抗PHF-tau抗體及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗PHF-tau抗體及其制備和使用方法。
【專利說(shuō)明】抗PHF-tau抗體及其用途
[0001]本專利申請(qǐng)要求于2011年12月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/577，817的權(quán)益，所述美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及抗PHF-tau抗體及其制備和使用方法。
【背景技術(shù)】
[0003]阿爾茨海默氏病(AD)是退行性腦病癥，其特征在于漸進(jìn)性的記憶、認(rèn)知、推理、判斷和情感穩(wěn)定性的喪失，所述喪失逐漸導(dǎo)致極度精神衰退和最終的死亡。AD是老年人中進(jìn)行性精神障礙(癡呆)的非常常見(jiàn)的病因，并且被認(rèn)為是美國(guó)第四大最常見(jiàn)的醫(yī)學(xué)死因。AD已在全世界的種族群體中觀察到，并且代表目前和未來(lái)的主要公共健康問(wèn)題。
[0004]患有AD的個(gè)體的腦顯示出稱作老年(或淀粉樣蛋白)斑、淀粉樣蛋白血管病(淀粉樣蛋白在血管中沉積)和 神經(jīng)原纖維纏結(jié)的特征性病變。一般在具有AD的患者中對(duì)于記憶和認(rèn)知功能重要的人腦幾個(gè)區(qū)域中發(fā)現(xiàn)大量這些病變，特別是淀粉樣斑塊和成對(duì)螺旋細(xì)絲的神經(jīng)原纖維纏結(jié)。
[0005]AD及其他幾種神經(jīng)退化性疾病中的神經(jīng)原纖維變性的主要蛋白質(zhì)組分是高度磷酸化形式的微管相關(guān)蛋白tau。開(kāi)發(fā)預(yù)防或清除tau聚集的治療劑一直關(guān)注多年，但候選藥物包括抗聚集化合物和激酶抑制劑只是剛剛進(jìn)入臨床測(cè)試(Brunden等人Nat Rev DrugDiscov8:783-93,2009)。
[0006]近來(lái)，在轉(zhuǎn)基因tau小鼠模型中已產(chǎn)生tau的主動(dòng)和被動(dòng)免疫接種可具有治療潛力的臨床前證據(jù)(Chai 等人 J Biol Chem 286:34457-67, 2011, Boutajangout 等人 JNeurochem 118:658-67, 2011,Boutajangout 等人 J Neurosci 30: 16559-66, 2010, Asuni 等人JNeurosci 27:9115-29, 2007)。tau蛋白病變(tauopathy)傳播和蔓延假設(shè)近來(lái)已得到描述，并且基于人腦中的tau蛋白病變進(jìn)展的Braak階段和在臨床前tau模型中的tau聚集體注射后的 tau 蛋白病變蔓延(Frost 等人 J Biol Chem 284: 12845-52, 2009, Clavaguera等人Nat Cell Biol 11:909_13，2009)。因此，存在預(yù)防tau聚集和tau蛋白病變進(jìn)展以治療AD及其他神經(jīng)退化性疾病的治療劑的需要。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0007]圖1顯示了多種抗tau抗體對(duì)標(biāo)記AT8的競(jìng)爭(zhēng)。
[0008]圖2顯示了多種抗tau抗體對(duì)標(biāo)記PTl的競(jìng)爭(zhēng)。
[0009]圖3顯示了多種抗tau抗體對(duì)標(biāo)記PT3的競(jìng)爭(zhēng)。
[0010]圖4顯示了多種抗tau抗體對(duì)標(biāo)記ATlOO的競(jìng)爭(zhēng)。
[0011]圖5顯示了多種抗tau抗體對(duì)標(biāo)記HT7的競(jìng)爭(zhēng)。
[0012]圖6(A)如該圖中所示，用鹽水、小鼠IgGl、PT3或AT8處理的5月齡雌性P301L轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，或來(lái)自未經(jīng)處理的非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(B6)的腦干勻漿物(級(jí)分Pl)中的磷酸化tau的分析。使用AT8(左圖)或ATlOO(右圖)作為捕獲抗體，隨后為生物素化的HT7和抗生物素蛋白-HRP來(lái)完成ELISA。ELISA信號(hào)標(biāo)繪為AD腦勻漿物的相對(duì)量(ng/ml)，所述AD腦勻漿物提供與來(lái)自非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(B6)的平均樣品相同的ELISA信號(hào)。數(shù)據(jù)連同平均值+/-S.D 一起個(gè)別進(jìn)行標(biāo)繪。指示了 PT3和IgGl處理的動(dòng)物之間的差異的P值。(B)使用AT100來(lái)自IgGl或PT3處理的動(dòng)物的腦干勻漿物級(jí)分Pl的蛋白質(zhì)印跡。顯示了來(lái)自用IgGKIgGl-1 至 IgGl-1O)處理的 10 只動(dòng)物和用 PT3 (PT3-1、PT3_2、PT3_7 至 PT3-10)處理的7只動(dòng)物的勻漿物的信號(hào)。肌動(dòng)蛋白用作裝載對(duì)照。
