使用高密度脂蛋白(hdl)相關(guān)分子治療和預(yù)防促炎性病狀的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明闡述用于治療和預(yù)防促炎性病狀的分子和組合物。高密度脂蛋白HDL相關(guān)分子(尤其包括ApoA-I、牛HDL和HDL模擬物)顯示可在皮膚細(xì)胞中預(yù)防UV誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和氧化性應(yīng)激，并在多種癌癥中抑制腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展。HDL相關(guān)分子可作為口服補(bǔ)充劑和在其它組合物中用于預(yù)防或治療促炎性皮膚病狀和全身性促炎性病狀，包括阿爾茨海默氏病(Alzheimer′s?disease)和各種癌癥。
【專利說(shuō)明】使用高密度脂蛋白(HDL)相關(guān)分子治療和預(yù)防促炎性病狀
[0001]本申請(qǐng)案主張2012年5月14日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)案61/646，772、2012年4月15日申請(qǐng)的61/624，333和2011年8月29日申請(qǐng)的61/528，447的權(quán)益，所述每一申請(qǐng)案的全部?jī)?nèi)容是以引用方式并入本文中。
[0002]本申請(qǐng)案涉及2010年10月4日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)案第61/389，618號(hào)和2010年8月20日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)案第12/860，293號(hào)(所述申請(qǐng)案第12/860，293號(hào)為2009年12月3日申請(qǐng)的申請(qǐng)案第12/630，458號(hào)的部分接續(xù)案，所述申請(qǐng)案第12/630,458號(hào)為2007年7月18日申請(qǐng)的申請(qǐng)案第11/571,986號(hào)、現(xiàn)在的專利第7，670，792號(hào)的分割案，所述申請(qǐng)案第11/571,986號(hào)為2005年7月14日申請(qǐng)的PCT/US2005/024985根據(jù)35U.S.C.§ 371的國(guó)家階段申請(qǐng)，所述PCT/US2005/024985主張2005年4月25日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)案第60/674，489號(hào)和2004年7月14日申請(qǐng)的60/588，007的權(quán)益)，所述每一申請(qǐng)案的全部?jī)?nèi)容是以引用方式并入本文中。
[0003]在本申請(qǐng)案全文中參考各個(gè)公開案。這些公開案的揭示內(nèi)容是全文由此以引用方式并入本申請(qǐng)案中，以更全面地闡述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)狀態(tài)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004]本發(fā)明一股來(lái)說(shuō)涉及通過(guò)使用HDL相關(guān)分子預(yù)防和治療促炎性病狀和癌癥。本發(fā)明更特定來(lái)說(shuō)涉及載脂蛋白A-1 (ApoA-1)、HDL和HDL模擬物，以及其在預(yù)防和治療促炎性病狀中的用途，所述促炎性病狀包括皮膚和全身性促炎性病狀，尤其是上皮癌癥以及阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、炎癥性皮膚病、炎癥性腸病和與衰老相關(guān)的炎癥性疾病。分子(包括全長(zhǎng)ApoA-1蛋白質(zhì)、HDL、抗體和調(diào)節(jié)和/或模擬這些靶的表達(dá)和/或功能的反義/干擾核苷酸)可單獨(dú)或與其它抗氧化劑組合用于用來(lái)治療各種病狀的口服補(bǔ)充劑、疫苗和醫(yī)藥組合物中。
【背景技術(shù)】
[0005]促炎作用是與應(yīng)激高度相關(guān)且與各種疾病相關(guān)聯(lián)的普遍現(xiàn)象。一股引發(fā)促炎性活性來(lái)克服可能有害的生物因子(細(xì)菌、病毒、寄生蟲等)的感染或侵襲。在對(duì)抗侵襲時(shí)，促炎作用具有有益且惡化的能力，且可發(fā)揮有害效應(yīng)。不平衡的全身性炎癥反應(yīng)的后遺癥包括微循環(huán)紊亂、休克、滲出到器官中以及凝固缺陷。不平衡的全身性補(bǔ)償性抗炎癥反應(yīng)經(jīng)常導(dǎo)致乏力和免疫抑制。
[0006]業(yè)內(nèi)仍需要預(yù)防和治療促炎性病狀、包括促炎性皮膚病狀和上皮癌癥的改良工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供HDL相關(guān)分子和使用所述分子治療和預(yù)防促炎性病狀和癌癥的方法。HDL相關(guān)分子包括ApoA-1、牛HDL和HDL模擬物。如下文更詳細(xì)地闡述，呈天然全長(zhǎng)形式的ApoA-1可預(yù)防UV誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和氧化性應(yīng)激。下文還更詳細(xì)地闡述如下意外發(fā)現(xiàn):HDL模擬物、ApoA-1和牛HDL(bHDL)可用于治療和預(yù)防各種癌癥。
[0008]在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法。所述方法包含使腫瘤細(xì)胞與選自由以下組成的群組的HDL相關(guān)分子接觸:HDL模擬肽(例如那些顯示于SEQ ID N0:U3-9、12、14或26-28中者)、牛HDL和ApoA-1。另一實(shí)施例提供治療或預(yù)防個(gè)體的癌癥的方法。所述方法包含向所述個(gè)體投與選自由以下組成的群組的HDL相關(guān)分子:HDL模擬肽(例如那些顯示于SEQ IDNO:1、3-9、12、14或26-28中者)、牛HDL和ApoA-1。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，提供減少暴露于氧化性應(yīng)激的上皮細(xì)胞的死亡和/或氧化性應(yīng)激的方法。所述方法包含使所述上皮細(xì)胞與選自由以下組成的群組的HDL相關(guān)分子接觸:HDL模擬肽(例如那些顯示于SEQ ID NO:1、3-9、12、14或26-28中者)、牛HDL和ApoA-1。在一個(gè)實(shí)施例中，所述接觸是在暴露于氧化性應(yīng)激之前進(jìn)行。在典型實(shí)施例中，所述接觸是在暴露于氧化性應(yīng)激之前至少12-24小時(shí)進(jìn)行。氧化性應(yīng)激可包含(例如)暴露于紫外輻射。
[0009]HDL相關(guān)分子可任選地作為口服補(bǔ)充劑來(lái)投與。待用本發(fā)明方法治療的個(gè)體可為(例如)哺乳動(dòng)物個(gè)體，通常是人類個(gè)體。
[0010]對(duì)于在本發(fā)明方法中的使用，ApoA-1可為全長(zhǎng)蛋白質(zhì)，其可作為重組Ap0A-1和/或以未修飾形式投與。在一個(gè)實(shí)施例中，ApoA-1是天然全長(zhǎng)未修飾ApoA-1。
[0011]根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述HDL模擬肽選自由以下組成的群組:SEQ IDNO:1、3-9、12、14 和 26-28。
[0012]在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供HDL相關(guān)分子，其用于治療癌癥、用于抑制腫瘤生長(zhǎng)和/或用于減少上皮細(xì)胞的死亡和/或氧化性應(yīng)激。HDL相關(guān)分子選自由以下組成的群組:HDL模擬肽(SEQ 10勵(lì):1、3-9、12、14或26-28)、牛邢1^和六?0八-1。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供新穎HDL模擬肽，包括那些具有SEQ ID NO:1、3-9、12、14或26-28中所示氨基酸序列者。在典型實(shí)施例中，肽由SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列或SEQ ID NO:3_9中所示任一序列組成。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1.棒圖，其繪制UV暴露的NIH3T3細(xì)胞的細(xì)胞活力分析的結(jié)果圖，且顯示ApoA-1處理的保護(hù)性效應(yīng)。
[0014]圖2.棒圖，其繪制細(xì)胞活力圖且顯示，ApoA-1 (上圖)預(yù)處理(10μg/ml)保護(hù)NIH3T3細(xì)胞免受UV誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，而同樣與HDL樣apoA_I相關(guān)的蛋白質(zhì)ApoA-1I (下圖)無(wú)法預(yù)防NIH3T3細(xì)胞的UV誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
[0015]圖3.肺重量和腫瘤體積的圖形和數(shù)字顯微照相圖，其比較在APCmin/+小鼠(人類家族性腺瘤性息肉病的小鼠模型)中用bHDL和媒劑對(duì)照處理。
[0016]圖4A-4E.與用L-4F和L-4F2處理的小鼠相比，在用sc_4F處理的BALB/c小鼠中，對(duì)側(cè)腹腫瘤重量和體積的效應(yīng)的圖形和數(shù)字顯微照相圖。圖4A和4B分別顯示腫瘤重量和體積。圖4C和4D分別顯示三個(gè)組中每一組的重量和體積分?jǐn)?shù)的分布百分比(對(duì)照作為100% ) 。三個(gè)組的側(cè)腹腫瘤的代表性照片顯示于圖4E中。
[0017]圖5A-5E.在用28AA和28AA-2肽處理的已在側(cè)腹皮下注射CT26細(xì)胞的BALB/c小鼠中，對(duì)側(cè)腹腫瘤重量和體積的效應(yīng)的圖形和數(shù)字顯微照相圖。在遠(yuǎn)離CT26細(xì)胞注射部位的位點(diǎn)用以每天10mg/kg皮下注射15天的媒劑(η = 12)或28ΑΑ(η = 10)或28ΑΑ-2 (η=11)處理小鼠。圖5A和5B分別顯示腫瘤重量和體積。圖5C和ro顯示三個(gè)組中每一組的重量和體積分?jǐn)?shù)的分布百分比(對(duì)照作為100% )。三個(gè)組的側(cè)腹腫瘤的代表性照片顯示于圖5E中。
[0018]圖6A和6B繪制MTS細(xì)胞活力分析的結(jié)果圖。用L-4F、L_4F2、28AA或28AA-2肽(10 μ g/ml)處理CT26細(xì)胞且與對(duì)照相比(圖6A)。還在活體外用所有4種肽處理來(lái)測(cè)定NIH3T3細(xì)胞活力。NIH3T3細(xì)胞活力不受4種肽中的任一種影響(圖6B)。
[0019]圖7A-7D.數(shù)字顯微照片，其顯示ApoA-1模擬肽L_4F在活體內(nèi)和活體外抑制HIF-1a表達(dá)。圖7么，&?(^-1模擬肽1^4?在活體內(nèi)抑制!1正-10表達(dá)和血管生成。如實(shí)例4中所述在野生型C57BL/6J小鼠中建立側(cè)腹腫瘤。在腫瘤生長(zhǎng)后兩周，用亂序肽(SC-4F)或L_4F(10mg/kg皮下,每天注射)將小鼠處理3周。對(duì)來(lái)自經(jīng)解剖腫瘤的冷凍切片(5 μ m)進(jìn)行蘇木素(hematoxylin)和曙紅(eosin, H&E)染色(左)、HIF-1 α染色(中)和CD31染色(右)。對(duì)每個(gè)載玻片的四個(gè)隨機(jī)選擇的視野進(jìn)行分析(η = 4只小鼠/組)。代表圖是以400Χ放大顯示。箭頭指示HIF-1a陽(yáng)性染色。圖7Β，L-4F預(yù)處理抑制人類卵巢癌細(xì)胞系中的CoCl2-和胰島素誘導(dǎo)的HIF-1 α表達(dá)。用媒劑或不同濃度的L_4F(1、3和1yg/ml)將細(xì)胞處理lh，且再經(jīng)4h添加所指示刺激劑。左，在0V2008細(xì)胞中，L-4F預(yù)處理抑制CoCl2-和胰島素誘導(dǎo)的HIF-1 α表達(dá)。右，在CA0V-3細(xì)胞中，L-4F預(yù)處理抑制CoCl2-和胰島素誘導(dǎo)的HIF-1 α表達(dá)。圖7(:和圖70，1^-4?降低0￥2008細(xì)胞中!1正-10的CoCl2誘導(dǎo)的(圖7C)和胰島素誘導(dǎo)的(圖7D)核表達(dá)。用小鼠單克隆抗HIF-1 α 一級(jí)抗體和作為二級(jí)抗體的經(jīng)阿萊克薩福羅(Alexa Fluor) 568 (紅色熒光)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫染色。使用DAPI對(duì)核進(jìn)行染色(在相應(yīng)公開原稿中為藍(lán)色)。圖像是以200X原始放大顯示。虛線和 框顯示放大圖像的來(lái)源區(qū)域。顯示具有類似結(jié)果的兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性照片。所用刺激劑的濃度為:100 μ M CoCl2和200ηΜ胰島素。
[0020]圖8A-8D.棒圖，其顯示在0V2008細(xì)胞中HIF-1a靶基因表達(dá)受L-4F抑制。圖8Α，CoCl2刺激的HRE報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄受L-4F預(yù)處理的抑制。用pGL3-Epo-HRE-Luc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染0V2008細(xì)胞且使其在完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24h。在過(guò)夜饑餓后，首先用L-4F(10l.! g/ml)將細(xì)胞處理lh，然后用CoCl2(10yM)再處理6h。如實(shí)例4中所述測(cè)定熒光素酶活性。圖8B，在CoCl2處理細(xì)胞中，L-4F抑制HIF-1 α靶基因的表達(dá)。在血清饑餓過(guò)夜后，用L-4F(10y g/ml)將0V2008細(xì)胞處理lh，然后用CoCl2(10yM)再處理6h。分離總RNA，且通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)量VEGF、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I(GLUTl)和醛縮酶-A (ALDO-A)mRNA水平的表達(dá)。使用GAPDH進(jìn)行規(guī)范化。圖8C，胰島素刺激的HRE報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄受L-4F預(yù)處理抑制。用pGL3-Epo-HRE-Luc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染0V2008細(xì)胞且使其在完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24h。在饑餓過(guò)夜后，用L-4F (10 μ g/ml)將細(xì)胞處理lh，然后用胰島素(200nM)再處理16h。如實(shí)例4中所述測(cè)定熒光素酶活性。圖8D，在胰島素處理細(xì)胞中，L-4F抑制HIF-1 α靶基因的表達(dá)。在血清饑餓過(guò)夜后，用L-4F (10 μ g/ml)將0V2008細(xì)胞處理lh，然后用胰島素(200nM)再處理16h。分離總RNA且通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)量VEGF、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I (GLUTl)和醛縮酶-A(ALD0-A)mRNA水平的表達(dá)。使用GAPDH進(jìn)行規(guī)范化。#，與相應(yīng)對(duì)照組相比，p〈0.05。##，與相應(yīng)對(duì)照組相比，p〈0.01。*，與相應(yīng)CoCl2-或胰島素處理組相比，p〈0.05。**，與相應(yīng)CoCl2-或胰島素處理組相比，p〈0.01。每一組η = 3。
[0021]圖9A-9D.在CoCl2-和胰島素處理的0V2008細(xì)胞中，L-4F的后處理降低HIF-1 a蛋白質(zhì)水平和活性。用CoCl2(10yM)或胰島素(200nM)將細(xì)胞處理24h，然后用媒劑或L-4F(10y g/ml)再處理1、2或4h。圖9A，在CoCl2-和胰島素處理的0V2008細(xì)胞中，用10 μ g/ml L-4F后處理降低HIF-1 α蛋白質(zhì)水平。圖9Β，在0V2008細(xì)胞中，用10 μ g/mlL_4F后處理4h降低CoCl2-和胰島素誘導(dǎo)的HIF-1 α核水平的增加。用小鼠單克隆抗HIF-1 α 一級(jí)抗體和作為二級(jí)抗體的經(jīng)阿萊克薩福羅568(紅色熒光)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫染色。使用DAPI對(duì)核進(jìn)行染色(在相應(yīng)公開原稿中為藍(lán)色)。圖像是以400Χ原始放大顯示。顯示具有類似結(jié)果的兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性照片。圖9C和圖9D，在CoCl2-和胰島素處理細(xì)胞中L-4F的后處理對(duì)HRE報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄的抑制。用pGL3-Ep0-HRE-Luc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染0V2008細(xì)胞且使其在完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。在饑餓過(guò)夜后，用CoCl2(10yM)或胰島素(200nM)將細(xì)胞處理24h，然后用LIF(1ygAil)再處理4h(圖9C)或24h (圖9D)。如實(shí)例4中所述測(cè)定熒光素酶活性。**，與相應(yīng)CoCl2-或胰島素處理組相比，p〈0.01。每一組η = 3。
[0022]圖10Α-10Β.L_4F對(duì)0V2008細(xì)胞中下游信號(hào)傳導(dǎo)分子的胰島素刺激活化的效應(yīng)。在過(guò)夜饑餓后，用L-4F(10 μ g/ml)將0V2008細(xì)胞處理lh，并以200nM終濃度添加胰島素。在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞裂解物并對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)分析。圖10A,在0V2008細(xì)胞中，L-4F抑制p70s6激酶的胰島素刺激的磷酸化以及后續(xù)HIF-1a表達(dá)。圖10B，在0V2008細(xì)胞中，L-4F對(duì)ERK1/2和Akt的胰島素刺激的磷酸化的效應(yīng)。
