同 靶表位，則將形成具有AB或CC特異性的免疫球蛋白樣分子的混合物。因此，還提供了一種 根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，第三和第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變區(qū)識(shí)別的靶表位相同， 但是不同于第一或第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變區(qū)識(shí)別的靶表位。
[0035] 或者，當(dāng)?shù)谝缓偷诙珻H3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變區(qū)識(shí)別不同的靶表位，并且當(dāng) 第三和第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變區(qū)二者與第一或第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈識(shí)別 相同的表位時(shí)，將形成具有AB和AA，或AB和BB特異性的免疫球蛋白樣分子的混合物。因 此，隨之提供了一種根據(jù)本發(fā)明的方法，其中第三和第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變區(qū) 識(shí)別的靶表位與第一或第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變區(qū)識(shí)別的靶表位相同。本發(fā)明的 另一個(gè)目的是提供一種在單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生雙特異性抗體和單特異性抗體的限定混 合物的手段和方法。這樣良好限定的混合物的一個(gè)非限制性實(shí)例是具有AB特異性的雙特 異性抗體和具有AA特異性的單特異性抗體的混合物。另一個(gè)實(shí)例是具有AB特異性的雙特 異性抗體和具有BB特異性的單特異性抗體的混合物。另一個(gè)實(shí)例是具有AB特異性的雙特 異性抗體和具有CC特異性的單特異性抗體的混合物。另外，提供優(yōu)選的手段和方法，其產(chǎn) 生目的抗體為至少90%、更優(yōu)選至少95 %且最優(yōu)選至少97 %或甚至99%以上的期望抗體 的混合物。
[0036] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種根據(jù)本發(fā)明方法，其中，第一和第二含CH3結(jié)構(gòu) 域之多肽鏈的可變區(qū)識(shí)別相同的靶表位，而第三和第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈可變區(qū)識(shí)別 第二靶表位，所述第二靶表位不同于所述第一和第二可變區(qū)識(shí)別的靶表位。這將導(dǎo)致主要 產(chǎn)生具有AA特異性或BB特異性的單特異性免疫球蛋白樣分子。雙特異性免疫球蛋白樣分 子的形成被減少或甚至避免。在多個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選在單個(gè)細(xì)胞中產(chǎn)生單特異性抗體的 混合物，而不是雙特異性抗體的混合物。例如，當(dāng)需要兩個(gè)相同的靶分子交聯(lián)時(shí)，或者當(dāng)兩 個(gè)靶標(biāo)彼此位置過(guò)遠(yuǎn)而無(wú)法將其通過(guò)單個(gè)雙特異性抗體結(jié)合時(shí)。在單個(gè)細(xì)胞中產(chǎn)生單特異 性抗體的混合物也可能是有利的，因?yàn)樗龌旌衔锟梢员豢醋魇菃我恢委煯a(chǎn)物。在本領(lǐng)域 中，多種單特異性抗體的治療效果及安全性已被證實(shí)并且已經(jīng)獲得了市場(chǎng)授權(quán)。在單個(gè)細(xì) 胞中產(chǎn)生單特異性抗體的混合物將因此有利于測(cè)試數(shù)種這樣的混合物的效果和安全性，并 將減少注冊(cè)審批和制造的精力和成本。然而，目前沒(méi)有可用于在單個(gè)細(xì)胞中產(chǎn)生單特異性 抗體的特定混合物且其中雙特異性副產(chǎn)物的形成降到低于5%的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目 的是提供在單個(gè)細(xì)胞中產(chǎn)生這種良好限定的同二聚體抗體混合物且其中雙特異性抗體的 形成被降到低于5%的手段和方法。
[0037] 因此，一種根據(jù)本發(fā)明的方法適于產(chǎn)生任何期望的雙特異性和/或單特異性免疫 球蛋白樣分子的混合物。此外，可以使用另外的核酸分子，例如編碼第五和第六（以及第七 和第八等）含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽的核酸分子，以產(chǎn)生包含超過(guò)兩種不同免疫球蛋白樣分子 的限定混合物。
[0038] 優(yōu)選地，在一種根據(jù)本發(fā)明的方法中，使用至少兩個(gè)這樣的CH3結(jié)構(gòu)域，其包含由 本發(fā)明提供的突變的至少一種組合。通過(guò)這些突變，在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域之間形成了新的特 異性相互作用。根據(jù)本發(fā)明的這些突變將在下面更詳細(xì)地討論。
