一種分離純化萊鮑迪甙a的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種萊鮑迪甙A的分離純化方法，其固定相采用磺酸基色譜填料，流動(dòng)相為有機(jī)溶劑水溶液，通過色譜柱平衡、上樣、洗脫而得到高純度萊鮑迪甙A。本發(fā)明采用吸附量大的季胺基色譜填料，得到的產(chǎn)品純度高，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種分離純化萊鮑迪甙A的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種分離純化萊鮑迪甙A的方法，屬于食品化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]甜菊糖是從菊科植物甜葉菊(Stevia rebaudiana Bertoni)中提取的一種天然甜味劑。甜菊糖為糖甙混合物，其中萊鮑迪甙A (Rebaudioside A, RA)的甜度為蔗糖的35(T450倍且口味純正，其高甜度、低熱量的特點(diǎn)特別適宜肥胖癥、糖尿病、高血壓、動(dòng)脈硬化、齲齒患者食用，是蔗糖和其他合成甜味劑的最佳替代品。2008年美國FDA正式給予高純度萊鮑迪甙A (含量> 97%) GRAS ( 一般公認(rèn)安全物質(zhì))地位，因此全球市場(chǎng)對(duì)高純度RA的需求將迅速放大。
[0003]中國是全球甜菊種植面積、甜菊糖產(chǎn)量最大的國家，但因技術(shù)受限、產(chǎn)品以純度較低的RA粗品為主。RA中的主要雜質(zhì)甜菊糖甙(Stevioside，ST)和萊鮑迪甙C(Rebaudioside C，RC)均為RA的結(jié)構(gòu)類似物,后者苦味較重,嚴(yán)重影響甜菊糖的品質(zhì)與售價(jià)。
[0004]目前，已公開高純度RA的制備方法有重結(jié)晶法和色譜法。重結(jié)晶法是利用甜菊糖各糖苷在有機(jī)溶劑如甲醇中溶解度的差異而多次結(jié)晶制備出高純度的RA，該法工序繁瑣、收率較低、溶劑消耗大且成本較高。
[0005]因此，很多研究者嘗試采用色譜法制備高純RA。胡靜(大孔樹脂D107和D108對(duì)甜菊糖中SS和RA的分離研究，食品研究與開發(fā)，2008，29(6): 1-4)采用大孔吸附樹脂D107、D108，以反向色譜模式來精制RA，但效果不甚理想。陳天紅(高分子吸附劑對(duì)甜葉菊中各糖甙吸附選擇性的研究，中國科學(xué)(B輯)，1998，28 (5) =460-465)在疏水骨架上引入不同的基團(tuán)如伯氨基、酮基、吡啶基、酰胺基、葡糖基、酯基等，意圖利用甜菊糖各組分的不同糖基與上述功能基團(tuán)形成氫鍵`能力的差異而增加吸附介質(zhì)對(duì)RA與ST的選擇性。研究表明甜菊糖在上述介質(zhì)上的吸附仍主要為疏水性甙元與骨架間的物理吸附，并未達(dá)到最初的設(shè)計(jì)意圖。
[0006]Dominik Bergs 等人(Preparative purification of rebaudioside A fromaqueous extracts using chromatography: a process idea, J.Verbr.Lebensm.,2012 (7): 295 - 303)采用3步色譜串聯(lián)制備RA，其最后一步精制過程采用伯胺基(-NH(CH2)2NH2)硅膠基質(zhì)色譜填料，洗脫劑為80%乙腈水溶液，最終得到純度為96.8%的RA,該步收率為97.5%。
[0007]美國專利US20120083593公開了一種RA的精制方法。其核心是采用伯胺基(-NH(CH2)2NH2)樹脂，該樹脂歸屬于弱堿性陰離子交換樹脂，樹脂的骨架是聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸酯等高聚物，以水溶性有機(jī)溶劑如甲醇、異丙醇、丙酮、乙腈的組合或5%-40%的丙酮水溶液洗脫，經(jīng)結(jié)晶得到純度> 98%的RA組分。由于樹脂的骨架為高聚物，在不同濃度有機(jī)溶劑條件下存在體積變化，操作時(shí)柱壓波動(dòng)較大，甚至導(dǎo)致流動(dòng)相難以流動(dòng)、填料破碎等不利情況，而不得不通過二級(jí)、甚至三級(jí)色譜柱串聯(lián)逐級(jí)減壓的方式以克服其不足，因而必然引起設(shè)備投資大、工藝繁瑣、操作不便等弊端。