[0023]圖11A-11B.在0V2008細(xì)胞中，L-4F對(duì)HIF-1 α蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的效應(yīng)。圖11A，左，在0￥2008細(xì)胞中，1^-4?的預(yù)處理促進(jìn)!1正-10降解。在過(guò)夜饑餓后，用胰島素(200nM)將0V2008細(xì)胞處理3h，用L-4F(10y g/ml)處理lh，并用CHX (20 μ g/ml)處理不同持續(xù)時(shí)間。收集細(xì)胞裂解物并對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。顯示來(lái)自具有類似結(jié)果的三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)。右，在0￥2008細(xì)胞中，1^-4?處理促進(jìn)!1正-1(1降解。在過(guò)夜饑餓后，用胰島素(200nM)將0V2008細(xì)胞處理3h，然后同時(shí)用L-4F(10μg/ml)和CHX (20 μ g/ml)處理。在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞裂解 物且對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。顯示來(lái)自具有類似結(jié)果的三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)。圖11B，在胰島素處理的0V2008細(xì)胞中，L-4F的預(yù)處理對(duì)HIF-1 a的蛋白酶體介導(dǎo)的降解的效應(yīng)。在過(guò)夜饑餓后，用MG-132(10yM)將0V2008細(xì)胞處理3h，用L-4F(10y g/ml)處理lh，并用胰島素(200nM)再處理4h。收集細(xì)胞裂解物并對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。顯示來(lái)自具有類似結(jié)果的三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)。
[0024]圖12A-12B.L-4F對(duì)CoCl2-和胰島素刺激的ROS產(chǎn)生的效應(yīng)。用L_4F(10 μ g/ml)將0V2008細(xì)胞預(yù)處理lh，然后用胰島素(200nM)/CoCl2(10yM)和DCFH-DA (10 μ Μ)處理30min。在用PBS將細(xì)胞洗滌兩次后，用熒光顯微鏡捕捉細(xì)胞圖像。代表圖是以200X原始放大顯示。圖12A，在0V2008細(xì)胞中，L-4F抑制胰島素刺激的ROS產(chǎn)生。圖12B，在0V2008細(xì)胞中，L-4F抑制CoCl2刺激的ROS產(chǎn)生。
[0025]圖13A-13F.CT26細(xì)胞介導(dǎo)的肺腫瘤和側(cè)腹腫瘤在經(jīng)HDL模擬物L(fēng)-4F皮下處理的BALB/c小鼠中顯著減小。如實(shí)例5中所述在BALB/c小鼠(n = 11只/組)中建立肺腫瘤。在通過(guò)尾靜脈注射投與CT26細(xì)胞后3周處死小鼠。采集肺并稱重。對(duì)肺腫瘤進(jìn)行計(jì)數(shù)。圖13Α，所顯示數(shù)據(jù)為接受每天以10mg/kg皮下投與的SC-4F或L-4F的小鼠的肺重量。Ρ〈0.01。圖13Β，所顯示數(shù)據(jù)為在2組小鼠的肺表面上計(jì)數(shù)的腫瘤數(shù)。Ρ〈0.001。圖13C，2組小鼠的代表性腫瘤在肺表面上顯示腫瘤結(jié)節(jié)。圖13D和圖13E，如實(shí)例5中所述在BALB/C小鼠中建立側(cè)腹腫瘤。在皮下投與CT26細(xì)胞后15天處死小鼠并測(cè)量腫瘤重量。圖13D，所顯示數(shù)據(jù)為接受每天以10mg/kg皮下投與的sc-4F或L-4F的小鼠的腫瘤重量。P〈0.05。圖13E，顯示2組小鼠的代表性腫瘤。w/sc-4F，經(jīng)sc_4F處理的小鼠；w/L_4F，經(jīng)L-4F處理的小鼠。F，A中所示實(shí)驗(yàn)的血漿IL-6水平。P〈0.05。
[0026]圖14A-14D.CT26細(xì)胞介導(dǎo)的肺腫瘤在經(jīng)在鼠糧中投與的L_4F處理的BALB/c小鼠中顯著減小。如實(shí)例5中所述在BALB/c小鼠中建立肺腫瘤。在通過(guò)尾靜脈注射投與CT26細(xì)胞后3周處死小鼠。采集肺并稱重。對(duì)肺腫瘤進(jìn)行計(jì)數(shù)。圖14A，所顯示數(shù)據(jù)為接受以100mg/kg/d(2mg/小鼠/d)混合到鼠糧飲食中的sc_4F(η = 12)或L-4F(η = 9)的小鼠的肺重量。P〈0.05。圖14B，所顯示數(shù)據(jù)為在2組小鼠的肺表面上計(jì)數(shù)的腫瘤數(shù)。P〈0.0001。圖14C，對(duì)肺表面的腫瘤組織進(jìn)行切片并用抗CD31抗體實(shí)施CD31免疫染色以供檢測(cè)微血管中的內(nèi)皮細(xì)胞。紅色染色代表CD31染色。w/sc-4F，經(jīng)sc-4F處理的小鼠；w/L_4F，經(jīng)L-4F處理的小鼠。圖14D，如實(shí)例5中所述測(cè)量血漿LPA水平。P〈0.01。
[0027]圖15A-15C.在C57BL/6J_APCmin/+小鼠的腸道中，鼠糧飲食中的L_4F處理對(duì)腫瘤數(shù)和大小的效應(yīng)。如實(shí)例5中所述，在用在鼠糧中投與的sc-4F或L-4F處理8周后處死APCmin7^jHlU圖15A，在用在鼠糧中投與的L-4F處理8周后，腸道中的總腫瘤數(shù)表示為對(duì)照(即，經(jīng)SC-4F處理的小鼠)的百分比，P〈0.05。圖15B，通過(guò)腫瘤直徑(mm)定義的不同大小類別中的腫瘤數(shù)。w/sc-4F，經(jīng)sc-4F處理的小鼠；w/L-4F，經(jīng)L-4F處理的小鼠。圖15C，與對(duì)照小鼠相比，血漿LPA水平在經(jīng)L-4F處理的C57BL/6J-APCmin/+小鼠中顯著降低(>50% )。Ρ〈0.01。
[0028]圖16A-16D.在CT26細(xì)胞中，HDL模擬物L(fēng)-4F降低活力，抑制增殖，并影響細(xì)胞周期和細(xì)胞周期蛋白。CT26細(xì)胞是如實(shí)例5中所述來(lái)培養(yǎng)且與媒劑(對(duì)照)或10mg/mL濃度的L-4F —起培育。圖1 6A，使用MTS分析試劑盒分析細(xì)胞的活力。P〈0.001。圖16B，如實(shí)例5中所述分析BrdUrd納入。P〈0.001。圖16C，對(duì)處于細(xì)胞周期的不同階段中的細(xì)胞的定量分析。數(shù)據(jù)表示為對(duì)照細(xì)胞的百分比的平均值土SD。圖16D，細(xì)胞周期蛋白Dl和細(xì)胞周期蛋白A的表達(dá)。所有實(shí)驗(yàn)都是一式三份進(jìn)行且每一分析都是一式四份進(jìn)行。
[0029]圖17A-17B.在細(xì)胞培養(yǎng)基中，HDL模擬物L(fēng)-4F抑制CT26細(xì)胞的LPA誘導(dǎo)的活力并降低LPA水平。圖17A，CT26細(xì)胞是如實(shí)例5中所述來(lái)培養(yǎng)且與10mg/mL L-4F或5、10、20mmol/L濃度的LPA —起培育，或用L-4F和LPA 二者將細(xì)胞處理48小時(shí)。所有實(shí)驗(yàn)都是一式三份進(jìn)行且每一分析都是一式四份進(jìn)行。數(shù)據(jù)表示為對(duì)照細(xì)胞的百分比的平均值土SD。圖17B，在處理48小時(shí)后測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)基中的LPA水平。
[0030]圖18A-18E.G*(L_[113-122]apoj)肽在活體內(nèi)和活體外具有與L-4F類似的效應(yīng)。如實(shí)例5中所述在BALB/c中建立肺腫瘤。在將CT26細(xì)胞注射到尾靜脈中后3周處死小鼠。采集肺并稱重。對(duì)肺腫瘤進(jìn)行計(jì)數(shù)。圖18A，所顯示數(shù)據(jù)為接受以100mg/kg/d(2mg/小鼠/d)在鼠糧中投與的sc-4F(nl/412)、G*肽(nl/412)的小鼠的肺重量。Ρ〈0.05。圖18Β，所顯示數(shù)據(jù)為A中2組小鼠的肺表面上的腫瘤數(shù)。Ρ〈0.0001。圖18C，使用MTS分析來(lái)分析細(xì)胞的活力。P〈0.05。D，如實(shí)例5中所述測(cè)定圖18Α和圖18Β中所述小鼠的血清LPA水平。圖18Ε，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)量的細(xì)胞周期蛋白Dl和細(xì)胞周期蛋白A的表達(dá)。w/sc-4F，經(jīng)SC-4F處理的小鼠；w/G*，經(jīng)G*肽處理的小鼠。
[0031]圖19.與經(jīng)媒劑處理的對(duì)照相比，在活體外用不同HDL模擬肽處理的CT26細(xì)胞在處理48小時(shí)內(nèi)展現(xiàn)降低的細(xì)胞活力(根據(jù)MTS分析)。所分析HDL模擬物為L(zhǎng)-4F、L-4F2、K4,15-4F、K4,15-4F2 以及從 ApoE 和 G* 形成的 20 個(gè)氨基酸的肽 LRKLRKRLLRLVGRQLEEFL(SEQ ID NO:1)。
[0032]圖20.接受皮下側(cè)腹注射CT26細(xì)胞且隨后用皮下HDL模擬肽處理的BALB/c小鼠顯示腫瘤重量(左圖)和腫瘤體積(右圖)顯著降低。
【具體實(shí)施方式】
[0033]本發(fā)明係基于以下發(fā)現(xiàn):HDL相關(guān)分子可用于治療和預(yù)防促炎性病狀。HDL相關(guān)分子包括ApoA-1、牛HDL和HDL模擬物。如下文更詳細(xì)地闡述，呈天然全長(zhǎng)形式的ApoA-1可預(yù)防UV誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和氧化性應(yīng)激。下文還更詳細(xì)地闡述如下意外發(fā)現(xiàn):HDL模擬物、ApoA-1和牛HDL (bHDL)可用于治療和預(yù)防各種癌癥。ApoA-1和其它HDL相關(guān)分子提供有力且有效的治療和預(yù)防促炎性病狀、包括皮膚病狀和全身性促炎性病狀(包括癌癥和其它疾病，例如阿爾茨海默氏病)的藥劑。待治療癌癥包括上皮癌癥，例如陰道癌、外陰癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、乳癌、胰臟癌、肺癌、皮膚癌(例如，黑色素瘤)、腦癌(例如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)和胃癌。本文所述的HDL相關(guān)分子還可用于抗衰老治療，如其可用于延緩衰老過(guò)程并減少或消除氧化性應(yīng)激；且可用于治療眼部病狀(例如黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性)和自身免疫性疾病(例如關(guān)節(jié)炎)。
[0034]本發(fā)明提供減少暴露于氧化性應(yīng)激的上皮細(xì)胞的死亡和/或氧化性應(yīng)激的方法。所述方法包含使上皮細(xì)胞在暴露于氧化性應(yīng)激之前與HDL相關(guān)分子接觸。在一些實(shí)施例中，氧化性應(yīng)激包含暴露于紫外輻射。在典型實(shí)施例中，所述接觸是在暴露于氧化性應(yīng)激之前至少12-24小時(shí)進(jìn)行。
[0035]定義
[0036]除非另外指明，否則本申請(qǐng)案中所用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)都具有業(yè)內(nèi)常用的含義。如本申請(qǐng)案中所用，以下詞語(yǔ)或詞組具有指定含義。
[0037]如本文所用“HDL相關(guān)分子”意指ApoA-1、牛HDL和HDL模擬物，包括肽和合成分子。
[0038]除非上下文中明確指示其它含義，否則如本文所用“ApoA-1”是指全長(zhǎng)且未修飾的ApoA-1。例如，“ApoA-1肽”是指全長(zhǎng)ApoA-1的小部分。通常，ApoA-1是人類ApoA-1，一種244個(gè)氨基酸的28.2kDa蛋白質(zhì)。
[0039]如本文所用“HDL模擬物”是指經(jīng)修飾載脂蛋白，其模擬HDL的功能，通常提供具有增強(qiáng)效能的HDL相關(guān)分子。通常，載脂蛋白是通過(guò)改變或取代一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸和/或通過(guò)組合兩個(gè)或兩個(gè)以上HDL肽形成嵌合HDL相關(guān)分子來(lái)修飾。
[0040]如本文所用“多肽”包括從天然來(lái)源分離、通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生或化學(xué)合成的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段和肽。本發(fā)明多肽通常包含至少約6個(gè)氨基酸。較短多肽(例如長(zhǎng)度小于約50個(gè)氨基酸的多肽)通常稱作“肽”。
[0041]如本文所用“載體”意指構(gòu)筑物，其能在宿主細(xì)胞中遞送且優(yōu)選地表達(dá)一種或一種以上所關(guān)注基因或序列。載體的實(shí)例包括(但不限于)病毒載體、裸DNA或RNA表達(dá)載體、質(zhì)粒、粘?；蚴删w載體、與陽(yáng)離子縮合劑相關(guān)的DNA或RNA表達(dá)載體、囊封于脂質(zhì)體中的DNA或RNA表達(dá)載體和某些真核細(xì)胞(例如產(chǎn)生細(xì)胞)。[0042]如本文所用“表達(dá)控制序列”意指引導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸序列。表達(dá)控制序列可為啟動(dòng)子(例如組成型或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子)或增強(qiáng)子。表達(dá)控制序列可操作地連接到待轉(zhuǎn)錄的核酸序列。
[0043]術(shù)語(yǔ)“核酸”或“多核苷酸”是指呈單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，且除非另有限制，否則其涵蓋天然核苷酸的以類似于天然核苷酸的方式與核酸雜交的已知類似物。
[0044]如本文所用“醫(yī)藥上可接受的載劑”或“賦形劑”包括在與活性成份組合時(shí)容許所述成份保留生物活性且不與個(gè)體的免疫系統(tǒng)反應(yīng)的任何材料。實(shí)例包括(但不限于)任何標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)藥載劑，例如磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水、乳液(例如油/水乳液)和各種類型之潤(rùn)濕劑。用于氣溶膠或非經(jīng)腸投與的優(yōu)選稀釋劑是磷酸鹽緩沖鹽水或生理(0.9% )鹽水。
[0045]包含所述載劑的組合物是通過(guò)熟知的常用方法來(lái)調(diào)配(例如，參見雷明頓氏制藥科學(xué)(Remington, sPharmaceutical Sciences),第 18 版，Α.真納羅(A.Gennaro)編輯，邁克出版公司(Mack Publishing C0.)，伊斯頓，賓夕法尼亞州，1990)。
[0046]除非明確指示其它含義，否則如本文所用“一 (a) ”或“一 (an) ”意指至少一者。
[0047]HDL樽擬物
[0048]本發(fā)明提供HDL模擬物，包括HDL肽的嵌合體和也用作HDL模擬物的經(jīng)修飾和/或合成分子。在一個(gè)實(shí)施例中，用α-氨基異丁酸(Aib)取代已知HDL模擬肽中的丙氨酸生成新穎HDL模擬物(NHM)。在典型實(shí)施例中，嵌合體包含兩個(gè)選自肽ApoA-1、ApoE和ApoJ的HDL肽。在一個(gè)實(shí) 施例中，HDL模擬物是通過(guò)在與10個(gè)氨基酸的肽Apo Ε)嵌合的18個(gè)氨基酸的肽Apo A-1中用α-氨基異丁酸(Aib)取代丙氨酸來(lái)獲得，從而生成下文闡述的ΝΗΜ1-7。在另一實(shí)施例中，HDL模擬物是通過(guò)組合ApoE與ApoJ (G*)來(lái)獲得，從而生成(例如)新穎 HDL 模擬物 LRKLRKRLLR LVGRQLEEFL (SEQ ID NO:1)。
[0049]在Ε18Α (ref)中用Aib取代丙氨酸產(chǎn)生一系列7個(gè)NHM。
[0050]E18A 肽(ref) = LRKLRKRLLRDffLKAFYDKVAEKLKEAF (SEQ ID NO:2)
[0051]NHM:
[0052]NHMl = LRKLRKRLLRDffLKAibFYDKVAEKLKEAF(SEQ ID NO:3)
[0053]NHM2 = LRKLRKRLLRDffLKAFYDKVAibEKLKEAF (SEQ ID NO:4)
[0054]NHM3 = LRKLRKRLLRDffLKAFYDKVAEKLKEAibF(SEQ ID NO:5)
[0055]NHM4-LRKLRKRLLRDWLKAibFYDKVAibEKLKEAF(SEQ ID NO:6)
[0056]NHM5 = LRKLRKRLLRDffLKAFYDKVAibEKLKEAibF(SEQ ID NO:7)
[0057]NHM6 = LRKLRKRLLRDffLKAibFYDKVAEKLKEAibF(SEQ ID NO:8)
[0058]NHM7 = LRKLRKRLLRDffLKAibFYDKVAibEKLKEAibF(SEQ ID NO:9)
[0059]參見:奧列格F沙里福夫(OlegFSharifov)等人，2011，載脂蛋白E模擬物和膽固酉享降低性質(zhì)(Apolipoprotein E Mimetics and Cholesterol Lowering Properties)，美國(guó)心血管藥物雜志(American Journal of Card1vascular Drugs) 11 (6):371_381。
[0060]令人驚訝的是，本文所述的新穎HDL模擬肽可單獨(dú)或與其它抗氧化劑組合用于預(yù)防和治療促炎性病狀和全身性促炎性病狀(包括癌癥)。這些分子提供預(yù)防和治療促炎性皮膚病狀和全身性促炎性病狀(包括癌癥)的有力且有效的抗氧化劑。這在原則上已使用細(xì)胞培養(yǎng)模型來(lái)證實(shí)，且已通過(guò)活體內(nèi)研究顯示可抑制動(dòng)物模型中的腫瘤發(fā)展。[0061]牛HDL
[0062]如本文所述的牛HDL(bHDL)包括天然蛋白質(zhì)，且可存在異源序列。通常，bHDL是以其天然全長(zhǎng)未修飾形式使用。牛HDL通常是從血清純化，且可從(例如)生物醫(yī)學(xué)技術(shù)公司(B1medical Technologies, Inc.,斯托頓,馬薩諸塞州)獲得。相對(duì)于其它物種的HDL,牛HDL由于其高ApoA-1水平和其高血清水平以及其對(duì)投與人類的適宜性而是有利的。
[0063]ApoA-1 多狀
[0064]如本文所述的ApoA-1多肽包括天然蛋白質(zhì)，且可存在異源序列。通常，ApoA-1是以其天然全長(zhǎng)未修飾的成熟形式使用的人類ApoA-1。
[0065]NCBI 參照序列:NP_000030.1 (SEQ ID NO:10):
[0066]
I mkaavltlav Ifltgsqarh fwqqdeppqs pwdrvkdlat vyvdvlkdsg rdyvsqfegs
61 algkqlnlkl Idnwdsvtst fsklreqlgp vtqefwdnle keteglrqem skdleevksk121 xrqpyiddfqk kwqeemelyr qkveplrael qegarqklhe iqeklsplge emrdrarahv181 dairthlapy sdelrqrlaa rlealkengg arleeyhaka tehistisek akpalecUrq241 glipvlesfk vsflsaleey tk；<lntq;
[0067]在上述序列中，信號(hào)肽在氨基酸1-18處，成熟前蛋白在氨基酸19-267處，且成熟ApoA-1蛋白質(zhì)在氨基酸2 5-267處:
[0068]DEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ(SEQ ID NO: 11)。
[0069]盡管已研發(fā)ApoA-1肽和尤其ApoA-1模擬肽以努力鑒別與全長(zhǎng)ApoA-1蛋白質(zhì)相比具有類似功能和/或易于產(chǎn)生的分子以用于一些應(yīng)用領(lǐng)域，但對(duì)這些ApoA-1模擬肽(例如，α-螺旋肽)的修飾已使其與天然ApoA-1完全不同；事實(shí)上，模擬肽與全長(zhǎng)ApoA-1蛋白質(zhì)分子不共有結(jié)構(gòu)相似性。此外，在心血管治療領(lǐng)域，模擬肽有效性較低且需要較大數(shù)量而使得這些肽的治療性使用不實(shí)用。有趣的是，術(shù)語(yǔ)模擬肽是在過(guò)去20年間產(chǎn)生的術(shù)語(yǔ)，其是指鑒別可與全長(zhǎng)ApoA-1蛋白質(zhì)共有一些功能性質(zhì)的結(jié)果上不同的分子的嘗試；且事實(shí)上，在這些α -螺旋肽與全長(zhǎng)ApoA-1分子之間不存在結(jié)構(gòu)相似性。因此，術(shù)語(yǔ)“模擬肽”在本文中是誤稱，因?yàn)锳poA-1全長(zhǎng)蛋白質(zhì)與其模擬肽不共有結(jié)構(gòu)共同點(diǎn)。ApoA-1模擬肽只嘗試模擬ApoA-1全長(zhǎng)蛋白質(zhì)功能中的一些特征。