[0039] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"免疫球蛋白樣分子"指的是具有至少一個(gè)免疫球蛋白（Ig) 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)分子。所述免疫球蛋白樣分子包含具有至少免疫球蛋白CH3結(jié)構(gòu)域 的功能的序列，優(yōu)選包含IgGl的CH3結(jié)構(gòu)域的序列。具有至少一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的蛋白 分子可以進(jìn)一步配備有特定的結(jié)合部分。因此，可將包含用于優(yōu)先配對(duì)之手段的本發(fā) 明CH3結(jié)構(gòu)域用于使兩種含CH3結(jié)構(gòu)域之蛋白分子優(yōu)先配對(duì)，以設(shè)計(jì)需要的異二聚體 的結(jié)合分子或結(jié)合分子的混合物?？蓪⑴c含CH3結(jié)構(gòu)域之蛋白質(zhì)分子結(jié)合的部分設(shè)計(jì) 為是任何結(jié)合件（binding agent)，包括但不限于，單鏈Fvs、單鏈或串聯(lián)雙體（Tandem diabodie s) ( TandAb? )、vhh、 Anticalins?、 Nanobodies?、BiTE?、 Fab、錨蛋白重復(fù)蛋白或DARPINs?、Avimersd)、dart、tcr樣抗體、 Adnectins?、Affilins?、Trans-bodies?、Affibodies?、 Trimei'X?、 MicroProteins、Fynomers?、Centyrins?.或 KAI」B丨TOROI>。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方 案中，結(jié)合部分是抗體可變區(qū)（即vh/vl組合）。作為含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的一部分的 可變區(qū)優(yōu)選具有共同輕鏈。在這種情況下，僅可變區(qū)的VH不同，而所有可變區(qū)的VL基本相 同。
[0040] 替選地或另外地，其他分子可以被設(shè)計(jì)到本發(fā)明的CH3結(jié)構(gòu)域，所述其他分子包 括細(xì)胞因子、激素、可溶性配體、受體和/或肽。
[0041] 在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白樣分子包含全長(zhǎng)Fc骨架。在一個(gè)最 優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫球蛋白樣分子是抗體。這些抗體的可變區(qū)優(yōu)選具有共同輕鏈，但是 其VH區(qū)可以不同。本文所用的術(shù)語(yǔ)"抗體"是指屬于免疫球蛋白蛋白質(zhì)類的蛋白質(zhì)分子， 其含有與抗原上的表位結(jié)合的一個(gè)或更多個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中這樣的結(jié)構(gòu)域來(lái)自于抗體的可變 區(qū)或與抗體的可變區(qū)具有序列同源性。抗體是本領(lǐng)域已知的，并且包括多種同種型，例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE和IgM。根據(jù)本發(fā)明的抗體可以是這些同種型的任 一種，或其功能衍生物和/或其片段。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，產(chǎn)生的免疫球蛋白樣分子是 IgG同種型的抗體，因?yàn)镮gG抗體相比于其他同種型的抗體例如具有較長(zhǎng)的半衰期。
[0042] 利用根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的抗體可以具有任何起源的序列，包括小鼠和人的序 列?？贵w可以由僅來(lái)自一種來(lái)源的序列組成，例如全人抗體，或者它們可以具有超過(guò)一種來(lái) 源的序列，例如產(chǎn)生嵌合抗體或人源化抗體。用于治療用途的抗體優(yōu)選盡可能地是待治療 對(duì)象的天然抗體（例如人抗體用于人對(duì)象）?？贵w的結(jié)合可以表示在特異性和親和力方面。 特異性決定了哪一種抗原或其表位與結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合。親和力是與特定抗原或表位的結(jié)合 強(qiáng)度的度量。特異性結(jié)合被定義為具有至少1x1(T5M、更優(yōu)選1X1(T7M、更優(yōu)選高于1X1(T9M 的親和力（Kd)的結(jié)合。通常，對(duì)于治療性應(yīng)用的單克隆抗體具有高達(dá)lXlO^M或甚至更高 的親和力。本文所用的術(shù)語(yǔ)"抗原"是指當(dāng)其被引入體內(nèi)時(shí)觸發(fā)免疫系統(tǒng)的抗體產(chǎn)生的物 質(zhì)或分子?？乖瓤蓙?lái)源于病原生物體、腫瘤細(xì)胞或其他異常細(xì)胞，可衍生自半抗原，或甚 至是其自身結(jié)構(gòu)。在分子水平上，抗原的特征是其能夠與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合?？乖?的混合物也可以被看作是"抗原"，即本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，有時(shí)腫瘤細(xì)胞的裂解 物或病毒顆?？梢员槐硎緸?抗原"，然而這樣的腫瘤細(xì)胞裂解物或病毒顆粒制劑中存在許 多抗原決定簇?？乖辽僖粋€(gè)，但往往更多個(gè)表位。本文所用的術(shù)語(yǔ)"表位"是指被免 疫系統(tǒng)、特別是抗體、B細(xì)胞，或T細(xì)胞識(shí)別的抗原部分。雖然表位通常被認(rèn)為來(lái)源于非自 身蛋白質(zhì)，但是來(lái)源于宿主的可被識(shí)別序列也可被認(rèn)為歸類為表位。