[0008]上述兩種采用伯胺基硅膠填料或伯胺基樹脂的RA制備方法與甜菊糖甙的國標(biāo)(GB 8270-1999，食品添加劑甜菊糖甙)檢測(cè)方法基本一致，填料的官能團(tuán)均為伯胺基，洗脫劑均為高濃度水溶性有機(jī)溶劑的水溶液。所不同在于國標(biāo)的甜菊糖檢測(cè)方法采用線性色譜技術(shù)，主要目的在于分析，而文獻(xiàn)中的兩種方法采用非線性色譜技術(shù)，主要目的在于制備。因此屬于不同的技術(shù)范疇。[0009]目前，季胺基強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂在甜菊糖行業(yè)得到廣泛應(yīng)用，主要用于甜菊糖的脫色(施榮富，史作清，范云鴿，王春紅，路延齡，何炳林，季銨基吸附樹脂的合成及其在甜菊甙提取分離中的應(yīng)用，離子交換與吸附，2001，17(2): 117-122)。發(fā)明人前期研究(親水作用色譜法測(cè)定甜菊糖主要極性組分，食品科學(xué)，2013，34(14):280-284，陳斌，李曙光，馬曉迅，陳國亮，李蓉)發(fā)現(xiàn)在線性色譜條件下，季胺基硅膠色譜填料對(duì)甜菊糖的檢測(cè)效果明顯優(yōu)于伯胺基硅膠填料。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0010]本發(fā)明的目的在于提供一種適宜于工業(yè)化生產(chǎn)的分離純化萊鮑迪甙A的新方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)吸附量越小，分離介質(zhì)骨架不穩(wěn)定的不足。[0011]本發(fā)明實(shí)現(xiàn)過程如下: 一種分離純化萊鮑迪甙A的方法，其包括以下步驟: (1)色譜柱平衡:向色譜柱內(nèi)通入流動(dòng)相平衡色譜柱； (2)上樣:將含有萊鮑迪甙A的粗品溶解于流動(dòng)相，泵入色譜柱內(nèi)或通過將萊鮑迪甙A粗品流動(dòng)相與色譜填料拌合，將干燥后的色譜填料放入色譜柱的柱頭；色譜填料為季胺基色譜填料； (3)洗脫:以紫外或ELSD檢測(cè)器監(jiān)測(cè)，以流動(dòng)相洗脫至萊鮑迪甙A從色譜柱出峰結(jié)束。[0012]所述季胺基色譜填料的骨架為硅膠、氧化鋁或二氧化鋯，最好為硅膠；功能基團(tuán)為季胺基-CH2N+(CH3)3X-或-CH2N+(CH3)2CH2CH2OHx-;其中 F 為 OH' Cl' SO42' COO' NOf 或CH3COCT,如商品化的 S印ra? SAX、ZORBAX SAX 或 Alltech Anion/S。[0013]上述流動(dòng)相為甲醇水溶液、乙醇水溶液、異丙醇水溶液、丙酮水溶液或乙腈水溶液。[0014]步驟(1)中平衡色譜柱的流動(dòng)相最好為體積比85-95%的丙酮水溶液。[0015]步驟(2)中，上樣時(shí)的流動(dòng)相最好為體積比85-95%的丙酮水溶液。[0016]步驟(3)中，洗脫時(shí)的流動(dòng)相為等度洗脫或多階段等度洗脫或線性梯度洗脫，若采用等度洗脫的流動(dòng)相最好為體積比85-95%的丙酮水溶液；若采用多階段等度洗脫時(shí)，先采用體積比85-95%的丙酮水溶液洗脫至萊鮑迪甙C出峰結(jié)束，再切換至低于體積比85%的丙酮水溶液或純水洗脫；若采用線性梯度洗脫為上樣時(shí)的流動(dòng)相濃度至純水溶液。[0017]上述色譜柱平衡、上樣、洗脫各步驟的流速為50-600cm/hr，最好為200_250cm/hr。[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果: 1、季胺基色譜填料的吸附量與選擇性均明顯優(yōu)于伯胺基色譜填料。同樣生產(chǎn)任務(wù)下，吸附量越大，則所需的色譜填料越少，因此色譜填料與色譜設(shè)備的投資均顯著下降；2、硅膠為剛性骨架，在有機(jī)溶劑中體積穩(wěn)定，克服了高聚物填料在有機(jī)溶劑中體積變化所導(dǎo)致的柱壓波動(dòng)、填料的破碎及難以流動(dòng)等弊端；