[0070]奪體多狀
[0071]本發(fā)明多肽可包含天然蛋白質(zhì)的變體。如本文所用的多肽“變體”是與天然蛋白質(zhì)相差一個(gè)或一個(gè)以上取代、缺失、添加和/或插入的多肽，從而使得所述多肽的治療效能沒(méi)有實(shí)質(zhì)性減小。換句話說(shuō)，效能可相對(duì)于天然蛋白質(zhì)有所增強(qiáng)或無(wú)變化，或可相對(duì)于天然蛋白質(zhì)減小不到50%，且優(yōu)選地不到20%。優(yōu)選變體包括其中已移除一個(gè)或一個(gè)以上部分(例如N-末端前導(dǎo)序列)的變體。其它優(yōu)選變體包括其中已從成熟蛋白質(zhì)的N-和/或C-末端移除小部分(例如，1-30個(gè)氨基酸、優(yōu)選地5-15個(gè)氨基酸)的變體。多肽變體優(yōu)選地展現(xiàn)與所鑒別多肽的至少約70%、更優(yōu)選地至少約90%且最優(yōu)選地至少約95%的一致性(如上文所述來(lái)測(cè)定)。
[0072]優(yōu)選地，變體含有保守取代?！氨Ｊ厝〈笔瞧渲杏靡粋€(gè)氨基酸取代另一個(gè)具有相似性質(zhì)的氨基酸的取代，從而使得肽化學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員預(yù)期所述多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和親疏水性質(zhì)不會(huì)發(fā)生實(shí)質(zhì)性變化。氨基酸取代一股可基于殘基在極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性性質(zhì)中的相似性來(lái)進(jìn)行。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；且具有類似親水性值的具有不帶電荷的極性頭基的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺及谷氨酰胺；以及絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可代表保守變化的其它氨基酸基團(tuán)包括:(I) ala、pro、gly、glu、asp、gin、asn、ser、thr ； (2) cys、ser、tyr、thr ； (3) val、ile、leu、met、ala、phe ；
(4)lys、arg、his ;和(5)phe、tyr、trp、his。變體還可或另一選擇為含有不保守變化。在優(yōu)選實(shí)施例中，變體多肽與天然序列相差5個(gè)或更少氨基酸的取代、缺失或添加。變體還可(或另一選擇為)通過(guò)(例如)缺失或添加氨基酸來(lái)修飾，所述缺失或添加對(duì)多肽的免疫原性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和親疏水性質(zhì)的影響最小。
[0073]多肽的制備
[0074]多肽可在蛋白質(zhì)的N-末端包含以共翻譯方式或翻譯后方式引導(dǎo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的信號(hào)(或前導(dǎo))序列。還可將多肽偶聯(lián)到連接子或其它序列以便于多肽的合成、純化或鑒別。
[0075]可從天然來(lái)源(例如血清)純化多肽。在一些實(shí)施例中，從將投與組合物的同一個(gè)體純化多肽。在其它實(shí)施例中，從異源物種純化多肽，例如用于投與人類的牛HDL或ApoA-10
[0076]由如本文所述的DNA序列編碼的重組多肽可使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種表達(dá)載體中的任一種容易地從所述DNA序列制備。表達(dá)可在已經(jīng)含有編碼重組多肽的DNA分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的任何適宜宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)。適宜宿主細(xì)胞包括原核生物、酵母和高級(jí)真核細(xì)胞。優(yōu)選地，所采用宿主細(xì)胞是大腸桿菌(E.coli)、酵母、昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(例如COS或CH0)?？墒紫仁褂檬惺蹫V器濃縮來(lái)自將重組蛋白質(zhì)或多肽分泌到培養(yǎng)基中的適宜宿主/載體系統(tǒng)的上清液。在濃縮后，可將濃縮物施加到適宜純化基質(zhì)，例如親和基質(zhì)或離子交換樹脂。最后，可采用一個(gè)或一個(gè)以上反相HPLC步驟來(lái)進(jìn)一步純化重組多肽。
[0077]具有少于約100個(gè)氨基酸且一股少于約50個(gè)氨基酸的部分和其它變體也可通過(guò)合成手段使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)來(lái)生成。例如，所述多肽可使用任一市售固相技術(shù)來(lái)合成，例如梅利菲爾德(Merrifield)固相合成方法，其中將氨基酸依序添加到正在生長(zhǎng)的氨基酸鏈上。參見梅利菲爾德，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.) 85:2149-2146，1963。用于自動(dòng)合成多肽的設(shè)備可自供應(yīng)商(例如珀金埃爾默(Perkin Elmer)/生物應(yīng)用系統(tǒng)分部(Applied B1Systems Divis1n)(福斯特城,加利福尼亞州))購(gòu)得,且可根據(jù)制造商說(shuō)明書來(lái)操作。
[0078]多肽可在珀金埃爾默/生物應(yīng)用系統(tǒng)分部430A肽合成儀上使用FMOC化學(xué)和HPTU(O-苯并三唑N，N，N'，N'-四甲基脲達(dá)六氟磷酸鹽)活化來(lái)合成?？蓪ly-Cys-Gly序列附接到肽的氨基末端以提供偶聯(lián)方法，從而結(jié)合到固定表面或?qū)﹄倪M(jìn)行標(biāo)記。從固體載體裂解肽可使用以下裂解混合物來(lái)實(shí)施:三氟乙酸:乙二硫醇:苯甲硫醚:水:苯酚(40:1: 2: 2: 3)。在裂解2小時(shí)后，可將肽在冷甲基-叔丁基醚中沉淀。然后可將肽沉淀溶解于含有0.1 %三氟乙酸(TFA)的水中并凍干，之后通過(guò)C18反相HPLC純化。可使用于水中的O % -60%乙腈(含有0.1% TFA)的梯度來(lái)洗脫肽。在凍干純凈流份后，可使用電噴霧或其它類型的質(zhì)譜法以及氨基酸分析來(lái)表征肽。
[0079]融合蛋白質(zhì)
[0080]在一些實(shí)施例中，多肽是包含多個(gè)如本文所述的多肽或包含至少一個(gè)如本文所述的多肽和無(wú)關(guān)序列的融合蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施例中，融合蛋白質(zhì)包含ApoA-1多肽和免疫原性多肽。免疫原性多肽可包含(例如)另一蛋白質(zhì)的全部或一部分。
[0081]可添加其它融合配偶體。融合配偶體可通過(guò)幫助提供T輔助表位、優(yōu)選地人類識(shí)別的T輔助表位來(lái)用作(例如)免疫融合配偶體。作為另一實(shí)例，融合配偶體可用作表達(dá)增強(qiáng)子，從而幫助以高于天然重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)率表達(dá)蛋白質(zhì)。某些優(yōu)選融合配偶體是同時(shí)增強(qiáng)免疫和表達(dá)的融合配偶體?？蛇x擇其它融合配偶體以提高蛋白質(zhì)的溶解度或使蛋白質(zhì)能夠靶向所需細(xì)胞內(nèi)區(qū)室。其它融合配偶體包括有助于蛋白質(zhì)純化的親和標(biāo)簽。
[0082]融合蛋白質(zhì)一股可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(包括化學(xué)共軛)來(lái)制備。優(yōu)選地，融合蛋白質(zhì)表達(dá)為重組蛋白質(zhì)，從而容許在表達(dá)系統(tǒng)中以相對(duì)于非融合蛋白質(zhì)增加的水平來(lái)產(chǎn)生。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，編碼多肽組份的DNA序列可單獨(dú)組裝，并接合到適宜表達(dá)載體中。編碼一種多肽組份的DNA序列的3'端用或不用肽連接子接合到編碼第二多肽組份的DNA序列的5'端，從而使得所述序列的閱讀框同相。這允許翻譯成保留兩種組份多肽的生物活性的單一融合蛋白質(zhì)。
[0083]可采用肽連接子序列將第一與第二多肽組份隔開足夠大的距離，以確保每一多肽折疊成其二級(jí)和三 級(jí)結(jié)構(gòu)。使用業(yè)內(nèi)熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將這一肽連接子序列納入融合蛋白質(zhì)中。適宜肽連接子序列可基于以下因素來(lái)選擇:(I)其采取靈活延伸構(gòu)象的能力；(2)其采取可與第一和第二多肽上的功能性表位相互作用的二級(jí)結(jié)構(gòu)的無(wú)能；和(3)可與多肽功能性表位反應(yīng)的疏水或帶電荷殘基的缺乏。優(yōu)選的妝連接子序列含有Gly、Asn和Ser殘基。還可在連接子序列中使用其它近中性氨基酸，例如Thr和Ala?？捎行У赜米鬟B接子的氨基酸序列包括以下文獻(xiàn)中揭不的序列:馬拉泰亞(Maratea)等人，基因(Gene)40:39~46,1985 ；墨菲(Murphy)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)83:8258-8262，1986 ;美國(guó)專利第4，935，233號(hào)和美國(guó)專利第4，751，180號(hào)。連接子序列一股可長(zhǎng)I到約50個(gè)氨基酸。在第一和第二多肽具有可用于隔開功能性結(jié)構(gòu)域并防止立體干擾的非必需N-末端氨基酸區(qū)域時(shí)，不需要連接子序列。
[0084]接合DNA序列可操作地連接到適宜轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)元件。負(fù)責(zé)DNA表達(dá)的調(diào)節(jié)元件位于編碼第一多肽的DNA序列的5'方。類似地，結(jié)束翻譯所需的終止密碼子和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)存在于編碼第二多肽的DNA序列的Y方。
[0085]還提供包含本發(fā)明多肽以及無(wú)關(guān)免疫原性蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，免疫原性蛋白質(zhì)能激發(fā)記憶反應(yīng)。所述蛋白質(zhì)的實(shí)例包括破傷風(fēng)、結(jié)核和肝炎蛋白質(zhì)(例如，參見斯托特(Stoute)等人,新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(New Engl.J.Med.) 336:86-91,1997)。
[0086]在優(yōu)選實(shí)施例內(nèi)，免疫融合配偶體源自蛋白質(zhì)D，一種革蘭氏(gram)-陰性細(xì)菌流感嗜血菌(Haemophilus influenza)B的表面蛋白質(zhì)(W091/18926)。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)D衍生物包含所述蛋白質(zhì)的大約前三分之一(例如，N-末端的前100-110個(gè)氨基酸)，且蛋白質(zhì)D衍生物可經(jīng)脂化。其它融合配偶體包括來(lái)自流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)NS I (血凝素)。通常，使用N-末端的81個(gè)氨基酸，但可使用包括T-輔助表位的不同片段。
[0087]在另一實(shí)施例中，免疫融合配偶體是稱為L(zhǎng)YTA的蛋白質(zhì)或其部分(優(yōu)選地C-末端部分)。LYTA源自肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae),其合成稱作酰胺酶LYTA的N-乙?；?L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因編碼；基因43 =265-292,1986)。LYTA是特異性降解肽聚糖主鏈中的某些鍵的自溶素。LYTA蛋白質(zhì)的C-末端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)對(duì)膽堿或?qū)σ恍┠憠A類似物(例如DEAR)的親和性。這個(gè)性質(zhì)已用于研發(fā)可用于表達(dá)融合蛋白質(zhì)的大腸桿菌C-LYTA表達(dá)質(zhì)粒。已闡述在氨基末端含有C-LYTA片段的雜合蛋白質(zhì)的純化(參見生物技術(shù)(B1technology) 10 =795-798,1992)。在優(yōu)選實(shí)施例內(nèi)，可將LYTA的重復(fù)部分納入融合蛋白質(zhì)中。重復(fù)部分發(fā)現(xiàn)于始于殘基178的C-末端區(qū)域。特別優(yōu)選的重復(fù)部分納入殘基 188-305。
[0088]一股來(lái)說(shuō)，如本文所述的多肽(包括融合蛋白質(zhì))和多核苷酸經(jīng)分離?！敖?jīng)分離”多肽或多核苷酸是從其原始環(huán)境中移除者。例如，如果將天然蛋白質(zhì)與天然系統(tǒng)中的一些或所有共存材料相分離，則所述天然蛋白質(zhì)經(jīng)分離。優(yōu)選地，所述多肽為至少約90%純，更優(yōu)選地至少約95%純且最優(yōu)選地至少約99%純。如果(例如)將多核苷酸克隆到并非是天然環(huán)境中的一部分的載體中，則認(rèn)為所述多核苷酸經(jīng)分離。
[0089]本發(fā)明多核苷酸
[0090]本發(fā)明提供編碼一種或一種以上HDL相關(guān)多肽(包括bHDL、ApoA-1和HDL模擬物)的多核苷酸。本發(fā)明也涵蓋與任何所述序列完全互補(bǔ)的多核苷酸。多核苷酸可為單股(編碼或反義)或雙股，且可為DNA (基因組、cDNA或合成)或RNA分子(包括siRNA)。RNA分子包括含有內(nèi)含子且與DNA分子一一對(duì)應(yīng)的HnRNA分子以及不含內(nèi)含子的mRNA分子。本發(fā)明多核苷酸中可能但并非需要存在其它編碼或非編碼序列，且多核苷酸可能但并非需要連接到其它分子和/或載體材料。所述多核苷酸的部分可用作用于相關(guān)分子的擴(kuò)增和檢測(cè)的引物和探針。 [0091]多核苷酸可包含天然序列(即，編碼HDL相關(guān)多肽或其部分的內(nèi)源序列)或可包含這一序列的變體。多核苷酸變體含有一個(gè)或一個(gè)以上取代、添加、缺失和/或插入，以使得所編碼多肽的免疫原性相對(duì)于天然蛋白質(zhì)不減小。變體優(yōu)選地展現(xiàn)與編碼天然蛋白質(zhì)或其部分的多核苷酸序列的至少約70%—致性、更優(yōu)選地至少約80%—致性且最優(yōu)選地至少約90% —致性。
[0092]如果兩個(gè)多核苷酸或多肽序列中的核苷酸或氨基酸序列在如下文所述進(jìn)行比對(duì)以獲得最大對(duì)應(yīng)性時(shí)相同，則稱所述兩個(gè)序列“一致”。兩個(gè)序列之間的比較通常是通過(guò)在比較窗上比較所述序列以鑒別并比較序列相似性的局部區(qū)域來(lái)執(zhí)行。如本文所用的“比較窗”是指至少20個(gè)、通常30個(gè)到約75個(gè)、40個(gè)到約50個(gè)鄰接位置的區(qū)段，其中在使序列和具有相同鄰接位置數(shù)的參照序列達(dá)成最佳比對(duì)后比較所述兩個(gè)序列。
[0093]所比較序列的最佳比對(duì)可使用激光基因(Lasergene)生物信息學(xué)軟件包(DNA星公司(DNASTAR, Inc.),麥迪遜,威斯康辛州)中的Megalign程序使用默認(rèn)參數(shù)來(lái)實(shí)施。此程序體現(xiàn)以下參考文獻(xiàn)中所述的若干比對(duì)方案:戴霍夫，M.0.(Davhoff，M.0.) (1978)蛋白質(zhì)的進(jìn)化變化模型-用于檢測(cè)遠(yuǎn)緣關(guān)系的矩陣(A model of evolut1nary change inproteins-Matrices for detecting distant relat1nships),戴霍夫，M.0.(編輯)蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖集(Atlas of Protein Sequence and Structure),國(guó)家生物醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)(Nat1nal B1medical Research Foundat1n)，華盛頓 DC,第 5 卷，增刊 3,第 345-358 頁(yè)；海因 J.(Hein J.) (1990)比對(duì)和種族發(fā)生的統(tǒng)一方法(Unified Approach to Alignment andPhylogenes)，第 626-645 頁(yè)，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)，第 183 卷，學(xué)術(shù)出版社公司(Academic Press, Inc.),圣地亞哥,加利福尼亞州;希金斯,D.G.(Higgins, D.G.)和夏普，P.M.(Sharp, P.M.) (1989)生物科學(xué)中的計(jì)算機(jī)應(yīng)用(CAB1S) 5 =151-153 ;邁爾斯，E.ff.(Myers, E.w.)和穆勒i (Muller w.) (1988)生物科學(xué)中的計(jì)算機(jī)應(yīng)用4:11-17 ;羅賓遜，E.D.(Robinson, E.D.) (1971)組合理論學(xué)報(bào)(Comb.Theor.) 11:105 ;桑圖，N.(Santou,N.)、內(nèi)斯，M.(Nes, M.) (1987)分子生物學(xué)與進(jìn)化(Mol.B1l.Evol.)4 =406-425 ;斯尼思，P.H.A.(Sneath，P.H.A.)和索卡，R.R.(Sokal，R.R.) (1973)數(shù)值分類法:數(shù)值分類法的原理與實(shí)踐(Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy)，弗里曼出版社(Freeman Press),圣弗蘭西斯科,加利福尼亞州；威爾伯，W.J.(Wilbur, w.J.)和李普曼，D.J.(Lipman, D.J.) (1983)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊80:726_730。
[0094]優(yōu)選地，“序列一致性百分比”是通過(guò)在至少20個(gè)位置的比較窗中比較兩個(gè)經(jīng)最佳比對(duì)的序列來(lái)測(cè)定，其中多核苷酸或多肽序列在比較窗中的部分與參照序列(其不包含添加或缺失)相比可包含20%或更少、通常5%到15%或10%到12%的添加或缺失(即空位)以達(dá)成兩個(gè)序列的最佳比對(duì)。所述百分比是通過(guò)以下方式來(lái)計(jì)算:測(cè)定在兩個(gè)序列中存在相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)以獲得匹配位置數(shù)，用匹配位置數(shù)除以參照序列(即窗大小)的總位置數(shù)，且將結(jié)果乘以100以獲得序列一致性百分比。
[0095]變體還可或另一選擇為與天然基因或其一部分或補(bǔ)體實(shí)質(zhì)上同源。所述多核苷酸變體能在中等嚴(yán)格條件下與編碼天然蛋白質(zhì)的天然DNA序列(或互補(bǔ)序列)雜交。
[0096]適宜的“中等嚴(yán)格條件”包括在5XSSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液中預(yù)洗；在50°C _65°C、5XSSC下雜交過(guò)夜；之后在65°C下用含有0.1% SDS的2X、0.5X和