[0013]圖7如該圖中所示，源自用ΡΤ3或同種型對(duì)照(IgG)處理的5月齡雌性P301L轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的十二烷基肌氨酸鈉可溶性(ΡΤ4可溶性)皮質(zhì)勻漿物中的總tau水平，十二烷基肌氨酸鈉不溶性(PT4不溶性)皮質(zhì)勻漿物中的總tau水平，和十二烷基肌氨酸鈉不溶性(AT8不溶性)皮質(zhì)勻漿物中的磷酸化tau水平。水平顯示為連同平均值+/-SD —起個(gè)別標(biāo)繪的來(lái)自ELISA的信號(hào)測(cè)量。樣品Im inj是源自用tau聚集體注射的P301L小鼠腦的陽(yáng)性對(duì)照樣品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明的一個(gè)方面是結(jié)合PHF-tau的分離的抗體，所述分離的抗體包含SEQ IDNO:35或37的重鏈可變區(qū)(VH)的抗原結(jié)合位點(diǎn)和SEQ ID NO:36或38的輕鏈可變區(qū)(VL)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
[0015]本發(fā)明的另一個(gè)方面是結(jié)合PHF-tau的分離的抗體，所述分離的抗體包含某些重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)。
[0016]本發(fā)明的另一 個(gè)方面是結(jié)合PHF-tau的分離的抗體，所述分離的抗體包含SEQ IDNO:35的VH的抗原結(jié)合位點(diǎn)和SEQ ID NO:36的VL的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
[0017]本發(fā)明的另一個(gè)方面是結(jié)合PHF-tau的分離的抗體，所述分離的抗體包含SEQ IDNO:37的VH的抗原結(jié)合位點(diǎn)和SEQ ID NO:38的VL的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
[0018]本發(fā)明的另一個(gè)方面是和單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)與PHF-tau進(jìn)行結(jié)合的分離的抗體或片段，所述單克隆抗體包含SEQ ID NO:35的VH的抗原結(jié)合位點(diǎn)和SEQ ID NO:36的VL的抗原結(jié)合位點(diǎn)，或SEQ ID NO:37的VH的抗原結(jié)合位點(diǎn)和SEQ ID NO:38的VL的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
[0019]本發(fā)明的另一個(gè)方面是編碼本發(fā)明的抗體或其片段的多核苷酸。
[0020]本發(fā)明的另一個(gè)方面是包含本發(fā)明的多核苷酸的載體。
[0021]本發(fā)明的另一個(gè)方面是包含本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞。
[0022]本發(fā)明的另一個(gè)方面是制備結(jié)合PHF-tau的抗體的方法，所述方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，以及回收由所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。
【具體實(shí)施方式】
[0023]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“抗體”廣義地意指并且包括免疫球蛋白或抗體分子(包括多克隆抗體)、單克隆抗體(包括小鼠、人、人適應(yīng)的(human-adapted)、人源化和嵌合單克隆抗體和抗體片段)。
[0024]一般來(lái)講，抗體是蛋白質(zhì)或肽鏈，其對(duì)于特定抗原表現(xiàn)出結(jié)合特異性。抗體結(jié)構(gòu)是眾所周知的。免疫球蛋白可根據(jù)重鏈恒定域氨基酸序列被指定為五種主要種類，即IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM0 IgA 和 IgG 還再分類為同種型 IgAl、IgA2、IgGl、IgG2、IgG3 和 IgG4。任何脊椎動(dòng)物物種的抗體輕鏈可基于其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列被指定至兩種明顯不同類型之一，即K (K)和λ (λ)。
[0025]術(shù)語(yǔ)“抗體片段”意指完整抗體的一部分?？贵w片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、⑶R、抗原結(jié)合位點(diǎn)、重或輕鏈可變區(qū)、雙抗體、單鏈抗體分子和由至少兩種完整抗體或其片段形成的多特異性抗體。
