一種利那洛肽的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于藥物合成【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種采用完全選擇性形成三對二硫鍵合成利那洛肽的方法。使用本發(fā)明的工藝，可以在同一個溶液體系中，依次完成利那洛肽中三對二硫鍵的形成，因此該工藝的操作方法相當(dāng)簡單，同時也大大提高利那洛肽最終精肽的收率，并且可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】一種利那洛肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藥物合成【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種利那洛肽的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]利那洛肽,英文名稱為Linaclotide ;商品名稱為Linzess ;中文通用名稱為利那洛肽。其為一種GC-C (腸上皮細(xì)胞尿苷酸環(huán)化酶C)受體激動劑，2012年8月美國FDA批準(zhǔn)用于治療成人慢性特發(fā)性便秘和便秘型腸易激綜合癥(IBS-C)。該藥物由Iixrnwood制藥公司開發(fā)，化合物結(jié)構(gòu)為14個氨基酸組成的含有三對二硫鍵的多肽(三對二硫鍵分別為:1-6 ；2-10和5-13)，可以通過細(xì)胞表達(dá)和化學(xué)合成制得，具體肽序如下式所示:
[0003]
【權(quán)利要求】
1.一種利那洛肽的制備方法，包括如下步驟: 1)Fmoc-Tyr (tBu)-樹脂的制備:Fmoc-Tyr (tBu)-OH和載體樹脂反應(yīng)，獲得Fmoc-Tyr (tBu)-樹脂； 2)利那洛肽肽樹脂的制備=Fmoc-Tyr(tBu)-樹脂采用逐一偶聯(lián)的方式偶聯(lián)Fmoc保護(hù)基團(tuán)的其他氨基酸，獲得利那洛肽肽樹脂，其中1-6位的Cys側(cè)鏈采用Hqm保護(hù)，2_10位的Cys側(cè)鏈采用Trt保護(hù),5_13位的Cys側(cè)鏈采用Acm保護(hù)； 3)利那洛肽線性肽粗肽的制備:利那洛肽肽樹脂經(jīng)裂解反應(yīng)，獲得帶有Acm保護(hù)基團(tuán)及Hqm保護(hù)基團(tuán)的線性肽粗肽； 4)利那洛肽2-10位第一對二硫鍵的形成:氧氣氧化得到2-10位成環(huán)的第一對二硫鍵； 5)利那洛肽Hqm保護(hù)基團(tuán)的脫除及1-6位第二對二硫鍵的形成:加入水合肼，脫除Hqm保護(hù)基團(tuán)的同時形成第二對二硫鍵； 6)利那洛肽5-13位第三對二硫鍵的形成:加入碘和醋酸，形成第三對二硫鍵； 7)純化和凍干后獲得利那洛肽精肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟I)中的載體樹脂為WangResin,優(yōu)選WangResin的替代度為0.2~1.2mmol/g,更優(yōu)選為0.3~1.0mmol/g,最優(yōu)選為0.6~0.8mmol/g°
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所用的具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸分別為 Fmoc-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-Cys (Acm)-OH、Fmoc-Cys (Trt) -0H> Fmoc-Cys (Hqm) -OH>Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr (tBu) -0H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn (Trt) -OH 和Fmoc-Glu(OtBu)-OH。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟I)中的偶聯(lián)體系為HOBt/DIC/DMAP, HOBt/DCC/DMAP, HOAt/DIC/DMAP, HBTU/HOBt/DIPEA, TBTU/HOBt/DIPEA, PyBOP/HOBt/DIPEA，優(yōu)選為 HOBt/DIC/DMAP 或 HBTU/HOBt/DIPEA。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟2)中逐一偶聯(lián)的方式采用的偶聯(lián)試劑為 DIC+A 或 B+A+C，其中 A 為 HOBt 或 HOAt ；B 為 HBTU、HATU、TBTU 或 PyBOP，C 為 DIPEA或 TMP，優(yōu)選為 HOBt+DIC 或 HOBt+HBTU+DIPEA。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟3)中的裂解試劑為三氟乙酸TFA、三異丙基硅烷TIS、1，2-乙二硫醇EDT、苯酚PhOH和水組成的混合試劑，混合試劑中各組分的體積比優(yōu)選為TFA: TIS: EDT: PhOH: H20=85_95:2-5:0-3:0-2:1-5，更加優(yōu)選為TFA: TIS:EDT:PhOH:H20=90:3:2:1:4 或 TFA:EDT:H20=90:5: 5，裂解時間優(yōu)選為 1.5-3.5 小時。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟4)中2-10位形成第一對二硫鍵采用的是帶Acm和Hqm保護(hù)基團(tuán)肽的水溶液，溶液的濃度為0.l_2mg肽/ml，優(yōu)選濃度為0.1-1mg肽/ml，用氨水調(diào)節(jié)pH為7.0，往其中通入氧氣進(jìn)行氧化，氧化時間為4小時。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟5)中選擇性脫除Hqm保護(hù)基團(tuán)同時形成1-6位第二對二硫鍵采用的是往上述水溶液中加入5%的水合肼，用醋酸和氨水調(diào)節(jié)pH=8.5，空氣下氧化反應(yīng)，反應(yīng)時間為5-44小時，優(yōu)選為10-24小時。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟6)中5-13位形成第三對二硫鍵采用的是往上述水溶液加入相當(dāng)于肽的5-40倍當(dāng)量的碘，優(yōu)選10-30倍當(dāng)量，然后加入水溶液體積20%的醋酸，氧化時間為0.2-1小時，優(yōu)選為0.2-0.5小時。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟7)所述的純化為反相高效液相色譜純化。`
【文檔編號】C07K7/08GK103626849SQ201310617050
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月27日
【發(fā)明者】戴政清, 劉劍, 馬亞平, 袁建成 申請人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司