.0.2 X SSC中的每一者洗滌兩次，每次20分鐘。
[0097]如本文所用“高度嚴(yán)格條件”或“高度嚴(yán)格性條件”是如下條件:(I)洗滌采用低離子強(qiáng)度和高溫，例如在50°C下的0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1 %十二烷基硫酸鈉；(2)在雜交期間采用變性劑，例如甲酰胺，例如在42°C下的含有0.1%牛血清白蛋白/0.1%蔗聚糖(FicolD/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5，含有750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉)的50% (v/v)甲酰胺；或(3)在42 °C下采用50%甲酰胺、5 X SSC (0.75M NaCl、0.075M 檸檬酸鈉)、50mM 磷酸鈉(pH6.8)、0.I %焦磷酸鈉、5 X 鄧哈特溶液(Denhardt’ s solut1n)、經(jīng)超聲波處理的鮭魚精 DNA(50 μ g/ml)、0.1% SDS 和 10%硫酸葡聚糖，且在42°C下在0.2 X SSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)中洗滌，且在55°C下在50%甲酰胺中洗滌，之后在55°C下進(jìn)行由含有EDTA的0.1XSSC組成的高度嚴(yán)格性洗滌。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解如何根據(jù)需要調(diào)節(jié)溫度、離子強(qiáng)度等以適應(yīng)諸如探針長(zhǎng)度等因素。
[0098]所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，有許多核苷酸序列編碼如本文所述的多肽。這些多核苷酸中的一些與任何天然基因的核苷酸序列具有最小同源性。但是，本發(fā)明明確涵蓋因密碼子使用差異而變化的多核苷酸。此外，包含本文所提供多核苷酸序列的基因的等位基因在本發(fā)明的范圍內(nèi)。等位基因是由于一個(gè)或一個(gè)以上突變(例如核苷酸的缺失、添加和/或取代)而改變的內(nèi)源基因。所得mRNA和蛋白質(zhì)可能但并非需要具有經(jīng)改變的結(jié)構(gòu)或功能。等位基因可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如雜交、擴(kuò)增和/或數(shù)據(jù)庫(kù)序列比較)來(lái)鑒別。
[0099]多核苷酸可使用多種業(yè)內(nèi)已知技術(shù)中的任一種來(lái)制備。編碼ApoA-1蛋白質(zhì)的DNA可得自從表達(dá)相應(yīng)mRNA的組織制備的cDNA文庫(kù)。因此,人類ApoA-1 DNA可便捷得得自從人類組織制備的cDNA文庫(kù)。編碼ApoA-1蛋白質(zhì)的基因還可得自基因組文庫(kù)或通過(guò)寡核苷酸合成來(lái)獲得?？墒褂媒?jīng)設(shè)計(jì)以鑒別所關(guān)注基因或其所編碼蛋白質(zhì)的探針(例如針對(duì)ApoA-1或至少約20-80個(gè)堿基的寡核苷酸的抗體)來(lái)篩選文庫(kù)。用所選探針篩選cDNA或基因組文庫(kù)可使用標(biāo)準(zhǔn)程序來(lái)實(shí)施，例如闡述于以下文獻(xiàn)中的標(biāo)準(zhǔn)程序:桑布魯克(Sambrook)等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(紐約:冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press), 1989)。分離編碼 ApoA-1 的基因的替代方法是使用PCR方法(桑布魯克等人，見上文；迪芬巴赫(Dieffenbach)等人，PCR引物:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(PCR Primer:A Laboratory Manual)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1995))。
[0100]選作探針的寡核苷酸序列應(yīng)足夠長(zhǎng)且足夠明確以使假陽(yáng)性降到最低。寡核苷酸優(yōu)選地經(jīng)標(biāo)記以使其在與所篩選文庫(kù)中的DNA雜交后可被檢測(cè)。標(biāo)記方法為業(yè)內(nèi)所熟知，且包括使用放射性標(biāo)記(例如32P-標(biāo)記的ATP)、生物素化或酶標(biāo)記。雜交條件(包括中度嚴(yán)格性和高度嚴(yán)格性)參見桑布魯克等人(見上文)。
[0101]多核苷酸變體一股可通過(guò)業(yè)內(nèi)已知的任何方法來(lái)制備，包括通過(guò)(例如)固相亞磷酰胺化學(xué)合成來(lái)化學(xué)合成。也可使用標(biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)在多核苷酸序列中引入修飾，例如寡核苷酸引導(dǎo)的位點(diǎn)特異性誘變(參見阿德爾曼(Adelman)等人，DNA2:183，1983)。另一選擇為，RNA分子可通過(guò)活體外或活體內(nèi)轉(zhuǎn)錄編碼ApoA-1蛋白質(zhì)的DNA序列或其部分來(lái)生成，前提是將所述DNA納入具有適宜RNA聚合酶啟動(dòng)子(例如T7或SP6)的載體中?？墒褂媚承┎糠謥?lái)制備如本文所述的所編碼多肽。另外，或另一選擇為，可將一部分投與患者以使得在活體內(nèi)生成所編碼多肽。
[0102]可進(jìn)一步修飾任何多核苷酸以提高活體內(nèi)穩(wěn)定性?？赡艿男揎棸?但不限于)在5'和/或3'端添加側(cè)翼序列；在主鏈中使用磷硫酰酯或2' O-甲基而不是磷酸二酯酶鍵；和/或包括非傳統(tǒng)堿基，例如肌苷、辮苷(queosine)和懷丁苷(wybutosine)以及腺嘌呤、胞苷、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷的乙酰基_、甲基_、硫基-和其它修飾形式。
[0103]可使用已確立的重組DNA技術(shù)將核苷酸序列接合到多種其它核苷酸序列。例如，可將多核苷酸克隆到多種克隆載體(包括質(zhì)粒、噬菌粒、λ噬菌體衍生物和粘粒)中的任一種中。特別關(guān)注的載體包括表達(dá)載體、復(fù)制載體、探針生成載體和測(cè)序載體。一股來(lái)說(shuō)，載體將含有在至少一種有機(jī)體中發(fā)揮功能的復(fù)制起點(diǎn)、便捷的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)和一種或一種以上可選標(biāo)記。其它元件將取決于所需使用，且將為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所了解。
[0104]在某些實(shí)施例內(nèi)，多核苷酸可經(jīng)調(diào)配以允許進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中且允許在其中表達(dá)。所述調(diào)配物尤其可用于治療性目的，如下文所述。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，有多種方式來(lái)實(shí)現(xiàn)多核苷酸在靶細(xì)胞中的表達(dá)，且可采用任何適宜方法。例如，可將多核苷酸納入病毒載體中，例如(但不限于)腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或牛痘或其它痘病毒(例如，禽痘病毒)。將DNA納入所述載體中的技術(shù)為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可另外轉(zhuǎn)移或納入用于可選標(biāo)記(以幫助鑒別或選擇經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞)和/或靶向部分的基因(例如編碼特定靶細(xì)胞上的受體的配體的基因)以使載體具有靶特異性。還可使用抗體通過(guò)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)完成靶向。
[0105] 用于治療性目的的其它調(diào)配物包括膠體分散系統(tǒng)(例如高分子復(fù)合物)、納米膠囊、微球體、珠粒和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)(包括水包油乳液、膠束、混合膠束和脂質(zhì)體)。用作活體外和活體內(nèi)遞送媒劑的優(yōu)選膠體系統(tǒng)是脂質(zhì)體(即，人造膜囊)。所述系統(tǒng)的制備和使用為業(yè)內(nèi)所熟知。
[0106]醫(yī)藥纟目合物
[0107]本發(fā)明提供納入醫(yī)藥組合物中的ApoA-1多肽、多核苷酸和相關(guān)分子。在典型實(shí)施例中，多肽是呈天然全長(zhǎng)未修飾形式的ApoAI。如業(yè)內(nèi)所理解，ApoAI是高密度脂蛋白(HDL)的重要組份。因此，可通過(guò)投與HDL來(lái)投與ApoAI。
[0108]醫(yī)藥組合物包含一種或一種以上所述化合物和任選地生理上可接受的載劑。用惰性脂質(zhì)制備以(例如)形成膠束有助于ApoAI的投與。在典型實(shí)施例中，ApoAI是作為口服補(bǔ)充劑的一部分經(jīng)口投與。另一選擇為，其可通過(guò)(例如)附著到個(gè)體皮膚的貼劑經(jīng)皮投與。
[0109]盡管在本發(fā)明醫(yī)藥組合物中可采用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適宜載劑，但載劑類型將根據(jù)投與模式而變。本發(fā)明組合物可經(jīng)調(diào)配用于任何適宜的投與方式，包括(例如)局部、經(jīng)口、經(jīng)鼻、靜脈內(nèi)、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、真皮內(nèi)、經(jīng)皮或肌內(nèi)投與。對(duì)于非經(jīng)腸投與(例如皮下注射)，載劑優(yōu)選地包含脂肪和任選地水、鹽水、醇、蠟或緩沖液。對(duì)于經(jīng)口投與，可采用上述載劑中的任一者或固體載劑，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂。還可采用生物可降解微球體(例如，聚乳酸-聚乙醇酸)作為本發(fā)明醫(yī)藥組合物的載劑。
[0110]另外，載劑可含有其它藥理上可接受的賦形劑用于改變或維持調(diào)配物的pH、滲透性、粘度、澄清度、顏色、無(wú)菌度、穩(wěn)定性、溶解率或氣味。類似地，載劑可含有其它藥理上可接受的賦形劑用于改變或維持分子的穩(wěn)定性、溶解率、釋放或穿過(guò)血腦屏障的吸收或滲透。所述賦形劑是那些通常且按慣例用于調(diào)配劑量的物質(zhì)，所述劑量用于以單位劑量或多劑量形式非經(jīng)腸投與，或用于通過(guò)從植入泵連續(xù)或周期性輸注直接輸注到CSF中。
[0111]所述組合物還可包含緩沖液(例如，中性緩沖鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水)、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸(例如甘氨酸、抗氧化劑、螯合劑(例如EDTA或谷胱甘肽)、佐劑(例如，氫氧化鋁)和/或防腐劑。另一選擇為，可將本發(fā)明組合物調(diào)配為凍干產(chǎn)物。還可使用熟知技術(shù)將化合物囊封在脂質(zhì)體內(nèi)。
[0112]醫(yī)藥組合物可含有編碼一種或一種以上如上文所述的多肽的DNA，以使得可在原位生成所述多肽。如上文所述，DNA可存于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種遞送系統(tǒng)中的任一種內(nèi)，包括核酸表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)菌和病毒表達(dá)系統(tǒng)。多種基因遞送技術(shù)為業(yè)內(nèi)所熟知，例如以下文獻(xiàn)中所闡述的技術(shù):羅蘭(Rolland),治療藥物載劑系統(tǒng)評(píng)論綜述(Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Systems) 15:143_198，1998和其中引用的參考文獻(xiàn)。適宜核酸表達(dá)系統(tǒng)含有在患者中表達(dá)所需的DNA序列(例如適宜啟動(dòng)子和終止信號(hào))。細(xì)菌遞送系統(tǒng)涉及投與細(xì)菌(例如卡介苗(Bacillus-Calmette-Guerrin)),所述細(xì)菌表達(dá)其細(xì)胞表面上的多肽的免疫原性部分或分泌此一表位。
[0113]在優(yōu)選實(shí)施例中，可使用病毒表達(dá)系統(tǒng)(例如，牛痘或其它痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒)引入DNA，所述系統(tǒng)可涉及使用非致病性(缺陷型)的有復(fù)制能力的病毒。適宜系統(tǒng)揭示于(例如)以下文獻(xiàn)中:菲希爾-霍克(Fisher-Hoch)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊86:317-321，1989 ;弗萊克斯納(Flexner)等人，紐約科學(xué)院紀(jì)事(Ann.N.Y.Acad Sc1.)569:86-103,1989 ;弗萊克斯納等人，疫苗(Vaccine)8:17-21，1990 ;美國(guó)專利第4，603，112號(hào)、第4，769，330號(hào)和第5，017，487號(hào)；W089/01973 ;美國(guó)專利第4，777，127 號(hào)；GB2, 200，651 ；ΕΡ0, 345，242 ；W091/02805 ;伯克納(Berkner)-生物技術(shù)(B1techniques) 6:616-627,1988 ;羅森菲爾德(Rosenfeld)等人，科學(xué)(Science) 252:431-434,1991 ;科爾斯(Kolls)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊91 =215-219,1994 ;卡斯-艾斯勒(Kass-Eisler)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊90:11498-11502，1993 ;古斯曼(Guzman)等人，循環(huán)(Circulat1n) 88:2838-2848,1993 ;和古斯曼等人，循環(huán)研究(Cir Res.) 73:1202-1207，1993。用于將DNA納入所述表達(dá)系統(tǒng)中的技術(shù)為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。DNA還可為“裸的”，如(例如)厄爾默(Ulmer)等人，科學(xué)259:1745-1749，1993中所述且由科恩(Cohen)，科學(xué)259:1691-1692，1993所綜述。裸DNA的攝取可通過(guò)將DNA涂布到有效轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的生物可降解珠粒上來(lái)增加。
[0114]在本發(fā)明組合物中可采用多種佐劑中的任一種。大多數(shù)佐劑含有經(jīng)設(shè)計(jì)以防止肽快速分解代謝的物質(zhì)(例如氫氧化鋁或礦物油)和免疫反應(yīng)的刺激劑(例如脂質(zhì)A、百日咳博德特菌(Bortadella pertussis)或結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)源蛋白質(zhì))。適宜佐劑可從市場(chǎng)購(gòu)得，如(例如)弗氏不完全佐劑(Freund' s IncompleteA djuvant)和完全佐劑(狄?？茖?shí)驗(yàn)室(Difco Laboratories),底特律,密歇根州)；默克(Merck)佐劑65(默克公司(Merck and Company, Inc.),羅韋，新澤西州)；招鹽,例如氫氧化鋁凝膠(明礬)或磷酸鋁；鈣、鐵或鋅鹽；?；野彼狨；堑牟蝗苄詰腋∫海魂?yáng)離子或陰離子衍生多糖；聚磷腈生物可降解微球體；單磷?；|(zhì)A和奎爾(quil)A。還可使用細(xì)胞因子(例如GM CSF或白介素-2、-7或-12)作為佐劑。
[0115]本文所述組合物可作為持續(xù)釋放調(diào)配物(即，在投與后實(shí)現(xiàn)化合物的緩釋的調(diào)配物，例如膠囊或海綿劑)的一部分來(lái)投與。所述調(diào)配物一股可使用熟知技術(shù)來(lái)制備且通過(guò)(例如)經(jīng)口、經(jīng)直腸或皮下植入或通過(guò)在所需靶位點(diǎn)、例如手術(shù)切除腫瘤的位點(diǎn)植入來(lái)投與。持續(xù)釋放調(diào)配物可含有分散于載劑基質(zhì)中和/或含于由控速膜包圍的儲(chǔ)藥器內(nèi)的多肽、多核苷酸或抗體。用 于所述調(diào)配物內(nèi)的載劑是生物相容的，且也可為生物可降解的；優(yōu)選地，所述調(diào)配物提供相對(duì)恒定的活性組份釋放水平。含于持續(xù)釋放調(diào)配物內(nèi)的活性化合物的量取決于植入位點(diǎn)、釋放的速率和預(yù)期持續(xù)時(shí)間以及待治療或預(yù)防的病狀的性質(zhì)。
[0116]投與和劑暈
[0117]組合物經(jīng)常以任何適宜方式與醫(yī)藥上可接受的載劑一起或以醫(yī)藥上可接受的鹽的形式來(lái)投與。可獲得在本發(fā)明情況下將ApoA-1投與個(gè)體的適宜方法，且盡管可使用一種以上途徑來(lái)投與具體組合物，但一種具體途徑經(jīng)?？商峁┍攘硪环N途徑更直接且更有效的反應(yīng)。
[0118]在本發(fā)明情況下,投與患者的劑量應(yīng)足以隨時(shí)間在患者中實(shí)現(xiàn)有益治療反應(yīng),或抑制疾病進(jìn)展。因此，將組合物以足以激發(fā)減輕、減少、治愈或至少部分阻止疾病的癥狀和/或并發(fā)癥的效果的量投與個(gè)體。將足以實(shí)現(xiàn)此效果的量定義為“治療有效劑量”。一股來(lái)說(shuō)，對(duì)于包含一種或一種以上多肽的醫(yī)藥組合物，每一種多肽存于劑量中的量介于約100 μ g/kg宿主到5mg/kg宿主范圍內(nèi)。適宜分量將隨患者大小而變,但通常將介于約0.1mL到約5mL范圍內(nèi)。
[0119]投與本文所揭示治療組合物的途徑和頻率以及劑量將隨個(gè)體而變，且可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)容易地確立。一股來(lái)說(shuō)，醫(yī)藥組合物可通過(guò)注射(例如,皮內(nèi)、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)、鼻內(nèi)(例如，通過(guò)吸氣)或經(jīng)口投與。優(yōu)選地，可經(jīng)52周時(shí)期投與介于I次與10次之間的劑量。優(yōu)選地，以I個(gè)月的間隔投與6次劑量且在之后周期性地給予加強(qiáng)疫苗接種。替代方案可能適合于個(gè)別患者。在一個(gè)實(shí)施例中，隔10天投與2種或2種以上口服補(bǔ)充劑。
[0120]一股來(lái)說(shuō)，適宜劑量和治療方案以足以提供治療性和/或預(yù)防性益處的量提供活性化合物。此一反應(yīng)可通過(guò)在所治療患者中建立與未治療患者相比改良的臨床結(jié)果(例如，更頻繁的緩和、完全或部分或更久無(wú)疾病存活)來(lái)監(jiān)測(cè)。
[0121]治療包括預(yù)防和治療。預(yù)防或治療可通過(guò)在單一時(shí)間點(diǎn)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)向單一或多個(gè)位點(diǎn)單一投與來(lái)完成。還可幾乎同時(shí)向多個(gè)位點(diǎn)投與?；颊呋騻€(gè)體包括哺乳動(dòng)物，例如人類、牛、馬、犬、貓、豬和羊動(dòng)物。個(gè)體優(yōu)選地是人類。在典型實(shí)施例中，治療包含向個(gè)體投與呈其天然未修飾全長(zhǎng)形式的ApoAI。