[0026]免疫球蛋白輕或重鏈可變區(qū)由被“抗原結(jié)合位點(diǎn)”間斷的“構(gòu)架”區(qū)組成?？乖Y(jié)合位點(diǎn)使用如下的多種術(shù)語(yǔ)進(jìn)行限定:(i)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)基于序列可變性(Wu和KabatJ Exp Med 132 =211-50,1970)。一般地，抗原結(jié)合位點(diǎn)具有在每個(gè)可變區(qū)中的三個(gè)⑶R(重鏈可變區(qū)(VH)中的HCDRl、HCDR2和HCDR3以及輕鏈可變區(qū)(VL)中的LCDRl、LCDR2和LCDR3) (Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.，1991)。(ii)術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”、“HVR”或“HV”指如 Chothia 和 Lesk 限定的(Chothia 和 Lesk J Mol Biol 196:901-17,1987)，在結(jié)構(gòu)中高變的抗體可變結(jié)構(gòu)域的區(qū)域。一般地，抗原結(jié)合位點(diǎn)具有在每個(gè)VH(H1、H2、H3)和VL(L1、L2、L3)中的三個(gè)高變區(qū)。Chothia和Lesk將結(jié)構(gòu)上保守的HV稱為“規(guī)范結(jié)構(gòu)”。⑶R和HV的編號(hào)系統(tǒng)以及注釋近來(lái)已由Abhinandan和Martin(Abhinandan和Martin Mol Immunol 45:3832-9, 2008)修訂。(iii)形成抗原結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)域的另一個(gè)定義已基于來(lái)自免疫球蛋白和T細(xì)胞受體的V結(jié)構(gòu)域的比較，由Lefranc (Lefranc等人Dev CompTmmunol 27:55-77, 2003)提出。International ImMunoGeneTics (IMGT)數(shù)據(jù)庫(kù)(http:_//www_imgt_org)提供了這些區(qū)域的標(biāo)準(zhǔn)化編號(hào)和定義。Q)R、HV和IMGT劃分(delineation)之間的對(duì)應(yīng)性在Lefranc等人，出處同上中描述。(iv)抗原結(jié)合位點(diǎn)還可基于特異性決定殘基使用(Specificity Determining Residue Usage) (SDRU) (Almagro J Mol Recognit 17:132-43,2004)進(jìn)行劃分，其中特異性決定殘基(SDR)指直接涉及抗原接觸的免疫球蛋白的氣基酸殘基。
[0027]“構(gòu)架”或“構(gòu)架序列”是在抗體的可變區(qū)內(nèi)除限定為抗原結(jié)合位點(diǎn)序列的那些外的剩余序列。因?yàn)榭乖Y(jié)合位點(diǎn)的確切定義可通過(guò)如上所述的多種劃分來(lái)決定，所以確切的構(gòu)架序列取決于抗原結(jié)合位點(diǎn)的定義。
[0028]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”(mAb)是指獲自基本上均質(zhì)抗體的群體的抗體(或抗體片段)。單克隆抗體是高度特異性的，通常針對(duì)單一抗原決定簇。
[0029]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“表位”是指抗體特異性結(jié)合的抗原部分。表位通常由部分(例如氨基酸、磷酸化氨基酸或多糖側(cè)鏈)的化學(xué)活性(例如極性、非極性或疏水性)表面分組組成，并且可具有特定三維結(jié)構(gòu)特征以及比電荷特征。表位在性質(zhì)中可以是線性的或可以是不連續(xù)表位，例如構(gòu)象表位，其通過(guò)抗原的非鄰接氨基酸之間的空間關(guān)系而不是氨基酸的線性系列形成。構(gòu)象表型包括通過(guò)抗原折疊而得的表位，其中來(lái)自所述抗原的線型序列的不同部分的氨基酸在3-維空間中靠近。
[0030]Tau是具有多重眾所周知的同種型的豐富的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)蛋白質(zhì)。在人CNS中，由于可變剪接，存在大小范圍為352至441的六種主要tau同種型(Hanger等人Trends Mol Med 15:112-9, 2009)。這些同種型通過(guò)0-2個(gè)N末端插入片段的調(diào)節(jié)包括和3或4個(gè)串聯(lián)排列的微管結(jié)合重復(fù)序列而彼此不同，并且被稱為0N3R(SEQ IDNO:1)、1N3R(SEQ ID NO:2)、2N3R(SEQ ID NO:3)、0N4R(SEQ ID NO:4)、1N4R(SEQ ID NO:5)和2N4R(SEQ ID NO:6)。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“對(duì)照tau”指SEQ ID NO:6的tau同種型，其缺乏磷酸化及其他翻譯后修飾。