[0043] 術(shù)語(yǔ)"CH3結(jié)構(gòu)域"在本領(lǐng)域中是公知的。IgG的結(jié)構(gòu)有四條鏈，兩條輕鏈和兩條 重鏈；每條輕鏈具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，可變輕鏈和恒定輕鏈（VL和CL)，且每條重鏈具有四個(gè)結(jié) 構(gòu)域，可變重鏈（VH)和三個(gè)恒定重鏈結(jié)構(gòu)域（CH1、CH2、CH3)。重鏈的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域區(qū) 域被稱為Fc (可結(jié)晶片段）部分、Fc片段、Fc骨架或簡(jiǎn)單地Fc。IgG分子是具有兩條重鏈 和兩條輕鏈的異四聚體，其中所述重鏈?zhǔn)峭ㄟ^(guò)鉸鏈區(qū)的二硫鍵（-S-S-)結(jié)合在一起的。重 鏈通過(guò)在CH3-CH3結(jié)構(gòu)域界面的相互作用以及通過(guò)在鉸鏈區(qū)的相互作用二聚化。鉸鏈二硫 鍵的數(shù)目在免疫球蛋白亞類中各不相同（Papadea和Check 1989年）。免疫球蛋白分子的 Fc片段是重鏈兩個(gè)C末端恒定區(qū)（即CH2和CH3結(jié)構(gòu)域）的二聚體。其生理功能是與補(bǔ)體 系統(tǒng)以及與多種細(xì)胞表面上的特異性受體相互作用等。已知兩條單獨(dú)重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域之 間的相互作用在驅(qū)動(dòng)重鏈二聚化中發(fā)揮重要作用。因此，CH3結(jié)構(gòu)域指導(dǎo)抗體重鏈的締合， 并且已知的是CH3結(jié)構(gòu)域之間的界面包含有來(lái)自每條鏈的超過(guò)20個(gè)接觸殘基，所述接觸殘 基在CH3-CH3相互作用中發(fā)揮作用（Deisenhofer J.，Biochemistry 1981 (第20卷）第 2361-2370 頁(yè)；Miller S.，J.Mol. Biol. 1990 (第 216 卷）第 965-973 頁(yè)；Padlan，Advances in Protein Chemistry 1996 (第49卷）第57-133頁(yè)）。本發(fā)明的CH3變體因此可以用于 與其他抗體結(jié)構(gòu)域締合，以產(chǎn)生雙特異性的或單特異性的全長(zhǎng)抗體。由VH/VL的組合所限 定抗體的特異性通常不影響由CH3結(jié)構(gòu)域驅(qū)動(dòng)的重鏈的二聚化行為。
[0044] 本文中使用的術(shù)語(yǔ)"接觸殘基"、"接觸氨基酸"、"界面殘基"和"界面氨基酸"通 常是指存在于CH3結(jié)構(gòu)域中的任何可參與域間接觸的氨基酸殘基，如可以通過(guò)本領(lǐng)域已 知技術(shù)計(jì)算，包括計(jì)算存在和不存在第二鏈的情況下CH3結(jié)構(gòu)域殘基的溶劑可及表面積 (ASA)(Lee和RichardsJ.Mol.Biol. 1971 (55) 379)，其中這兩種計(jì)算之間顯示出ASA差異 ( >丨人2 )的殘基被鑒定為接觸殘基。根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)，已鑒定的接觸殘基包括在位置347、 349、350、351、352、353、354、355、356、357、360、364、366、368、370、390、392、394、395、397、 399、400、405、407、409、439 處的殘基（表 A)。
[0045] 表A:CH3結(jié)構(gòu)域界面殘基列表
[0046]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于從單個(gè)宿主細(xì)胞產(chǎn)生至少兩種不同的免疫球蛋白樣分子的方法，其中所述 兩種免疫球蛋白樣分子各自包含能夠形成界面的兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域，所述方法包括在所述細(xì) 胞中提供： a. 編碼第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的第一核酸分子， b. 編碼第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的第二核酸分子， c. 編碼第三含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的第三核酸分子，和 d. 編碼第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的第四核酸分子， 其中，所述核酸分子中的至少兩種具有用于使所述第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽與所述第 二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽以及使所述第三含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽與所述第四含CH3結(jié)構(gòu)之多肽 鏈優(yōu)先配對(duì)的手段，所述方法還包括培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞并且使所述至少四種核酸分子能夠 表達(dá)以及從培養(yǎng)物中收獲所述至少兩種不同的免疫球蛋白樣分子的步驟。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其還包括為所述宿主細(xì)胞提供編碼共同輕鏈的核酸分子。
3. 權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈包含氨基酸替換 T366K，并且所述第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈包含氨基酸替換L351D。
4. 權(quán)利要求3所述的方法，其中所述第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈還包含氨基酸替換 L351K〇
5. 權(quán)利要求3或4所述的方法，其中所述第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈還包含選自 Y349E、Y349D和L368E的氨基酸替換。