[0122]實(shí)魁
[0123]呈現(xiàn)以下實(shí)例以闡釋本發(fā)明并輔助所屬領(lǐng)域技術(shù)人員制備和使用本發(fā)明。決不將所述實(shí)例視為原本會(huì)限制本發(fā)明的范圍。
[0124]實(shí)例1:AroA_I在NIH-3T3成纖維細(xì)朐中預(yù)防UV誘導(dǎo)的細(xì)朐死亡和氣化件應(yīng)激
[0125]此實(shí)例顯示，ApoA-1處理在NIH-3T3成纖維細(xì)胞(皮膚細(xì)胞)中預(yù)防UV誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和氧化性應(yīng)激。將NIH3T3 (I X 16)細(xì)胞接種于96孔板的4個(gè)單獨(dú)板中。在24hr后，將細(xì)胞饑餓過(guò)夜。以濃度(10 μ g/ml)使用Apo A-1將細(xì)胞處理24hr。在處理后用PBS洗滌細(xì)胞。使用一個(gè)板作為對(duì)照，不經(jīng)UV處理。使用其余三個(gè)板以5、10和20mJ/cm2進(jìn)行UV處理。在UV處理后，給予細(xì)胞完全培養(yǎng)基且將其再培養(yǎng)24hr。如先前所述測(cè)量所有板的細(xì)胞活力(加納帕蒂E (Ganapathy E)等人,2011, ApoA-1模擬肽D-4F通過(guò)上調(diào)抗氧化酶MnSOD來(lái)抑制上皮卵巢癌細(xì)胞的增殖和致腫瘤性(D-4F, an apoA-lmimetic peptideinhibits proliferat1n and tumorigenicity of epithelial ovarian cancer cel Isby upregulating the ant1xidant enzyme MnSOD),國(guó)際癌癥雜志(Int J Cancer) 130:1071-1081)。
[0126]結(jié)果顯示，UV處理降低NIH3T3細(xì)胞的細(xì)胞活力(圖1)。ApoA-1處理(10 μ g/ml)防止NIH3T3細(xì)胞發(fā)生UV誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(圖2)。也與HDL樣apoA_I相關(guān)的蛋白質(zhì)ApoA-1I無(wú)法預(yù)防NIH3T3細(xì)胞的UV誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(圖2)。因此，ApoA-1在NIH-3T3成纖維細(xì)胞(皮膚細(xì)胞)中有效預(yù)防UV誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和氧化性應(yīng)激。ApoA-1在預(yù)防和治療促炎性皮膚病狀中具有潛在作用。
[0127]實(shí)例2:使用牛HDL對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展的抑制
[0128]此實(shí)例顯示，bHDL(牛HDL)在結(jié)腸癌的小鼠模型中影響促炎性病狀，例如腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展。在皮下或經(jīng)口投與時(shí)，在BALB/c小鼠中，bHDL降低CT26細(xì)胞(小鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞系)的活力和增殖并減少CT26細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤負(fù)擔(dān)。結(jié)腸癌的血清生物標(biāo)記溶血磷脂酸(LPA)的血漿水平在接受bHDL模擬物的小鼠中也顯著降低，表明結(jié)合并移除促炎性脂質(zhì)是bHDL抑制腫瘤發(fā)展的潛在機(jī)制。此外，在APCmin/+小鼠(人類家族性腺瘤性息肉病的小鼠模型)中，bHDL顯著減小息肉的大小和數(shù)目。
[0129]最新研究表明，HDL水平與結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)逆相關(guān)。從多種具有不同結(jié)構(gòu)的肽和蛋白質(zhì)構(gòu)筑的HDL模擬物具有使人聯(lián)想到HDL的抗炎癥和抗氧化劑性質(zhì)。此實(shí)例中呈現(xiàn)的結(jié)果顯示，bHDL分子可有效抑制誘導(dǎo)型和自發(fā)型促炎性病狀(例如結(jié)腸癌)的發(fā)展。這些結(jié)果首次將bHDL鑒別為用于治療促炎性病狀的新穎治療策略,本文中例示為預(yù)防和治療結(jié)腸癌。
[0130]小鼠
[0131]洛杉肌加利福尼亞大學(xué)(University of California)的動(dòng)物研究委員會(huì)(Animal Research Committee)批準(zhǔn)了所有小鼠方案。6周齡BALB/c雌性小鼠和6周齡C57BL/6J-APCMm/+ 雄性小鼠購(gòu)自杰克遜實(shí)驗(yàn)室(The Jackson Laboratory)。
[0132]bHDL
[0133]bHDL得自生物醫(yī)學(xué)技術(shù)公司。對(duì)于在飲食中投與bHDL，使用基本上如先前針對(duì)西方飲食(Western diet)所述的技術(shù)(18)將bHDL混合到標(biāo)準(zhǔn)鼠糧(羅爾斯頓普瑞納(Ralston Purina))中。然而，在本文所報(bào)告的任一實(shí)驗(yàn)中未投與西方飲食；小鼠僅接受含或不含bHDL的標(biāo)準(zhǔn)鼠糧。
[0134]細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
[0135]源自N-亞硝基-N-甲基氨基甲酸乙酯誘導(dǎo)的BALB/c來(lái)源的小鼠結(jié)腸癌的CT26細(xì)胞系是購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collect1n, ATCC)。首先在96孔培養(yǎng)板的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)CT26細(xì)胞(2，000個(gè)細(xì)胞/孔)，且在24小時(shí)后將培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基。在過(guò)夜培育后，用媒劑(對(duì)照)處理細(xì)胞，或用lOyg/mL的任一bHDL處理。將bHDL溶解于H20中。將細(xì)胞再培育48小時(shí)并使用MTS分析試劑盒(普洛麥格(Promega))根據(jù)制造商的方案分析活力。對(duì)于增殖分析，在48小時(shí)培育的最后4小時(shí)中用BrdU標(biāo)記細(xì)胞。隨后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌，固定，且與小鼠抗BrdU抗體在室溫下一起培育I小時(shí)，并通過(guò)過(guò)氧化 物酶偶合的山羊抗小鼠二級(jí)抗體(卡爾生物化學(xué)(Calb1chem))進(jìn)行檢測(cè)。使用雙波長(zhǎng)450nm和540nm測(cè)量吸光度。
[0136]腫瘤負(fù)荷研究
[0137]向6周齡BALB/c雌性小鼠給予100 μ L皮下注射的制備為PBS中的單細(xì)胞懸浮液的IX 106CT26細(xì)胞，并用每天以10mg/kg皮下(SQ)投與15天的bHDL或BHDL處理小鼠。處死小鼠并測(cè)量腫瘤重量。
[0138]活體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移。
[0139]通過(guò)尾靜脈注射向BALB/c小鼠靜脈內(nèi)注射于100 μ L PBS中的2X104CT26細(xì)胞，并用以10mg/kg/天SQ投與3周的bHDL處理小鼠；或用以100mg/kg/天在鼠糧飲食中投與3周的bHDL處理。在3周處理后,處死小鼠；采集肺,稱重并用布安溶液(Bouin' ssolut1n,西格瑪(Sigma))固定。對(duì)肺表面上的腫瘤結(jié)節(jié)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0140]APCmw+小鼠研究
[0141]用以100mg/kg/天在鼠糧飲食中投與的bHDL處理基于C57BL/6J背景的6周齡APCmw+雄性小鼠。在8周處理后，處死小鼠。立刻移除全腸，在福爾馬林(formalin)和70%乙醇中固定。打開腸并在解剖顯微鏡下檢查以對(duì)腫瘤進(jìn)行計(jì)數(shù)和測(cè)量。
[0142]免疫組織化學(xué)(IHC)染色
[0143]用石蠟固定并包埋肺表面的腫瘤組織，以5μπι厚度切片。用二甲苯將切片脫石蠟，用100 %、90 %、70 %和50 %乙醇再水合，用20 μ g/mL蛋白酶K處理30min，并在室溫下用3% H2O2處理30min以抑制內(nèi)源過(guò)氧化物酶，用在PBS中制備的10%正常山羊血清和4%BSA封閉3h，且隨后在4°C下與1: 50大鼠抗小鼠單克?、?1抗體一起培育過(guò)夜。將切片與相應(yīng)生物素化二級(jí)抗體一起培育I小時(shí)，之后與維克塔斯頓ABC精英試劑(VectastainABC Elite reagent) 一起培育。
[0144]細(xì)胞周期分析
[0145]將CT26細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)過(guò)夜，然后血清饑餓48小時(shí)。用媒劑(對(duì)照)處理細(xì)胞，或用1(^8/1^8冊(cè)1^或6樸冊(cè)1^處理，且再培育48小時(shí)。收集細(xì)胞，用PBS洗滌，并用70%冰冷甲醇在4°C下固定過(guò)夜。通過(guò)離心收集經(jīng)固定細(xì)胞，用PBS洗滌，且再懸浮于含有40 μ g/mL RNaseA和100 μ g/mL碘化丙啶的0.3ml PBS中，并通過(guò)來(lái)自BD生物科學(xué)(BDB1sciences)的FACScan實(shí)施流式細(xì)胞技術(shù)細(xì)胞周期分析。
[0146]蛋白質(zhì)印跡分析
[0147]在于50mM Tris 緩沖液(pH7.5)中含有 0.1M NaCl、5mM EDTA、50mM 正釩酸鈉、I %曲拉通(Triton)X-1OO和蛋白酶抑制劑片劑的細(xì)胞裂解緩沖液中處理后，收集總細(xì)胞蛋白質(zhì)。通過(guò)SDS-PAGE分離20 μ g總蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，之后與一級(jí)抗體在4°C下在5%脫脂乳和0.1%吐溫(TWeen)-20中一起培育。以1: 1000稀釋度使用抗細(xì)胞周期蛋白Dl和抗細(xì)胞周期蛋白A兔多克隆抗體，且以1: 2000稀釋度使用抗β-肌動(dòng)蛋白多克隆抗體。
[0148]ELISA 分析
[0149]通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA根據(jù)制造商的方案(英杰(Invitrogen))測(cè)量血漿中的11-6濃度。
[0150]LPA結(jié)合親和性和血清LPA水平
[0151]LPA(20: 4)購(gòu)自阿凡提極性脂質(zhì)(Avanti Polar Lipids)。如先前所述測(cè)定LPA水平(墨菲等人，2007，酶學(xué)方法(Methods Enzymol) 433:1-25)。
[0152]統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0153]數(shù)據(jù)顯示為每組的平均值土SD。通過(guò)不成對(duì)t測(cè)試來(lái)執(zhí)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在P〈0.05下的所有結(jié)果都視為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著。
[0154]結(jié)果
[0155]結(jié)果顯示于圖3中。對(duì)肺重量和腫瘤體積二者的評(píng)估以及目測(cè)顯示，在APCmin/+小鼠(人類家族性腺瘤性息肉病的小鼠模型)中，bHDL顯著降低息肉的大小和數(shù)目。
[0156]實(shí)例3:使用HDL模擬物對(duì)腫瘤發(fā)展的抑制
[0157]此實(shí)例顯示，HDL模擬物可用于在結(jié)腸癌小鼠模型中抑制腫瘤發(fā)展。
[0158]小鼠
[0159]洛杉磯加利福尼亞大學(xué)的動(dòng)物研究委員會(huì)批準(zhǔn)了所有小鼠方案。6周齡BALB/c雌性小鼠購(gòu)自杰克遜實(shí)驗(yàn)室。
[0160]肽
[0161 ] apoA-1 模擬肽 L-4F (Ac-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-NH2 ；SEQ ID NO:12)和含有與 4F肽中相同但以序列(Ac-D-W-F-A-K-D-Y-F-K-K-A-F-V-E-E-F-A-K-NH2 ；SEQID NO:13)排列以防止形成A類兩親性螺旋的氨基酸的亂序肽(SC-4F)都是全部從L-氨基酸合成。還測(cè)試名為 L-4F2 的另一種肽(Ac-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-Aib-E-K-F-K-E-Aib-F-NH2 ；SEQ ID NO: 14)，其中 A11 和 A17 經(jīng) α -氨基異丁酸(Aib)取代。肽 Ac-hE18A_NH2 (28ΑΑ)具有氨基酸序列 L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F (SEQ ID NO:2)，其具有雙結(jié)構(gòu)域且是通過(guò)將apoE的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域141-150 (L-R-K-L-R-K-R-L-L-R ；SEQ ID NO:15)共價(jià)連接到A類兩親性螺旋肽18A衍生的。具有序列L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-Aib-E-K-L-K-E-Aib-F (SEQ ID NO:7)的肽 28AA-2，其中 A11 和 A17經(jīng)α-氨基異丁酸(Aib)取代。將所有肽溶解于H2O中。
[0162]細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
[0163]首先在96孔培養(yǎng)板中的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)CT26和ΝΙΗ3Τ3細(xì)胞(2，000個(gè)細(xì)胞/孔)，且在24小時(shí)后將培養(yǎng)及更換為無(wú)血清培養(yǎng)基。在過(guò)夜培育后，用媒劑(對(duì)照)處理細(xì)胞，或用10 μ g/mL L_4F或L-4F2或28AA或28AA-2肽處理。將細(xì)胞再培育48小時(shí)并使用MTS分析試劑盒(普洛麥格)根據(jù)制造商的方案分析活力。
[0164]腫瘤負(fù)荷研究
[0165]向6周齡BALB/c雌性小鼠給予制備為PBS中的單細(xì)胞懸浮液的10ul皮下注射的1X106CT26細(xì)胞，用以10mg/kg每天SQ投與15天的肽處理。殺死小鼠并測(cè)量腫瘤重量。使用公式V = 1/2 (LXff2)測(cè)量腫瘤體積。
[0166]LPA結(jié)合親和性和血清LPA水平
[0167]LPA(20: 4)購(gòu)自阿凡提極性脂質(zhì)。如先前所述測(cè)定血清LPA水平(18)。
[0168]統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 [0169]數(shù)據(jù)顯示為每組的平均值土SD。通過(guò)不成對(duì)t測(cè)試來(lái)執(zhí)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在P〈0.05下的所有結(jié)果都視為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著。
[0170]在BALB/c小鼠中在CT26細(xì)胞注射后，肽抑制腫瘤發(fā)展。
[0171]CT-26是結(jié)腸腺癌細(xì)胞系，其在靜脈內(nèi)引入免疫活性BALB/c小鼠中時(shí)產(chǎn)生轉(zhuǎn)移性肺腫瘤。首先檢查以10mg/kg/天SQ投與的L-4F、L-4F2和sc_4F(亂序肽，其含有與4F肽中相同但以防止形成A類兩親性螺旋的序列排列的氨基酸)在側(cè)腹皮下注射IX 16個(gè)CT26細(xì)胞的BALB/c小鼠中對(duì)側(cè)腹腫瘤形成的作用。在遠(yuǎn)離CT26細(xì)胞注射部位的部位用以1mg/kg每天皮下注射15天的sc-4F (η = 9)或L_4F (η = 8)或L-4F2 (η = 10)處理小鼠。與經(jīng)L-4F處理的小鼠相比，在經(jīng)SC-4F處理的BALB/c小鼠中，側(cè)腹腫瘤重量和體積顯著較大，如所預(yù)期(273mg 對(duì) 179mg, Ρ〈0.05 ；555mm3 對(duì) 313mm3, Ρ〈0.05，圖 4Α、4Β);且與經(jīng) L-4F2 處理的小鼠相比，在經(jīng)sc-4F處理的小鼠中，腫瘤重量和體積同樣顯著較大(273mg對(duì)118mg，Ρ〈0.001 ;555mm3對(duì)197mm3, P<0.001，圖4A、4B)。來(lái)自經(jīng)L-4F2處理的小鼠的腫瘤與經(jīng)L-4F處理的小鼠相比顯著較小(179mg對(duì)118mg, Ρ〈0.05 ;313mm3對(duì)197mm3,圖4A、4B)。三個(gè)組的側(cè)腹腫瘤的代表性照片顯示于圖4E中。圖4C和4D顯示三個(gè)組中每一組的重量和體積計(jì)分的分布百分比(對(duì)照作為100% )。
[0172]隨后檢查28AA和28AA-2肽處理是否影響B(tài)ALB/c小鼠側(cè)腹中的腫瘤發(fā)展。6周齡BALB/c雌性小鼠在側(cè)腹皮下注射I X 16個(gè)CT26細(xì)胞。在遠(yuǎn)離CT26細(xì)胞注射部位的部位用以10mg/kg每天皮下注射15天的媒劑(η = 12)或28ΑΑ(η = 10)或28ΑΑ-2 (η = 11)處理小鼠。與經(jīng)28ΑΑ處理的小鼠相比，在經(jīng)媒劑處理的BALB/c小鼠中，側(cè)腹腫瘤的大小和重量顯著較大(371mg對(duì)188mg，Ρ〈0.05)(圖5A、5B)。圖5C和顯示三個(gè)組中每一組的重量和體積計(jì)分的分布百分比(對(duì)照作為100% )。三個(gè)組的側(cè)腹腫瘤的代表性照片顯示于圖5E中。
[0173]在活體外，肽抑制CT26細(xì)胞活力，但不抑制NIH3T3細(xì)胞。
[0174]為檢查在小鼠中肽抑制CT26細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤發(fā)展的機(jī)制，在活體外測(cè)定肽對(duì)CT26細(xì)胞活力的作用。在與對(duì)照相比時(shí)，在經(jīng)LIF(1ygAil)處理的CT26細(xì)胞中，細(xì)胞活力降低超過(guò)20% (Ρ〈0.05)(圖6Α);且與對(duì)照相比，在經(jīng)L-4F2 (10 μ g/ml)處理的CT26細(xì)胞中，細(xì)胞活力也降低超過(guò)30% (Ρ〈0.0001)(圖6A)。此外，與L-4F處理相比，用L-4F2處理顯著降低CT26細(xì)胞活力(Ρ〈0.05)(圖6Α)。CT26細(xì)胞活力是在活體外通過(guò)用28AA和28ΑΑ-2肽處理來(lái)測(cè)定。在與對(duì)照相比時(shí)，細(xì)胞活力在經(jīng)28ΑΑ肽(10 μ g/ml)處理的CT26細(xì)胞中降低70% (P〈0.0001)，且在經(jīng)28AA-2(10μg/ml)處理的細(xì)胞中降低64% (Ρ〈0.0001)(圖6Α)。還在活體外通過(guò)用所有4種肽處理來(lái)測(cè)定ΝΙΗ3Τ3細(xì)胞活力。ΝΙΗ3Τ3細(xì)胞活力不受4種肽中任一種的影響(圖6Β)。