[0031]Tau結(jié)合微管且調(diào)節(jié)貨物(cargo)通過(guò)細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn),所述轉(zhuǎn)運(yùn)是可通過(guò)tau磷酸化調(diào)節(jié)的過(guò)程。在AD和相關(guān)病癥中，tau的異常磷酸化是普遍的，并且被認(rèn)為領(lǐng)先于和/或觸發(fā)tau聚集成稱為成對(duì)螺旋細(xì)絲(PHF)的原纖維。PHF的主要組成成分是高度磷酸化的tau。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“成對(duì)螺旋細(xì)絲-tau”或“PHF-tau”指眾所周知的成對(duì)螺旋細(xì)絲中的tau聚集體。PHF結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)主要區(qū)域在電子顯微鏡檢查中是顯而易見(jiàn)的:絨毛狀外殼和核心細(xì)絲；絨毛狀外殼對(duì)蛋白酶解是敏感的并位于細(xì)絲外部，而蛋白酶抗性的細(xì)絲核心構(gòu)成 PHF 的主鏈(Wischik 等人 Proc Natl Acad Sci U S A85:4884-8,1988)。
[0032]如本文使用的“結(jié)合PHF-tau的抗體”指如在蛋白質(zhì)印跡上評(píng)價(jià)的，結(jié)合PHF-tau的抗體。通常，抗體與PHF-tau的結(jié)合可在5 % (w/v)脫脂奶粉(NFDM) TBS-T,0.05%Tween-20中的I小時(shí)封閉后，在約500ng PHF-tau的考馬斯染色后進(jìn)行評(píng)價(jià)。當(dāng)在其中對(duì)照tau和PHF-tau兩者均通過(guò)tau抗體相等檢測(cè)的抗原裝載條件下進(jìn)行測(cè)試時(shí),如通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)量的，結(jié)合PHF-tau的抗體任選不結(jié)合對(duì)照tau (SEQ ID NO:6),所述tau抗體對(duì) PHF-tau 表位無(wú)優(yōu)先(例如抗體 HT7 (ThermoScientific, Rockford, IL) (Mercken 等人 JNeurochem58 =548-53,1992)。此類示例性抗原裝載條件是500ng PHF-tau和200ng對(duì)照tau ο
[0033]本文使用常規(guī)的眾所周知的單字母和三字母氨基酸代碼。
[0034]物質(zhì)的組成 [0035]本發(fā)明涉及抗PHF-tau抗體和此類抗體的用途。此類PHF-tau抗體可具有結(jié)合PHF-tau上的磷酸化表位或結(jié)合PHF-tau上的非磷酸化表位的特性。抗PHF-tau抗體可用作治療劑，以及用作研究或診斷試劑，以檢測(cè)生物樣品例如組織或細(xì)胞中的PHF-tau。
[0036]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例是結(jié)合PHF-tau的分離的抗體，所述分離的抗體包含SEQ IDNO:35或37的重鏈可變區(qū)(VH)的抗原結(jié)合位點(diǎn)，或SEQ ID NO:36或38的輕鏈可變區(qū)(VL)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。表1顯示了根據(jù)Kabat或Chothia限定的本發(fā)明的示例性抗體以及示例性重和輕鏈可變區(qū)的抗原結(jié)合位點(diǎn)殘基。
[0037]在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明抗體的VH的抗原結(jié)合位點(diǎn)包含分別為SEQ ID NO:7、8和9或13、14和15的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) I (HCDRl)、2 (HCDR2)和3 (HCDR3)，或本發(fā)明抗體的VL的抗原結(jié)合位點(diǎn)包含分別為SEQ ID NO =1Ul和12或16、17和18的輕鏈CDRl(LCDRl)、2(LCDR2)和 3(LCDR3)。
[0038]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是結(jié)合PHF-tau的分離的抗體，所述分離的抗體包含SEQID NO:35或37的重鏈可變區(qū)(VH)的抗原結(jié)合位點(diǎn)和SEQ ID NO:36或38的輕鏈可變區(qū)(VL)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