6. 權(quán)利要求5所述的方法，其中所述第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈還包含氨基酸替換 L368E〇
7. 權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第三含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈包含氨 基酸替換E356K和D399K，并且所述第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈包含氨基酸替換K392D和 K409D〇
8. 權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈各自還包含 識(shí)別靶表位的可變區(qū)。
9. 權(quán)利要求8所述的方法，其中4個(gè)所述含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的4個(gè)可變區(qū)各自識(shí) 別不同的靶表位。
10. 權(quán)利要求8所述的方法，其中所述第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變區(qū)和所述第二 含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變區(qū)識(shí)別不同的靶表位，而所述第三含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的 可變區(qū)和所述第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變區(qū)識(shí)別相同的靶表位。
11. 權(quán)利要求10所述的方法，其中所述第三含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變區(qū)和所述第 四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變區(qū)識(shí)別的靶表位與所述第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變 區(qū)或所述第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變區(qū)識(shí)別的靶表位相同。
12. 權(quán)利要求10所述的方法，其中所述第三含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變區(qū)和所述第 四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變區(qū)識(shí)別的靶表位與所述第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變 區(qū)或所述第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變區(qū)識(shí)別的靶表位不同。
13. 權(quán)利要求8所述的方法，其中所述第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變區(qū)和所述第二 含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變區(qū)識(shí)別相同的靶表位，而所述第三含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的 可變區(qū)和所述第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的可變區(qū)識(shí)別不同于所述第一可變區(qū)和所述第 二可變區(qū)識(shí)別之靶表位的第二靶表位。
14. 權(quán)利要求8至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述靶表位位于相同的靶分子上。
15. 權(quán)利要求14所述的方法，其中所述靶分子是可溶性分子。
16. 權(quán)利要求14所述的方法，其中所述靶分子是膜結(jié)合分子。
17. 權(quán)利要求8至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述靶表位位于不同的靶分子上。
18. 權(quán)利要求17所述的方法，其中所述不同的靶分子在相同細(xì)胞上表達(dá)。
19. 權(quán)利要求17所述的方法，其中所述不同的靶分子在不同細(xì)胞上表達(dá)。
20. 權(quán)利要求17所述的方法，其中所述不同的靶分子是可溶性分子。
21. 權(quán)利要求17所述的方法，其中一種靶分子是可溶性分子，而第二種靶分子是膜結(jié) 合分子。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少兩種不同的免疫球蛋白 樣分子是抗體。
23. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述用于優(yōu)先配對(duì)的手段包括經(jīng)改造的互補(bǔ)性結(jié)進(jìn) 孔突變、二硫鍵、電荷突變或其組合。
24. 權(quán)利要求23所述的方法，其中所述用于優(yōu)先配對(duì)的手段選自表B。
25. 權(quán)利要求1所述的方法，其中全部4種所述核酸分子均具有用于使所述第一含CH3 結(jié)構(gòu)域之多肽與所述第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽以及使所述第三含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽與所述 第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽優(yōu)先配對(duì)的手段，其中用于使所述第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽與所 述第二含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽優(yōu)先配對(duì)的所述手段不同于用于使所述第三含CH3結(jié)構(gòu)域之多 肽與所述第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽優(yōu)先配對(duì)的那些手段。