[0175]實(shí)例4:在人類卵巢癌細(xì)胞系和小鼠卵巢癌模型中，載脂蛋白A-1模擬肽抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1的表達(dá)和活性
[0176]此實(shí)例顯示，apoA-1模擬肽抑制缺氧誘導(dǎo)因子_1 a (HIF_1 α )的表達(dá)和活性，所述缺氧誘導(dǎo)因子在血管生成因子的產(chǎn)生和血管生成中具有關(guān)鍵作用。使用免疫組織化學(xué)染色來(lái)檢查腫瘤組織中HIF-1 α的表達(dá)。使用免疫印跡法、實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、免疫熒光和熒光素酶活性分析來(lái)測(cè)定人類卵巢癌細(xì)胞系中HIF-Ια的表達(dá)和活性。免疫組織化學(xué)染色顯示，L-4F處理顯著減少小鼠卵巢腫瘤組織中的HIF-Ια表達(dá)。在兩種人類卵巢癌細(xì)胞系0V2008和CA0V-3中，L-4F抑制由低氧濃度、氯化鈷(CoCl2，缺氧模擬化合物)、溶血磷脂酸和胰島素誘導(dǎo)的HIF-1 α的表達(dá)和活性。L-4F對(duì)胰島素誘導(dǎo)的Akt磷酸化無(wú)影響，但抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和P70s6激酶的活化，從而導(dǎo)致抑制HIF-1 α合成。在胰島素和CoCl2處理細(xì)胞二者中，L-4F預(yù)處理顯著加快HIF-1a的蛋白酶體依賴性蛋白質(zhì)降解。L-4F對(duì)HIF-1 α表達(dá)的抑制作用部分是通過(guò)L-4F的活性氧物質(zhì)清除作用來(lái)介導(dǎo)。在活體內(nèi)和活體外模型二者中，ApoA-1模擬肽抑制HIF-1 α的表達(dá)和活性，從而表明對(duì)HIF-1 α的抑制可為負(fù)責(zé)apoA-1模擬肽壓制腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵機(jī)制。 [0177]腫瘤血管生成在實(shí)體瘤(包括卵巢癌)的生長(zhǎng)和進(jìn)展中具有關(guān)鍵作用(福克曼(Folkman), 1971 ;哈納汗(Hanahan)和?？寺?，1996 ;卡莫利特(Carmeliet)和杰恩(Jain)，2000 ;注意，對(duì)整個(gè)實(shí)例4中參考文獻(xiàn)的完整引用可參見高(Gao)等人，2012，藥理學(xué)與實(shí)驗(yàn)治療學(xué)雜志(J.Pharm.Exper.Ther.) 342: 255-262)。在血管生成因子中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)參與新血管形成的每一個(gè)步驟，包括增殖、遷移、侵襲、內(nèi)皮細(xì)胞的血管形成和各種類型的血管生成相關(guān)細(xì)胞(包括VEGF受體I陽(yáng)性細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞)的募集(拉斐(Rafii)等人，2002 ;阿當(dāng)斯(Adams)和阿利塔洛(Alitalo)，2007 ;埃利斯(Ellis)和?？肆?Hicklin)，2008)。最近，顯示對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的壓制至少部分是通過(guò)抑制VEGF的產(chǎn)生和隨后的腫瘤血管生成來(lái)介導(dǎo)的(高等人，2011)。
[0178]缺氧誘導(dǎo)因子I(HIF-1)的表達(dá)和活性對(duì)腫瘤組織中VEGF和其它血管生成因子的產(chǎn)生至關(guān)重要。HIF-1是異源二聚轉(zhuǎn)錄因子，其由組成型表達(dá)的HIF-Ια和可誘導(dǎo)的α-亞單位HIF-1a組成。在腫瘤組織過(guò)度生長(zhǎng)時(shí)，位置距血管100 μ m以上的腫瘤細(xì)胞處于缺氧狀況。由于HIF-1a降解的氧依賴性，低氧濃度導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解降低，從而導(dǎo)致HIF-1 α積累。另一方面，一些激素和生長(zhǎng)因子(包括胰島素和溶血磷脂酸(LPA))也在常氧狀況下通過(guò)活化各種信號(hào)傳導(dǎo)路徑促進(jìn)HIF-1 α的蛋白質(zhì)積累(曹(Cao)等人，2004;李(Lee)等人，2006、2009)。HIF-1 α結(jié)合到HIF-1 α，移位到核中，并通過(guò)下游基因的轉(zhuǎn)錄活化促進(jìn)腫瘤發(fā)生，其蛋白質(zhì)產(chǎn)物為血管生成(包括VEGF和血管生成素)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞存活所需要(西門扎(Semenza), 2003 ;鮑瑟戈(Pouysse' gur)和麥克塔-格里格瑞(Mechta-Grigor1u)，2006 ;鮑瑟戈等人，2006)。在此實(shí)例中，在人類卵巢癌細(xì)胞系和小鼠卵巢腫瘤組織中檢查L(zhǎng)-4F和L-5F對(duì)HIF-1 α的表達(dá)和活性的效應(yīng)，以描述在apoA_I模擬肽的抗血管生成和抗腫瘤發(fā)生效應(yīng)背后的機(jī)制。
[0179]細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)和試劑。在含有以下物質(zhì)的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)0V2008細(xì)胞:10%胎牛血清、青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100g/ml)、lX最低必需培養(yǎng)基非必需氨基酸溶液(英杰，卡爾斯巴德，加利福尼亞州)和胰島素(0.25U/ml)(英杰)。在由以下物質(zhì)組成的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)CA0V-3細(xì)胞:達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’ s modifiedEagle’ s medium)，其含有高葡萄糖和L-谷氨酰胺(2mM)、10 %胎牛血清、青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100 μ g/ml)和胰島素(0.02U/ml)。為產(chǎn)生缺氧狀況，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到缺氧室(3130型；賽默飛世爾科技(Thermo Fisher Scientific),沃爾瑟姆，馬薩諸塞州)中，其中將所述細(xì)胞維持在37°C下的含有5% C02U% 02和94% N2的氣氛中。將L_4F(全部從L氨基酸合成的肽 Ac-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-NH2 (SEQ ID NO:12))以 Img/ml (每次新制備)溶解于水中并以介于I μ g/ml與10 μ g/ml之間使用。L-5F是由肽合成公司(Peptisyntha Inc.,托倫斯,加利福尼亞州)合成，將其以lmg/ml溶于ABCT緩沖液(50mM碳酸氫銨，？!17.0，含有0.lmg/ml吐溫20)中，且在使用前稀釋到所需濃度。氯化鈷(CoCl2)、胰島素、環(huán)己酰亞胺(CHX)和N-(苯甲氧基羰基)亮氨酰基亮氨?；涟彼峥s醒-Z-Leu-Leu-Leu-al (MG-132)購(gòu)自西格瑪奧爾德里奇(Sigma-Aldrich)(圣路易，密蘇里州)。如制造商所推薦干燥氯仿中的LPA(阿凡提極性脂質(zhì)，阿拉巴斯特，阿拉巴馬州)，將其以20mM濃度溶于乙醇中作為母液，且在使用前在相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)基中稀釋到所需濃度。
[0180]定量實(shí)時(shí)PCR。通過(guò)使用PureLink RNA小量試劑盒(英杰)從細(xì)胞提取總RNA。通過(guò)使用SmartSpec3000分光光度計(jì)(伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)室(B1-Rad Laboratories),海格力斯,加利福尼亞州)評(píng)價(jià)RNA的 數(shù)量和質(zhì)量。cDNA是根據(jù)制造商說(shuō)明通過(guò)使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(生物應(yīng)用系統(tǒng)，福斯特城，加利福尼亞州)來(lái)合成。PCR是通過(guò)使用CFX96實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(生物應(yīng)用系統(tǒng))來(lái)執(zhí)行。循環(huán)條件如下:在95°C下3min，之后進(jìn)行40個(gè)在95°C下1s ；在60°C下1s ;在721:下30s ;然后最終在72°C下延伸1min的循環(huán)。每一 25 μ I反應(yīng)在無(wú)核酸酶水中含有 0.4 μ g cDNA、12.5μ I SYBR 綠色 qPCR 超混合劑(Green qPCR SuperMix,伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)室)和250nM正向和反向引物。所用引物為:HIF-1 α，5' -TCC AGT TAC GTT CCTTCG ATC A-3' (SEQ ID NO:16)和 5' -TTT GAG GAC TTG CGC TTT CA-3/ (SEQ ID NO:17)；VEGF, 5' -CGG CGA AGA GAA GAG ACA CA-3' (SEQ ID NO: 18)和 5' -GGA GGA AGG TCA ACC ACTCA-3/ (SEQ ID NO:19);葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1，5' -CGG GCC AAG AGT GTG CTA AA-3' (SEQ IDNO:20)和 5' -TGA CGA TAC CGG AGC CAA TG-3' (SEQ ID NO:21);醛縮酶 _A，5' -TGC TACTAC CAG CAC CAT GC-3' (SEQ ID NO:22)和 5' -ATG CTC CCA GTG GAC TCA TC-3' (SEQ IDNO:23);以及 GAPDH，5' -GGA AGG TGA AGG TCG GAG TCA-3' (SEQ ID NO:24)和 5' -GTC ATTGAT GGC AAC AAT ATC CAC T-3' (SEQ ID NO:25)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行一次，且在每一實(shí)驗(yàn)中以一式三份測(cè)量。
[0181]蛋白質(zhì)印跡分析。蛋白質(zhì)印跡分析是如先前所述來(lái)執(zhí)行(高等人，2011)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在裂解緩沖液中收集細(xì)胞裂解物，所述裂解緩沖液在50mM Tris緩沖液(pH7.5)中含有0.現(xiàn)似(:1、51111^0了4、5(^1正釩酸鈉、1%曲拉通乂-100和蛋白酶抑制劑片劑(羅氏診斷設(shè)備(Roche Diagnostics),印第安納波利斯，印第安納州)，將所述細(xì)胞裂解物加載到4%到12% Bis-Tris凝膠(英杰)上，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，并與適當(dāng)抗體一起培育?？筽Thr2°2/Tyr2CI4-Erk、抗 Erk、抗 pThr389-p70S6 激酶、抗 p70S6 激酶、抗 pSer473_Akt 和抗 Akt抗體購(gòu)自細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)技術(shù)(Cell Signaling Technology,丹佛斯,馬薩諸塞州)；小鼠抗人類HIF-1 α抗體購(gòu)自BD菲銘真(BD Pharmingen,圣地亞哥,加利福尼亞州);兔抗小鼠HIF-1a抗體購(gòu)自艾碧康公司(Abeam Inc.，劍橋，馬薩諸塞州)；且抗GAPDH抗體購(gòu)自圣克魯斯生物技術(shù)公司(Santa Cruz B1technology Inc.,圣克魯斯,加利福尼亞州)。
[0182]細(xì)胞活性氧物質(zhì)的測(cè)量。如先前所述(周(Zhou)等人，2007 ;李等人，2009)，將0V2008細(xì)胞以4X104個(gè)細(xì)胞/孔平鋪到24孔板的玻璃片(賽默飛世爾科技)上，在正常培養(yǎng)條件中培養(yǎng)過(guò)夜，在無(wú)血清培養(yǎng)基中饑餓過(guò)夜，并用L-4F(10l.! g/ml)處理lh。然后，添加二氯熒光素二乙酸酯(DCFHDA，10 μ M)和胰島素(200nM)/CoCl2 (100 μ Μ)并與細(xì)胞一起再培育0.5h。用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)將細(xì)胞洗滌兩次。用熒光顯微鏡(奧林巴斯(Olympus)1X70 ;奧林巴斯，東京，日本)捕捉圖像。
[0183]缺氧反應(yīng)元件報(bào)道基因分析。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將0V2008細(xì)胞以2X105個(gè)細(xì)胞/孔平鋪于6孔板中并在完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜。然后，通過(guò)使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體(Lipofectamine) 2000 (英杰)將pGL3_Epo-缺氧反應(yīng)元件(HRE) -Luc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。在24h后，將細(xì)胞饑餓過(guò)夜并在刺激劑存在或不存在下實(shí)施L-4F處理。使用報(bào)道基因分析系統(tǒng)(普洛麥格，麥迪遜，威斯康辛州)測(cè)量熒光素酶活性。
[0184]HIF-1a的免疫熒光染色。免疫熒光染色是如先前所述來(lái)執(zhí)行(李等人，2006)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將0V2008細(xì)胞以4X 14個(gè)細(xì)胞/孔平鋪到24孔板中的玻璃片(賽默飛世爾科技)上且在完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜。在饑餓過(guò)夜后，在刺激劑存在或不存在下對(duì)細(xì)胞實(shí)施L-4F處理。然后，在室溫下在4%中性緩沖甲醛中將細(xì)胞固定25min，用PBS中的0.5%曲拉通X-100滲透化處理lOmin，并用在PBS中制備的10%正常山羊血清、I %牛血清白蛋白和0.3M甘氨酸封閉lh。將細(xì)胞與小鼠抗HIF-1 a (1:200)在4°C下一起培育過(guò)夜，且與阿萊克薩福羅568山羊抗小鼠IgG(英杰)一起培育lh。最后，用含有DAPI的維克塔芒特(VectaMount)溶液(媒介實(shí)驗(yàn)室(Vector Laboratories),伯靈格姆,加利福尼亞州)覆蓋細(xì)胞，并用熒光顯微鏡(奧林巴斯1X70)捕捉圖像。
[0185]活體內(nèi)腫瘤模型。向9周齡C57BL/6J雌性小鼠給予0.5ml皮下注射的5X 106ID8細(xì)胞，所述細(xì)胞制備為在與等體積的冷基質(zhì)膠(Matrigel，BD生物科學(xué)，圣約瑟，加利福尼亞州)混合的PBS中的單細(xì)胞懸浮液。在2周后，小鼠開始通過(guò)在遠(yuǎn)離ID8細(xì)胞注射部位的位點(diǎn)每天皮下注射3周接受亂序4F肽(sc-4F)或L-4F(10mg/kg)。在3周后，處死小鼠以供收集腫瘤和進(jìn)一步分析。
[0186]免疫組織化學(xué)染色。對(duì)冷凍腫瘤組織以5 μ m厚度進(jìn)行切片并在_20°C下用冷丙酮固定lOmin。用在PBS中制備的10%正常山羊血清和4%牛血清白蛋白將切片封閉3h，且立即與兔抗小鼠多克隆HIF-1a抗體(I: 200)(艾碧康公司)或大鼠抗小鼠單克隆CD31抗體(I: 25)(艾碧康公司)在4°C下一起培育過(guò)夜。然后將切片與相應(yīng)生物素化二級(jí)抗體(媒介實(shí)驗(yàn)室)在室溫下一起培育30min，之后與維克塔斯頓ABC精英試劑(媒介實(shí)驗(yàn)室)一起培育以使染色可見。最后，用蘇木素對(duì)切片進(jìn)行輕度復(fù)染色，脫水，且用維克塔芒特溶液(媒介實(shí)驗(yàn)室)加蓋玻片。[0187]統(tǒng)計(jì)學(xué)。數(shù)據(jù)顯示為每組的平均值土S.D.。通過(guò)不成對(duì)t測(cè)試執(zhí)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。如果P〈0.05，那么認(rèn)為所有測(cè)試結(jié)果都顯著。
[0188]L-4F在活體內(nèi)抑制HIF-1a表達(dá)和血管生成。先前數(shù)據(jù)顯示，在使用上皮癌癥細(xì)胞系ID8的卵巢癌的免疫活性小鼠模型中，apoA-1模擬肽L-4F和L-5F抑制腫瘤生長(zhǎng)和血管生成(高等人，2011)?？紤]到HIF-1a在VEGF (腫瘤血管生成中涉及的關(guān)鍵生長(zhǎng)因子)的產(chǎn)生中的重要性，首先通過(guò)使用相同模型檢查L(zhǎng)-4F對(duì)HIF-1 α表達(dá)的效應(yīng)。免疫組織化學(xué)染色顯示，與對(duì)照肽(SC-4F)處理組相比，L-4F處理在腫瘤組織中降低HIF-1 α表達(dá)(圖7A)。與先前報(bào)道(高等人，2011) —致，觀察到與對(duì)照組相比，L-4F處理小鼠中血管數(shù)減少(圖7A ;還參見高等人，2012，JPET342: 255-262的網(wǎng)上版中包括的補(bǔ)充材料)。
[0189]1^-4?和1^-5?在細(xì)胞培養(yǎng)物中抑制!1正-10表達(dá)。為檢查L(zhǎng)_4F是否在缺氧狀況下的細(xì)胞中抑制HIF-1 α表達(dá)，在人類卵巢癌細(xì)胞系0V2008中使用低氧濃度(1% O2)和缺氧模擬化學(xué)物質(zhì)CoCl2來(lái)誘導(dǎo)HIF-1 α表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，L-4F以劑量依賴性方式壓制缺氧誘導(dǎo)的HIF-1 α蛋白質(zhì)表達(dá)(圖7B ;還參見網(wǎng)上版的補(bǔ)充材料)。在用10nM和200nM的胰島素(圖7B)和20 μ M的LPA處理0V2008細(xì)胞時(shí)觀察到類似結(jié)果(還參見補(bǔ)充材料)。
[0190]為進(jìn)一步確認(rèn)L-4F在HIF-1 α表達(dá)中的抑制性作用，研究另外兩種人類卵巢癌細(xì)胞系CA0V-3和SK0V3。與0V2008細(xì)胞的數(shù)據(jù)一致，L-4F在CA0V-3細(xì)胞(圖7A)和SK0V3細(xì)胞二者中以劑量依賴性方式抑制CoCl2-和胰島素誘導(dǎo)的HIF-1 α表達(dá)。
[0191]為檢查對(duì)HIF-1 α的抑制性效應(yīng)是否對(duì)L_4F具有特異性，使用另一種apoA_I模擬肽L-5F來(lái)處理0V2008細(xì)胞。與L-4F處理類似，L-5F以劑量依賴性方式抑制低氧和CoCl2刺激的HIF-1 α表達(dá)(參 見補(bǔ)充材料)。
[0192]作為轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1a在核中發(fā)揮功能并活化下游基因的表達(dá)。使用免疫熒光染色來(lái)檢查L(zhǎng)-4F對(duì)HIF-1 α蛋白質(zhì)的核水平的效應(yīng)。CoCl2和胰島素處理顯著增加HIF_1 a在0V2008細(xì)胞核中的積累，且L-4F的預(yù)處理顯著逆轉(zhuǎn)這些效應(yīng)(圖7C和D)。