[0039]在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明抗體的VH的抗原結(jié)合位點(diǎn)包含分別為SEQ ID NO:7、8和9或13、14和15的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) I (HCDRl)、2 (HCDR2)和3 (HCDR3)，并且本發(fā)明抗體的VL的抗原結(jié)合位點(diǎn)包含分別為SEQ ID NO =1Ul和12或16、17和18的輕鏈CDRl(ICDRl)、2(ICDR2)和 3 (ICDR3)。
[0040]表1.[0041]
【權(quán)利要求】
1.一種結(jié)合PHF-tau的分離的抗體，包含SEQ ID NO: 35或37的重鏈可變區(qū)(VH)的抗原結(jié)合位點(diǎn)和SEQ ID NO: 36或38的輕鏈可變區(qū)(VL)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的抗體，其中所述VH的抗原結(jié)合位點(diǎn)包含分別為SEQIDN0:7、8 和 9 或 SEQ ID NO: 13、14 和 15 的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) I (HCDR1)、2 (HCDR2)和 3(HCDR3)，并且所述VL的抗原結(jié)合位點(diǎn)包含分別為SEQ ID NO: 10、11和12或SEQ ID NO: 16、17 和 18 的輕鏈 CDRl (LCDR1)、2 (LCDR2)和 3 (LCDR3)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的結(jié)合PHF-tau的分離的抗體，所述分離的抗體包含SEQ ID NO:35的VH的抗原結(jié)合位點(diǎn)和SEQ ID NO:36的VL的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的抗體，其中所述VH的抗原結(jié)合位點(diǎn)包含分別為SEQID NO:7、8和9的HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL的抗原結(jié)合位點(diǎn)包含分別為SEQ IDNO: 10、11 和 12 的 LCDR1、LCDR2 和 LCDR3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的結(jié)合PHF-tau的分離的抗體，所述分離的抗體包含SEQ ID NO:37的VH的抗原結(jié)合位點(diǎn)和SEQ ID NO:38的VL的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的抗體，其中所述VH的抗原結(jié)合位點(diǎn)包含分別為SEQIDNO: 13、14和15的HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL的抗原結(jié)合位點(diǎn)包含分別為SEQ IDNO: 16、17 和 18 的 LCDR1、LCDR2 和 LCDR3。
7.根據(jù)權(quán)利要求 1-6中任一項(xiàng)所述的分離的抗體，其中所述抗體是人源化的。
8.—種和單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)與PHF-tau進(jìn)行結(jié)合的分離的抗體或片段，所述單克隆抗體包含SEQ ID NO:35的VH的抗原結(jié)合位點(diǎn)和SEQ ID NO:36的VL的抗原結(jié)合位點(diǎn)，或SEQ IDNO:37的VH的抗原結(jié)合位點(diǎn)和SEQ ID NO:38的VL的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
9.一種編碼抗體VH的分離的多核苷酸，所述抗體VH包含分別為SEQ ID NO:7、8和9，或分別為 SEQ ID NO: 13、14 和 15 的 HCDRU HCDR2 和 HCDR3。
10.一種編碼抗體VL的分離的多核苷酸，所述抗體VL包含分別為SEQ ID NO: 10、11和12，或分別為 SEQ ID NO: 16、17 和 18 的 LCDR1、LCDR2 和 LCDR3。
11.一種載體，包含權(quán)利要求9或10所述的多核苷酸。
12.—種宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求11所述的載體。
13.—種制備結(jié)合PHF-tau的抗體的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求12所述的宿主細(xì)胞，以及回收由所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。
【文檔編號(hào)】C07K16/00GK104024274SQ201280062971
【公開(kāi)日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月20日
【發(fā)明者】C.阿德弗, D.賈內(nèi)基, X.盧, M.姆多克, S-J.吳, M.梅克, M.范德米倫 申請(qǐng)人:詹森生物科技公司