26. 權(quán)利要求8至13、17至19或21中任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一種所述靶表位位 于腫瘤細(xì)胞上。
27. 權(quán)利要求8至13、17至19或21中任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一種所述靶表位位 于效應(yīng)細(xì)胞上。
28. 權(quán)利要求27所述的方法，其中所述效應(yīng)細(xì)胞是NK細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞。
29. 權(quán)利要求27或28所述的方法，其中所述靶表位位于⑶3、⑶16、⑶25、⑶28、⑶64、 CD89、NKG2D 或 NKp46 分子上。
30. 可由根據(jù)權(quán)利要求1至29中任一項(xiàng)所述的方法獲得的至少兩種不同免疫球蛋白樣 分子的混合物。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30的混合物，其中所述至少兩種免疫球蛋白樣分子與相同抗原上的 不同表位和/或不同抗原上的不同表位結(jié)合。
32. 根據(jù)權(quán)利要求30或31的混合物，其中所述至少兩種不同的免疫球蛋白樣分子包括 至少一種異二聚體免疫球蛋白樣分子。
33. 根據(jù)權(quán)利要求30至32中任一項(xiàng)的混合物，其中所述至少兩種不同的免疫球蛋白樣 分子中的兩種是異二聚體免疫球蛋白樣分子。
34. -種重組宿主細(xì)胞，其包含編碼至少第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈、第二含CH3結(jié)構(gòu) 域之多肽鏈、第三含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈和第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的核酸序列，其中所 述核酸序列中的至少兩種具有用于使所述第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽與所述第二含CH3結(jié)構(gòu) 域之多肽以及使所述第三含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽與所述第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽優(yōu)先配對(duì)的 手段。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞還包含編碼共同輕鏈的核酸 序列。
36. -種藥物組合物，其包含權(quán)利要求30至33中任一項(xiàng)所述的至少兩種不同的免疫球 蛋白樣分子以及可藥用載體。
37. 根據(jù)權(quán)利要求36的藥物組合物，其中所述至少兩種不同的免疫球蛋白樣分子是由 根據(jù)權(quán)利要求34或35的重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生的。
38. -種用于制備用來(lái)產(chǎn)生至少兩種不同的免疫球蛋白樣分子的宿主細(xì)胞的方法，所 述方法包括向所述宿主細(xì)胞中引入編碼至少第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈、第二含CH3結(jié)構(gòu) 域之多肽鏈、第三含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈和第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽鏈的核酸序列，其中所 述核酸序列中的至少兩種具有用于使所述第一含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽與所述第二含CH3結(jié)構(gòu) 域之多肽以及使所述第三含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽與所述第四含CH3結(jié)構(gòu)域之多肽優(yōu)先配對(duì)的 手段，其中將所述核酸序列相繼引入或同時(shí)引入。
39. 根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其還包括向所述宿主細(xì)胞中引入編碼共同輕鏈之核酸序 列的步驟。
40. -種權(quán)利要求34或35的重組宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物或者由根據(jù)權(quán)利要求38或39的 方法獲得的重組宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物，其產(chǎn)生至少兩種不同的免疫球蛋白樣分子。
【文檔編號(hào)】C07K16/46GK104520319SQ201380032190
【公開(kāi)日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2013年4月19日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月20日
【發(fā)明者】科內(nèi)利斯·阿德里安·德克呂夫, 林達(dá)·約翰娜·阿萊達(dá)·亨德里克斯, 敦·洛格滕伯格 申請(qǐng)人:莫魯斯有限公司