[0193]1^-4?對(duì)!1正-10依賴性基因轉(zhuǎn)錄的抑制。為確定L-4F是否抑制HIF-1 α驅(qū)動(dòng)的基因轉(zhuǎn)錄，用含有HRE的熒光素酶報(bào)道基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染0V2008細(xì)胞。L-4F處理顯著抑制CoCl2-和胰島素介導(dǎo)的對(duì)熒光素酶活性的誘導(dǎo)(圖8A和C)。此外，L-4F處理消除CoCl2-和胰島素誘導(dǎo)的HIF-1 α靶基因(包括VEGF、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I和醛縮酶-A)的mRNA水平的增加(圖8B和D)，從而表明L-4F抑制HIF-1 α蛋白質(zhì)表達(dá)和活性二者。
[0194]在CoCl2-和胰島素處理的0V2008細(xì)胞中，L-4F的后處理降低HIF-1 α蛋白質(zhì)水平和活性。由于HIF-1 α表達(dá)在臨床上呈現(xiàn)的晚期腫瘤中升高，所以隨后檢查在缺氧或生長(zhǎng)因子刺激后給予的L-4F是否抑制HIF-1 α表達(dá)。首先用CoCl2或胰島素將0V2008細(xì)胞刺激3h (參見補(bǔ)充材料)或24h (圖9)，隨后用L-4F處理不同持續(xù)時(shí)間。L-4F的后處理在0V2008細(xì)胞中顯著降低HIF-1 α表達(dá)(圖9A ;還參見補(bǔ)充材料)。免疫熒光分析顯示，L-4F的后處理降低HIF-1 α的核表達(dá)(圖9B ;還參見補(bǔ)充材料)。此外，核中HIF-1 α蛋白質(zhì)的下調(diào)與對(duì)下游HIF-1 α靶基因的轉(zhuǎn)錄的抑制有關(guān)(圖9C ;還參見補(bǔ)充材料)。
[0195]1^-4?不影響!1正-10轉(zhuǎn)錄。為確定L-4F是否在轉(zhuǎn)錄水平上影響HIF-1 α合成，對(duì)HIF-1 a mRNA含量進(jìn)行定量以確定HIF-1 a mRNA水平變化是否先于蛋白質(zhì)。實(shí)時(shí)RT-PCR分析指示，L-4F對(duì)HIF-1 a mRNA的基礎(chǔ)水平無(wú)影響(參見補(bǔ)充材料)。此外，與先前報(bào)道(西門扎，2003 ;鮑瑟戈等人，2006 ;李等人，2009) —致，低氧和胰島素不影響HIF-1 α基因轉(zhuǎn)錄(參見補(bǔ)充材料)，表明L-4F對(duì)HIF-1 α蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)是在轉(zhuǎn)錄后水平上發(fā)生。
[0196]L-4F以ERK依賴性方式抑制S6激酶磷酸化。S6激酶的活化對(duì)胰島素誘導(dǎo)的HIF-1 α的從頭合成至關(guān)重要(西門扎，2003)。為測(cè)定L-4F抑制HIF-1 α的分子機(jī)制，測(cè)試L-4F是否影響胰島素刺激的HIF-1 α蛋白質(zhì)合成。數(shù)據(jù)顯示，10 μ g/ml的L-4F防止S6激酶的磷酸化(圖10A)。S6激酶磷酸化受上游信號(hào)傳導(dǎo)分子ERK和Akt的活化的調(diào)節(jié)。如圖1OB中所示，L-4F抑制ERK1/2的活化，但除了在0.5h以外，對(duì)Akt的磷酸化無(wú)影響，表明對(duì)S6激酶活化的抑制最有可能是壓制ERK磷酸化的結(jié)果。值得注意的是，在0V2008細(xì)胞中未觀察到CoCl2對(duì)ERK、Akt和S6激酶的磷酸化的效應(yīng)(參見補(bǔ)充材料)。此結(jié)果并不出人意料，因?yàn)镃oCl2處理模擬缺氧，此導(dǎo)致HIF-Ια蛋白質(zhì)降解降低(鮑瑟戈和麥克塔-格里格瑞，2006)。
[0197]L-4F處理促進(jìn)蛋白酶體依賴性蛋白質(zhì)降解。隨后檢查L(zhǎng)-4F是否改變HIF-1 α蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。使用防止新蛋白質(zhì)合成的化合物CHX來(lái)抑制HIF-Ια蛋白質(zhì)從頭合成。數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)CHX與胰島素的組合處理的0V2008細(xì)胞展現(xiàn)HIF-1 α隨時(shí)間逐漸減少，且同時(shí)L-4F處理加快HIF-1 α蛋白質(zhì)的降解(圖11Α)。觀察到L-4F對(duì)CoCl2處理的0V2008細(xì)胞具有類似效應(yīng)(參見補(bǔ)充材料)。此外，蛋白酶體抑制劑MG-132導(dǎo)致L-4F對(duì)胰島素介導(dǎo)的HIF-1 α表達(dá)的抑制性效應(yīng)逆轉(zhuǎn)(圖11Β)。這些結(jié)果表明，L-4F在卵巢癌細(xì)胞中部分通過(guò)加快HIF-1 α蛋白質(zhì)的降解來(lái)抑制胰島素-和CoCl2誘導(dǎo)的HIF-1 α表達(dá)和活性。
[0198]L-4F處理對(duì)胰島素-和CoCl2誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生的抑制。據(jù)報(bào)道，胰島素處理(周等人，2007 ;李等人，2009)和CoCl2處理(錢德勒(Chandel)等人，2000 ;格里蓋(Griguer)等人，2006)顯著提高細(xì)胞ROS水平，此隨后促進(jìn)HIF-1 α的合成并抑制其降解。如二氯熒光素氧化分析所示(圖12)，在0V2008細(xì)胞中胰島素和CoCl2處理提高細(xì)胞ROS水平。L-4F的預(yù)處理顯著防止胰島素和CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞ROS產(chǎn)生(圖12)，表明L-4F對(duì)HIF-1 α表達(dá)的抑制性作用可為抑制ROS積累的結(jié)果。
[0199]討論
[0200] HIF-1在缺氧下是關(guān)鍵細(xì)胞存活蛋白質(zhì)，且在多種實(shí)體瘤中與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)(西伯(Seeber)等人，2011)。靶向HIF-Ια可為有吸引力的抗癌治療策略(西門扎，2003 ;別羅澤洛夫(Belozerov)和范梅爾(Van Meir)，2005 ;西伯等人，2011)。缺氧和非缺氧刺激會(huì)增加HIF-1a的表達(dá)。低氧濃度或用缺氧模擬化合物CoCl2處理抑制HIF-1 α的降解并增加HIF-1 α蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和積累。一些生長(zhǎng)因子(包括胰島素和LPA)也促進(jìn)轉(zhuǎn)錄后蛋白質(zhì)合成并上調(diào)HIF-1 α的表達(dá)和活性(西門扎，2003 ;鮑瑟戈和麥克塔-格里格瑞，2006 ;鮑瑟戈等人，2006)。在本文中顯示:1)在小鼠腫瘤組織中，L-4F抑制HIF-1 α表達(dá)(圖7A) ；2)在人類卵巢癌細(xì)胞系中，L-4F和L-5F的預(yù)處理和后處理降低低氧-XOCl2-、胰島素-和LPA誘導(dǎo)的HIF-1 α的表達(dá)和核水平(圖7和9 ;還參見補(bǔ)充材料)；以及3) L-4F抑制CoCl2-和胰島素刺激的HRE驅(qū)動(dòng)的報(bào)道基因的表達(dá)以及HIF-1 α靶基因的活化(圖8和9;還參見補(bǔ)充材料)。實(shí)時(shí)奶-?0?分析指示，在(^2008細(xì)胞中，1^4?對(duì)!1正-10基因轉(zhuǎn)錄無(wú)影響(參見補(bǔ)充材料)，表明1^4?對(duì)!1正-1(1蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)是在轉(zhuǎn)錄后水平上發(fā)生。
[0201]有強(qiáng)有力的證據(jù)表明，在常氧以及缺氧下，ROS是調(diào)節(jié)HIF-1 α的關(guān)鍵參與者(鮑瑟戈和麥克塔-格里格瑞，2006)。如先前所報(bào)道，用低氧濃度(錢德勒等人，2000;古奇(Guzy)等人，2005 ;古奇和舒馬克(Schumacker)，2006)、CoCl2 (錢德勒等人，2000 ;格里蓋等人，2006)、胰島素(周等人，2007 ;李等人，2009)和LPA(陳(Chen)等人，1995;桑德斯(Saunders)等人，2010)處理細(xì)胞導(dǎo)致ROS生成。ROS產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞中的HIF-1 α表達(dá)至關(guān)重要，且移除ROS會(huì)損害由缺氧和胰島素誘導(dǎo)的HIF-Ια積累(布魯內(nèi)爾(Brunelle)等人,2005 ;曼斯費(fèi)爾德(Mansfield)等人,2005 ;卡爾內(nèi)塞基(Carnesecchi)等人,2006 ;比斯瓦斯(Biswas)等人,2007)。加納帕蒂等人(2012)報(bào)道，apoA_I模擬肽D-4F顯著降低超氧化物和H202的產(chǎn)生并改良ID8細(xì)胞上的氧化態(tài)。然而，尚未得知肽處理是否會(huì)影響缺氧-或生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。在本文中報(bào)道，L-4F處理在0V2008細(xì)胞中顯著抑制胰島素-和CoCl2誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生(圖12)。此外，在暴露于胰島素和CoCl2的癌細(xì)胞中，L-4F加快HIF-1 α降解(圖1lA ;還參見補(bǔ)充材料)。26S蛋白酶體抑制劑MG-132逆轉(zhuǎn)L-4F對(duì)胰島素介導(dǎo)的HIF-1 α表達(dá)的抑制性效應(yīng)(圖11Β)?？偟脕?lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)顯示，L-4F降低HIF-1 α的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性并至少部分通過(guò)其ROS-清除作用抑制轉(zhuǎn)錄活性HIF-1 α的積累。
[0202]在尋找HIF-1a抑制的分子機(jī)制的努力中，確定了 L_4F是否影響HIF_1 α蛋白質(zhì)的合成。胰島素活化受體酪氨酸激酶和下游信號(hào)傳導(dǎo)分子(最有名的是S6激酶)，從而導(dǎo)致增加HIF-1 α的mRNA翻譯和從頭合成(特萊茵(Treins)等人，2002 ;西門扎，2003)。L-4F在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)抑制胰島素刺激的S6激酶的磷酸化，從而導(dǎo)致降低HIF-1 α蛋白質(zhì)水平(圖10A)。其它實(shí)驗(yàn)顯示，S6激酶活性的下調(diào)可能是抑制ERK1/2而不是Akt的活化的結(jié)果(圖10B)。值得注意的是，據(jù)報(bào)道，ROS參與胰島素刺激的ERK1/2和S6激酶而不是Akt的磷酸化(周等人，2007)，指示ROS移除可能也參與L-4F對(duì)HIF-1 α的從頭合成的抑制。
[0203]先前報(bào)道顯示，在對(duì)照和糖尿病大鼠的主動(dòng)脈中，D-4F (apoA-1模擬肽與L-4F相同但全部用D氨基酸合成)增加兩種抗氧化酶血紅素氧化酶I和細(xì)胞外超氧化物歧化酶(SOD)的表達(dá)和活性(克魯格(Kruger)等人，2005)。最近還顯示，D-4F在ID8細(xì)胞中上調(diào)抗氧化酶Mn-SOD，且 Mn-SOD的敲除導(dǎo)致D-4F在小鼠卵巢癌模型中完全喪失抗腫瘤發(fā)生效應(yīng)(加納帕蒂等人，2012)。因?yàn)镾OD活性調(diào)節(jié)ROS產(chǎn)生和細(xì)胞氧化性應(yīng)激，SOD的誘導(dǎo)可為apoA-1模擬肽的作用機(jī)制的重要部分。
[0204]綜上所述，數(shù)據(jù)顯示，apoA-1模擬肽在活體內(nèi)和在細(xì)胞培養(yǎng)物中抑制HIF-1 α的表達(dá)和活性。對(duì)HIF-Ια的抑制可為apoA-1模擬肽的負(fù)責(zé)壓制腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵機(jī)制。
[0205]參考文獻(xiàn)
[0206]在整個(gè)實(shí)例4中提供的參考文獻(xiàn)的完整引用列表可參見高等人，2012，藥理學(xué)與實(shí)驗(yàn)治療學(xué)雜志342: 255-262。此文章的網(wǎng)上辦也含有實(shí)例4中提到的補(bǔ)充材料。
[0207]實(shí)例5:HDL模擬物在誘導(dǎo)型和自發(fā)型結(jié)腸癌小鼠模型二者中抑制腫瘤發(fā)展
[0208]此實(shí)例顯示，HDL模擬物L(fēng)-4F (載脂蛋白A-1模擬肽)和G* (載脂蛋白J模擬肽)在結(jié)腸癌小鼠模型中影響腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展。在BALB/c小鼠中，HDL模擬物在皮下或經(jīng)口投與時(shí)降低CT26細(xì)胞(小鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞系)的活力和增殖并減小CT26細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤負(fù)擔(dān)。溶血磷脂酸(LPA)(結(jié)腸癌的一種血清生物標(biāo)記)的血漿水平在接受HDL模擬物的小鼠中顯著降低，表明促炎性脂質(zhì)的結(jié)合與移除是HDL模擬物抑制腫瘤發(fā)展的潛在機(jī)制。此外，在APCmin/+小鼠(人類家族性腺瘤性息肉病的小鼠模型)中，L-4F顯著降低息肉的大小和數(shù)目，表明HDL模擬物有效抑制誘導(dǎo)型和自發(fā)型結(jié)腸癌二者的發(fā)展。這些結(jié)果將HDL模擬物鑒別為治療結(jié)腸癌的新穎治療策略。[0209]小鼠
[0210]洛杉磯加利福尼亞大學(xué)的動(dòng)物研究委員會(huì)批準(zhǔn)了所有小鼠方案。6周齡BALB/c雌性小鼠和6周齡C57BL/6J-APC min/+雄性小鼠購(gòu)自杰克遜實(shí)驗(yàn)室。
[0211]肽
[0212]HDL 模擬物 apoA-1 肽 L-4F (Ac-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-NH2 ； SEQID NO:12)和含有與 4F肽相同但以序列(Ac-D-W-F-A-K-D-Y-F-K-K-A-F-V-E-E-F-A-K-NH2 ；SEQ IDNO:13)排列以防止形成A類兩親性螺旋的氨基酸的亂序肽(sc_4F)以及名為G*肽的 apoj 模擬物(Ac-L-V-G-R-Q-L-E-E-F-LNH2 (SEQ ID NO:26)，對(duì)應(yīng)于 apoJ(L-[113_122]apoj)中的氨基酸113到122}是全部從L-氨基酸合成。將所述肽溶于H2O中以供注射投與。對(duì)于在飲食中投與肽，使用基本上如先前針對(duì)西方飲食所述的技術(shù)(18)將肽混合到標(biāo)準(zhǔn)鼠糧(羅爾斯頓普瑞納)中。然而，在本文所報(bào)告的任一實(shí)驗(yàn)中未投與西方飲食；小鼠僅接受含或不含肽的標(biāo)準(zhǔn)鼠糧。
[0213]細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
[0214]源自N-亞硝基-N-甲基氨基甲酸乙酯誘導(dǎo)的BALB/c來(lái)源的小鼠結(jié)腸癌的CT26細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。首先在96孔培養(yǎng)板中的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)CT26細(xì)胞(2，000個(gè)細(xì)胞/孔)，在24小時(shí)后將培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基。在過(guò)夜培育后，用媒劑(對(duì)照)處理細(xì)胞或用10mg/mL L-4F或G*肽處理。將肽溶于H2O中。將細(xì)胞再培育48小時(shí)并使用MTS分析試劑盒(普洛麥格)根據(jù)制造商的方案分析活力。對(duì)于增殖分析，在48小時(shí)培育的最后4小時(shí)中用溴脫氧尿苷(BrdUrd)標(biāo)記細(xì)胞。隨后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌，固定，并與小鼠抗BrdUrd抗體在室溫下一起培育I小時(shí)并通過(guò)過(guò)氧化物酶偶合的山羊抗小鼠二級(jí)抗體(卡爾生物化學(xué)) 進(jìn)行檢測(cè)。使用雙波長(zhǎng)450nm和540nm測(cè)量吸光度。
[0215]腫瘤負(fù)荷研究
[0216]向6周齡BALB/c雌性小鼠給予制備為PBS中的單細(xì)胞懸浮液的10mL皮下注射的I X 106CT26細(xì)胞，并用以10mg/kg每天皮下投與15天的sc_4F或L-4F處理小鼠。處死小鼠并測(cè)量腫瘤重量。
[0217]活體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移
[0218]通過(guò)尾靜脈注射向BALB/c小鼠靜脈內(nèi)注射10mL PBS中的2 X 104CT26細(xì)胞，并用以10mg/kg/d皮下投與3周的L-4F或sc-4F處理小鼠，或用以100mg/kg/d在鼠糧飲食中投與3周的sc-4F或L-4F或G*肽處理。在3周處理后，處死小鼠；采集肺，稱重并用布安溶液(西格瑪)固定。對(duì)肺表面上的腫瘤結(jié)節(jié)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0219]APC 小鼠研究
[0220]用以100mg/kg/d在鼠糧飲食中投與的L-4F或sc_4F處理基于C57BL/6J背景的6周齡APCmin/+雄性小鼠。在8周處理后，處死小鼠。立刻移除全腸，在福爾馬林和70%乙醇中固定。打開腸并在解剖顯微鏡下檢查以對(duì)腫瘤進(jìn)行計(jì)數(shù)和測(cè)量。
[0221]免疫組織化學(xué)染色
[0222]用石蠟固定并包埋肺表面的腫瘤組織，以5_厚度切片。用二甲苯將切片脫石蠟，用100 %、90 %、70 %和50 %乙醇再水合，用20mg/mL蛋白酶K處理30分鐘，并在室溫下用3% H2O2處理30分鐘以抑制內(nèi)源過(guò)氧化物酶，用在PBS中制備的10%正常山羊血清和4%牛血清白蛋白封閉3小時(shí)，然后與1: 50大鼠抗小鼠單克隆CD31抗體在4°C下一起培育過(guò)夜。將切片與相應(yīng)生物素化二級(jí)抗體一起培育I小時(shí)，之后與維克塔斯頓ABC精英試劑一
起培育。
[0223]細(xì)胞周期分析
[0224]將CT26細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)過(guò)夜，然后將其血清饑餓48小時(shí)。用媒劑(對(duì)照)處理細(xì)胞，或用10mg/mL L-4F或G*肽處理，且再培育48小時(shí)。收集細(xì)胞，用PBS洗滌，并用70%冰冷甲醇在4°C下固定過(guò)夜。通過(guò)離心收集經(jīng)固定細(xì)胞,用PBS洗滌，并將其再懸浮于0.3mL含有40mg/mL RNaseA和100mg/mL碘化丙啶的PBS中，并通過(guò)來(lái)自BD生物科學(xué)的FACScan實(shí)施流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期分析。
[0225]蛋白質(zhì)印跡分析
[0226]在于50mmol/L Tris 緩沖液(ρΗ7.5)中含有 0.lmol/L NaCl、5mmol/L EDTA,50mmol/L正釩酸鈉、I %曲拉通X-100和蛋白酶抑制劑片劑的細(xì)胞裂解緩沖液中處理后，收集總細(xì)胞蛋白質(zhì)。通過(guò)SDS-PAGE分離20微克總蛋白質(zhì)并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，之后與一級(jí)抗體在4°C下在5%脫脂乳和0.1%吐溫-20中一起培育。以1: 1，000稀釋度使用抗細(xì)胞周期蛋白Dl和抗細(xì)胞周期蛋白A兔多克隆抗體，且以1: 2，000稀釋度使用抗b-肌動(dòng)蛋白多克隆抗體。