3、本發(fā)明方法得到的產(chǎn)品純度高，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0019]以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不表示實(shí)施例中所述方式是實(shí)施本發(fā)明的唯一途徑，也不意味著對(duì)本發(fā)明的任何限制。
[0020]實(shí)施例1季胺基填料與伯胺基填料的比較
60%純度RA由曲阜圣仁制藥有限公司惠贈(zèng)，以90% (v/v)丙酮-水溶液配制成10 g/L樣品溶液備用。
[0021]各取1.0 g季胺基填料Sepra? SAX (Phenomenex)與伯胺基填料Sepra? NH2于100 mL三角瓶中，再各移取7.5 mL上述60%純度RA樣品溶液、7.5 mL去離子水于三角瓶中。將三角瓶放置入搖床，30°C，150 rpm保持12 h.測(cè)試結(jié)果如下。
【權(quán)利要求】
1.一種分離純化萊鮑迪甙A的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)色譜柱平衡:向色譜柱內(nèi)通入流動(dòng)相平衡色譜柱； (2)上樣:將含有萊鮑迪甙A的粗品溶解于流動(dòng)相，泵入色譜柱內(nèi)或通過將萊鮑迪甙A粗品流動(dòng)相與色譜填料拌合，將干燥后的色譜填料放入色譜柱的柱頭；色譜填料為季胺基色譜填料； (3)洗脫:以紫外或ELSD檢測(cè)器監(jiān)測(cè)，以流動(dòng)相洗脫至萊鮑迪甙A從色譜柱出峰結(jié)束。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化萊鮑迪甙A的方法，其特征在于:所述季胺基色譜填料的骨架為硅膠、氧化鋁或二氧化鋯，功能基團(tuán)為季胺基-CH2N+ (CH3) 3X_或-CH2N+ (CH2CH2CH2OHX-;其中 r 為 OH' Cl' SO42' COO' NOf 或 CH3COO'
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離純化萊鮑迪甙A的方法，其特征在于季胺基色譜填料的骨架為硅膠。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離純化萊鮑迪甙A的方法，其特征在于季胺基色譜填料為商品化的 S印ra? SAX、ZORBAX SAX 或 Alltech Anion/S。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離純化萊鮑迪甙A的方法，其特征在于:流動(dòng)相為甲醇水溶液、乙醇水溶液、異丙醇水溶液、丙酮水溶液或乙腈水溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離純化萊鮑迪甙A的方法，其特征在于:步驟(1)和(2)中，平衡色譜柱的流動(dòng)相和上樣時(shí)的流動(dòng)相均為體積比85-95%的丙酮水溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離純化萊鮑迪甙A的方法，其特征在于:步驟(3)中，洗脫時(shí)的流動(dòng)相為等度洗脫或多階段等度洗脫或線性梯度洗脫。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的分離純化萊鮑迪甙A的方法，其特征在于:等度洗脫的流動(dòng)相為體積比85-95%的丙酮水溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的分離純化萊鮑迪甙A的方法，其特征在于:多階段等度洗脫時(shí)，先采用體積比85-95%的丙酮水溶液洗脫至萊鮑迪甙C出峰結(jié)束，再切換至低于體積比85%的丙酮水溶液或純水洗脫。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的分離純化萊鮑迪甙A的方法，其特征在于:線性梯度洗脫為上樣時(shí)的流動(dòng)相濃度至純水溶液。
【文檔編號(hào)】C07H15/256GK103613622SQ201310532268
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月4日
【發(fā)明者】李蓉, 陳斌, 陳曉慧, 李曙光, 楊凱迪, 馬曉迅, 陳國亮 申請(qǐng)人:西北大學(xué)