[0227]ELISA 分析
[0228]通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA根據(jù)制造商的方案(英杰)測(cè)量血漿中的白介素(IL) _6濃度。
[0229]LPA結(jié)合親和性和血清LPA水平
[0230]LPA(20: 4)購(gòu)自阿凡提極性脂質(zhì)。如先前所述測(cè)定LPA水平(19)。
[0231]統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0232]數(shù)據(jù)顯示為每組的平均值土SD。通過(guò)不成對(duì)t測(cè)試來(lái)實(shí)施統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在P〈0.05下的所有結(jié)果都視為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著。
[0233]在BALB/c小鼠中注射CT26細(xì)胞后，HDL模擬物L(fēng)-4F抑制腫瘤發(fā)展
[0234]CT26是在靜脈內(nèi)引入免疫活性BALB/c小鼠中時(shí)產(chǎn)生轉(zhuǎn)移性肺腫瘤的結(jié)腸腺癌細(xì)胞系(20-22)。CT26細(xì)胞系已廣泛用作同源腫瘤模型用于在小鼠模型中研究癌癥的治療性應(yīng)用，且因此在HDL模擬研究中選擇CT26細(xì)胞進(jìn)行結(jié)腸癌研究。首先檢查以10mg/kg/d皮下投與3周的L-4F和sc-4F(亂序肽，其含有與4F肽中相同但以防止形成A類兩親性螺旋的序列排列的氨基酸)在通過(guò)尾靜脈注射2X 104CT26細(xì)胞的BALB/c小鼠中對(duì)肺腫瘤形成的效應(yīng)。經(jīng)L-4F處理的BALB/c小鼠(n= 11只/組)的肺重量(圖13A)和在肺表面上計(jì)數(shù)的腫瘤數(shù)(圖13B)與經(jīng)sc-4F處理的小鼠相比顯著降低(280mg對(duì)225mg，P〈0.01 ;33對(duì)18，P〈0.001)。2組的肺腫瘤的代表性照片顯示于圖13C中。隨后檢查L(zhǎng)-4F處理是否影響在BALB/c小鼠側(cè)腹中的腫瘤發(fā)展。向6周齡BALB/c雌性小鼠在側(cè)腹中皮下注射I X 106CT26細(xì)胞。在遠(yuǎn)離CT26細(xì)胞注射部位的位點(diǎn)用以10mg/kg每天皮下投與15天的sc_4F (η = 9)或L-4F (η = 8)處理小鼠。與經(jīng)L-4F處理的小鼠相比，在經(jīng)sc_4F處理的BALB/c小鼠中，側(cè)腹腫瘤重量顯著較大(778mg對(duì)389mg，P〈0.05 ;圖13D)。2組的側(cè)腹腫瘤的代表性照片顯示于圖13E中。還測(cè)量來(lái)自圖13A中所示實(shí)驗(yàn)的血漿中的IL-6水平。與對(duì)照組相比，在經(jīng)L-4F處理的小鼠中IL-6顯著降低(圖13F)。
[0235]在經(jīng)在鼠糧中投與的L-4F處理的小鼠中，在CT26細(xì)胞注射后的腫瘤發(fā)展顯著降低[0236]最近報(bào)道，不論是皮下投與或經(jīng)口投與，4F在動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)物模型中有效
(18)。為測(cè)定L-4F在經(jīng)口投與時(shí)是否可降低腫瘤發(fā)展，通過(guò)尾靜脈向BALB/c小鼠注射2 X 104CT26細(xì)胞，并用以100mg/kg/d在鼠糧飲食中投與3周的L-4F (ηI/4 = 9)或sc-4F (η=12)處理。與經(jīng)L-4F處理的小鼠相比，經(jīng)sc-4F處理的BALB/c小鼠中的肺重量(圖14A)和腫瘤數(shù)(圖14B)顯著較大(296mg對(duì)238mg, Ρ〈0.05 ；21對(duì)12，Ρ〈0.0001)。先前報(bào)道，L-4F在活體內(nèi)抑制血管生成(23)。來(lái)自此實(shí)驗(yàn)的腫瘤切片的免疫組織化學(xué)染色顯示，與對(duì)照小鼠相比，源自經(jīng)L-4F處理的小鼠的腫瘤中的⑶31表達(dá)顯著降低(圖14C)。此外，在接受L-4F肽的小鼠中，與其相應(yīng)對(duì)照小鼠相比，血漿LPA水平顯著降低，P〈0.01 (圖14D)。
[0237]在經(jīng)在鼠糧中投與的L-4F處理的C57BL/6J-Apc min/+小鼠中，腸道中的腫瘤數(shù)目和大小顯著降低
[0238]隨后檢查HDL模擬物是否可在結(jié)腸癌的自發(fā)模型中影響結(jié)腸腫瘤的發(fā)展。APCmin7+小鼠是已確立的結(jié)腸癌小鼠模型且反映人類家族性腺瘤性息肉病的發(fā)展(24、25)。用以100mg/kg/d在鼠糧中投與 8 周的 L-4F (η = 5)或 sc_4F (η = 6)處理 6 周齡 CSTBL/ej-Apc1^"7+雄性小鼠。與經(jīng)SC-4F處理的小鼠相比，來(lái)自經(jīng)L-4F處理的小鼠的腸道中的腫瘤數(shù)目和大小顯著降低(100%對(duì) 60%，Ρ〈0.05 ；l-3mm:56.5 對(duì) 36.8，P〈0.05 ；>3mm:12.8 對(duì) 5，Ρ〈0.05 ；圖15Α和15Β)。與對(duì)照小鼠相比，在接受L-4F肽的小鼠中，來(lái)自此實(shí)驗(yàn)的血漿LPA水平顯著降低，Ρ〈0.01(圖 15C)。
[0239]L-4F在活體外改變CT26細(xì)胞活力、增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)
[0240]為檢查HDL模 擬物L(fēng)-4F在小鼠中抑制CT26細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤發(fā)展的機(jī)制，在活體外測(cè)定L-4F對(duì)CT26細(xì)胞活力的效應(yīng)。在經(jīng)L-4F (10mg/mL)處理的CT26細(xì)胞中，在與對(duì)照相比時(shí)，細(xì)胞活力降低25%以上(P〈0.001)(圖16A)。此外，如通過(guò)BrdUrd納入所測(cè)量，L-4F顯著抑制CT26細(xì)胞的增殖(P〈0.001)(圖16B)。為研究L-4F是否通過(guò)改變細(xì)胞周期進(jìn)展來(lái)抑制細(xì)胞增殖，在CT26細(xì)胞中評(píng)價(jià)L-4F對(duì)細(xì)胞周期特征的效應(yīng)。細(xì)胞周期分析顯示，48小時(shí)的L-4F處理誘導(dǎo)G0/G1期的延長(zhǎng)和S期的中止(圖16C)。此外，蛋白質(zhì)印跡分析顯示，在經(jīng)L-4F處理的細(xì)胞中，細(xì)胞周期蛋白質(zhì)細(xì)胞周期蛋白Dl和細(xì)胞周期蛋白A的表達(dá)顯著較低(圖16D)。
[0241 ] HDL模擬物L(fēng)-4F抑制LPA誘導(dǎo)的CT26細(xì)胞的活力
[0242]已將LPA鑒別為人類腫瘤發(fā)展、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的重要介質(zhì)(26、27)。先前已顯示，在注射ID8細(xì)胞的小鼠中，apoAI模擬肽抑制LPA誘導(dǎo)的ID8細(xì)胞的活力并降低血清LPA水平
(17)。如所預(yù)期，L-4F結(jié)合LPA (17)，LPA (10-20mmol/L)顯著改良CT26細(xì)胞生長(zhǎng)，且L-4F在所測(cè)試所有劑量下都顯著降低LPA誘導(dǎo)的活力，P〈0.001(圖17A)。通過(guò)液相色譜_質(zhì)譜法測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)基中的LPA水平，且發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照培養(yǎng)基相比，L-4F處理顯著減少LPA16: O和18: O。LPA20: 4和18:1在細(xì)胞培養(yǎng)基中檢測(cè)不到(圖17B)。
[0243]HDL模擬物G*肽(L-[113-122] apoj)抑制CT26細(xì)胞生長(zhǎng)和CT26介導(dǎo)的腫瘤發(fā)展
[0244]使用G*(L-[113_122]apoJ)肽重復(fù)活體內(nèi)和活體外研究。在經(jīng)以100mg/kg/d在鼠糧中投與3周的G*肽處理的小鼠中，在CT26細(xì)胞注射后的肺腫瘤發(fā)展顯著降低(肺重量為296mg 對(duì) 250mg, Ρ〈0.05 ;腫瘤數(shù)為 21 對(duì) 10，Ρ〈0.0001 ;圖 18Α 和 18Β)。在經(jīng) G* 肽(1mg/mL)處理的CT26細(xì)胞中在與無(wú)處理相比時(shí)，細(xì)胞活力降低約40% (圖18C)。在圖18A和18B中所示的小鼠實(shí)驗(yàn)中，在接受G*肽的小鼠中，與其相應(yīng)對(duì)照小鼠相比，血漿LPA水平顯著降低，？〈0.05(圖180)。蛋白質(zhì)印跡顯示，與無(wú)處理相比，使用G*肽處理的細(xì)胞周期蛋白Dl和細(xì)胞周期蛋白A的表達(dá)較低(圖18E)。
[0245]討論
[0246]脂質(zhì)代謝與癌癥之間顯著相關(guān)，且早已認(rèn)為炎癥性氧化性應(yīng)激與癌癥的病理生理學(xué)有關(guān)(28-30)。脂質(zhì)氧化和所得氧化脂質(zhì)介導(dǎo)的炎癥似乎對(duì)于多種炎癥性疾病的病因?qū)W來(lái)說(shuō)很常見(31、32)，所述疾病涉及脂蛋白在若干種疾病(包括癌癥)的發(fā)展和進(jìn)展中的作用。已承認(rèn)HDL是先天免疫系統(tǒng)的組成部分。HDL是復(fù)合高分子，其功能清單包括抗氧化劑、抗炎癥和抗微生物活性。與LDL不同，HDL是蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的異質(zhì)性混合物，這決定了HDL的結(jié)構(gòu)和功能完整性。HDL的若干種蛋白質(zhì)/酶組份(包括磷脂轉(zhuǎn)移蛋白、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白和卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶)對(duì)其形成和成熟很重要，而其它蛋白質(zhì)/酶組份(例如載脂蛋白A-1 (apoA-1)、apoJ和對(duì)氧磷酶-1 (PONl))賦予HDL功能性(33)。在過(guò)去十年間，HDL模擬物已在多種炎癥性疾病的臨床前研究中顯示杰出的治療前景(34-40)。
[0247]最近顯示，在皮下或經(jīng)口投與時(shí)，2種apoA-1模擬肽L-4F和L-5F降低小鼠卵巢癌細(xì)胞(ID-8細(xì)胞)和順鉬抗性人類卵巢癌細(xì)胞的活力和增殖，并在C57BL/6J小鼠中減小ID-8細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤負(fù)擔(dān)(17)。另外顯示，apoA-1模擬肽通過(guò)以下方式抑制腫瘤發(fā)生:
(i)抑制血管生成(23)和(ii)誘導(dǎo)MnSOD的表達(dá)和活性(41)。由于血管生成和氧化還原路徑是許多癌癥的共同特征，所以檢查2種HDL模擬物apoA-1模擬肽L-4F和apoj模擬肽G*在結(jié)腸癌的發(fā)展和進(jìn)展中的效應(yīng)(42)。與假設(shè)一致，結(jié)果顯示，HDL模擬物抑制通過(guò)將CT26細(xì)胞注射到免疫活性BALB/c小鼠中生成的結(jié)腸癌的發(fā)展。此外，本文首次使用FAP的小鼠模型(APCmin/+)顯示，經(jīng)口投與HDL模擬物能壓制結(jié)腸癌在小鼠模型中的自發(fā)發(fā)展。
[0248]已使用4F肽進(jìn)行2組臨床試驗(yàn)。布魯頓(Bloedon)與同事(43)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)口投與4.3mg/kg和7.14mg/kg劑量的4F盡管血衆(zhòng)水平極低(8_16ng/mL),但仍顯著改良HDL抗炎癥性性質(zhì)。布魯頓與同事(43)還發(fā)現(xiàn),投與0.43mg/kg和1.43mg/kg劑量的肽無(wú)效。沃森(Watson)與同事(44)以血漿水平為目標(biāo)且在冠狀動(dòng)脈心臟病患者中將L-4F每天通過(guò)靜脈內(nèi)輸注投與7天或皮下投與28天。沃森與同事(44)使用0.43mg/kg劑量實(shí)現(xiàn)極高的血楽；水平，但未對(duì)HDL抗炎癥性質(zhì)產(chǎn)生任何改良。綜上所述，在人類中改良HDL功能所需的劑量可能遠(yuǎn)高于沃森與同事(44)使用的劑量，且至少與布魯頓與同事(43)使用的劑量一樣高。最近，納瓦卜(Navab)與同事(45)報(bào)道，所投與HDL模擬肽4F的劑量且不是所獲得的血漿水平?jīng)Q定效能，且不管使用哪種投與途徑，腸都可為所述肽的主要作用位點(diǎn)。結(jié)果顯示，在小鼠模型中，在大于布魯頓與同事(43)所使用劑量的劑量下，不論是經(jīng)口給予或皮下給予，HDL模擬物都有效?？紤]到在小鼠結(jié)腸癌模型中使用HDL模擬物的結(jié)果和納瓦卜與同事(45)的結(jié)果(指示劑量且不是血漿水平?jīng)Q定效能)，重要的是在任何未來(lái)臨床試驗(yàn)中測(cè)試本文使用的高劑量。
[0249]HDL模擬物的抗腫瘤發(fā)生活性的一股機(jī)制的一個(gè)下游靶似乎是血管生成，如通過(guò)經(jīng)處理腫瘤中的⑶31染色減少可見。LPA在炎癥、血管生成和癌癥中具有重要作用，且已成為有前景的治療靶(46)。此外，與先前發(fā)現(xiàn)(17、23)和當(dāng)前發(fā)現(xiàn)一致，促炎性/促血管生成脂質(zhì)(例如LPA)的結(jié)合和移除可為HDL模擬物的作用機(jī)制的主要部分。
[0250]綜上所述，結(jié)果顯示，HDL模擬物抑制誘導(dǎo)型和自發(fā)型結(jié)腸癌二者在小鼠中的發(fā)展。HDL模擬肽對(duì)促腫瘤發(fā)生脂質(zhì)的結(jié)合和移除可能改變腫瘤細(xì)胞的增殖能力以及與腫瘤相關(guān)的血管生成。在描繪這些HDL模擬物的特定作用機(jī)制時(shí)，鑒別靶脂質(zhì)是重要的后續(xù)步驟。
[0251]參考文獻(xiàn)
[0252]在整個(gè)實(shí)例5中提供的參考文獻(xiàn)的完整引用列表(使用括號(hào)中的數(shù)字來(lái)標(biāo)識(shí))可參見蘇(Su)等人，2012，分子癌癥治療(Mol.Cancer Ther.)11(6): 1311-1319。
[0253]實(shí)例6:其它HDL模擬物在結(jié)腸癌的小鼠模型中抑制腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展
[0254]此實(shí)例顯示，在活體外經(jīng)各種HDL模擬肽處理的CT26細(xì)胞在處理48小時(shí)內(nèi)展現(xiàn)與媒劑處理對(duì)照相比降低的細(xì)胞活力(根據(jù)上述MTS分析，圖19)。所分析HDL模擬物是 L-4F (SEQ ID NO:12)、L-4F2 (SEQ ID NO:14)、K4, 15_4F(SEQ ID NO:27)、K4, 15_4F2(SEQID NO:28)和新穎的 20 個(gè)氨基酸的肽(“20AA”)LRKLRKRLLR LVGRQLEEFL(SEQ ID NO:1)。K4, 15-4F(SEQ ID NO:27)和 K4, 15_4F2(SEQ ID NO:28)肽是基于納亞爾(Nayyar)等人，2012，脂質(zhì)研究雜志(J.Lipid Res) 53 (5):849-58中闡述的K14，15肽，其中在殘基4和15處賴氨酸經(jīng)精胺酸取代，且后者K4，15-4F2進(jìn)一步經(jīng)修飾以在位置11和17處引入取代丙氨酸的Aib。新穎的20個(gè)氨基酸的肽是從ApoE和G*肽形成以產(chǎn)生所述肽:LRKLRKRLLRLVGRQLEEFL(SEQ ID NO:1)。
[0255]另外，接受皮下側(cè)腹注射CT26細(xì)胞且隨后經(jīng)皮下HDL模擬肽處理的BALB/c小鼠顯示腫瘤重量和腫瘤體積顯著降低(圖20)。這些結(jié)果確認(rèn)，在癌癥治療中可使用多種HDL模擬物。
[0256]根據(jù)上文應(yīng)了解 ，盡管本文已出于闡釋性目的闡述了本發(fā)明的特定實(shí)施例，但在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可作出各種修改。因此，本發(fā)明不受除了所附權(quán)利要求書以外的任何限制。
【權(quán)利要求】
1.一種抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法，所述方法包含使腫瘤細(xì)胞與選自由以下組成的群組的高密度脂蛋白HDL相關(guān)分子接觸=HDL模擬肽(SEQ ID NO:1、3到9、12、14或26至Ij 28)、牛HDL和 ApoA-1。
2.一種治療或預(yù)防個(gè)體的癌癥的方法，所述方法包含向所述個(gè)體投與選自由以下組成的群組的HDL相關(guān)分子=HDL模擬肽(SEQ ID NO:1、3到9、12、14或26到28)、牛HDL和ApoA-1 ο
3.一種減少暴露于氧化性應(yīng)激的上皮細(xì)胞的死亡和/或氧化性應(yīng)激的方法，所述方法包含使所述上皮細(xì)胞與選自由以下組成的群組的HDL相關(guān)分子接觸:HDL模擬肽(SEQ IDNO:1、3 到 9,12,14 或 26 到 28)、牛 HDL 和 ApoA-1?
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述接觸是在暴露于氧化性應(yīng)激之前進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述接觸是在所述暴露于氧化性應(yīng)激之前至少12到24小時(shí)進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求3、4或5所述的方法，其中所述氧化性應(yīng)激包含暴露于紫外輻射。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述ApoA-1是全長(zhǎng)蛋白質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述ApoA-1是作為重組ApoA-1 投與。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述ApoA-1是以未修飾形式投與。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述HDL相關(guān)分子是作為口服補(bǔ)充劑投與。
11.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述HDL模擬肽選自由以下組成的群組:SEQ IDNO:1、3到9、12、14和26到28。
12.根據(jù)權(quán)利要求1到11中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述個(gè)體是哺乳動(dòng)物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述個(gè)體是人類。
14.一種用于治療癌癥的HDL相關(guān)分子，其中所述HDL相關(guān)分子選自由以下組成的群組:HDL 模擬肽(SEQ ID NO:1、3 到 9、12、14 或 26 到 28)、牛 HDL 和 ApoA-1。
15.一種肽，其是由SEQ ID NO:1中顯示的氨基酸序列或SEQ ID NO:3到9的一者中顯示的氨基酸序列組成。
【文檔編號(hào)】C07K7/00GK104039810SQ201280052367
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2012年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月29日
【發(fā)明者】羅賓·法里亞斯-艾斯納, 斯里尼瓦?！·雷迪 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)