專利名稱：慶大霉素的抗原模擬表位及其應(yīng)用的制作方法
慶大霉素的抗原模擬表位及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及慶大霉素抗原模擬表位及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
慶大霉素(Gentamicin，GM) 一種氨基糖苷類抗生素，具有耳毒性和腎毒性，可使感覺毛細(xì)胞發(fā)生退行性和永久性改變，損害前庭神經(jīng)功能和耳蝸神經(jīng)，此藥物主要經(jīng)腎排泄并在腎蓄積，損害近曲小管上皮細(xì)胞核腎小管上皮細(xì)胞。如果人們長(zhǎng)期食用GM超標(biāo)的動(dòng)物食品，會(huì)導(dǎo)致其在人體內(nèi)的蓄積，進(jìn)而對(duì)人體造成嚴(yán)重危害。
目前，篩查違法添加的慶大霉素的檢測(cè)方法包括薄層色譜和高效液相色譜等。薄層色譜法操作容易、耗時(shí)短、所需設(shè)備低廉，但難于定量，一般只作定性分析。高效液相色譜法靈敏、精確、可靠，但所需設(shè)備昂貴且運(yùn)行費(fèi)用高，很難在基層工作中大規(guī)模開展。免疫學(xué)檢測(cè)方法具有靈敏、特異、快速和廉價(jià)的特點(diǎn)，已廣泛運(yùn)用于食品和環(huán)境樣品的快速檢測(cè)。但是該方法必須使用GM標(biāo)準(zhǔn)品，不僅增加了檢測(cè)成本，而且對(duì)檢測(cè)人員及環(huán)境易造成危害，在一定程度上制約了免疫學(xué)方法的應(yīng)用和推廣。有鑒于此，人們開始采用抗獨(dú)特型抗體及抗原模擬表位技術(shù)來實(shí)現(xiàn)有害小分子物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的替代，并取得了一定的進(jìn)展。噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)的主要特點(diǎn)是可有效地篩選出與目標(biāo)靶體特異結(jié)合的噬菌體展示多肽，該技術(shù)在探索受體與配體之間相互作用結(jié)合位點(diǎn)、尋求高親和力生物活性的配體分子、探索未知蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)表位、新型疫苗的研制等方面應(yīng)用廣泛。
本發(fā)明通過用噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)，從肽庫(kù)中篩選出能與靶分子(抗慶大霉素單克隆抗體)特異性結(jié)合的多肽(抗原模擬表位)，該抗原模擬表 位具有與天然慶大霉素分子相似的免疫反應(yīng)特性，通過獲得的慶大霉素抗原模擬表位，以代替價(jià)格昂貴且毒性強(qiáng)的慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品，并作為競(jìng)爭(zhēng)抗原或固相包被抗原應(yīng)用于慶大霉素的免疫學(xué)檢測(cè)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以抗慶大霉素單克隆抗體為靶分子，將靶分子固相包被于酶標(biāo)板上，投入噬菌體隨機(jī)展示十二肽庫(kù)，進(jìn)行親和淘選，獲得了 I種慶大霉素的抗原模擬表位，其氨基酸序列如下慶大霉素抗原模擬表位從曬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)中篩選的慶大霉素抗原模擬表位(多肽)，其氨基酸序列為=WHWQffffLQTDAT。
本發(fā)明還涉及編碼上述抗原模擬表位氨基酸序列的核苷酸序列，優(yōu)選為TGG CAT TGG CAG TGG TGG TTG CAG ACG GAT GCG ACG。
上述抗原模擬表位(多肽)結(jié)構(gòu)中，上述模擬表位結(jié)構(gòu)中，大寫英文字母分別代表二十一種已知天然L-型氨基酸殘基或其D-型異構(gòu)體的一種，即W代表色氨酸殘基，H代表組氨酸殘基，L代表亮氨酸殘基，Q代表谷氨酰胺殘基，T代表蘇氨酸殘基，D代表天冬氨酸殘基，A代表丙氨酸殘基。
本發(fā)明提及的慶大霉素抗原模擬表位(多肽)可通過噬菌體擴(kuò)增、化學(xué)合成或基因工程重組表達(dá)的方式進(jìn)行大量制備。噬菌體擴(kuò)增是指將展示有慶大霉素抗原模擬表位(多肽)的噬菌體，通過生物擴(kuò)增的方式，大量繁殖生產(chǎn)展示有慶大霉素抗原模擬表位(多肽)的噬菌體粒子?；瘜W(xué)合成是指依據(jù)公布的模擬表位的氨基酸序列，通過化學(xué)合成多肽的方式進(jìn)行多肽合成?；蚬こ讨亟M表達(dá)的方式是指將編碼模擬表位的基因，通過克隆至表達(dá)載體，以多肽-融合蛋白的形式進(jìn)行慶大霉素抗原模擬表位的大量制備。
本發(fā)明還涉及所述慶大霉素抗原模擬表位在免疫學(xué)檢測(cè)分析中的應(yīng)用。免疫學(xué)檢測(cè)的類型包括酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)、膠體金免疫層析、免疫斑點(diǎn)雜交等基于抗原-抗體特異性反應(yīng)的免疫學(xué)分析檢測(cè)類型。
本發(fā)明慶大霉素抗原模擬表位(WHWQffffLQTDAT )在應(yīng)用時(shí)，可以把合成的模擬表位用于免疫學(xué)檢測(cè)分析，將通過噬菌體擴(kuò)增獲得的展示有慶大霉素抗原模擬表位(多肽)的噬菌體粒子直接用于分析檢測(cè)，當(dāng)然，也可以將慶大霉素抗原模擬表位從噬菌體上切下來代替慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品來進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)分析。
還涉及慶大霉素抗原模擬表位以固相抗原或競(jìng)爭(zhēng)抗原在免疫學(xué)檢測(cè)分析中的應(yīng)用。
還涉及慶大霉素抗原模擬表位作為固相抗原在膠體金免疫層析檢測(cè)分析中的應(yīng)用。
前述慶大霉素抗原模擬表位可以替換價(jià)格昂貴且毒性強(qiáng)的慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品，并作為競(jìng)爭(zhēng)抗原或固相包被抗原應(yīng)用于慶大霉素的免疫學(xué)檢測(cè)，該抗原模擬表位具有與天然慶大霉素分子相似的免疫反應(yīng)特性，效果非常好。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明慶大霉素抗原模擬表位可以替換價(jià)格昂貴且毒性強(qiáng)的慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品，并作為競(jìng)爭(zhēng)抗原或固相包被抗原應(yīng)用于慶大霉素的免疫學(xué)檢測(cè)，該抗原模擬表位具有與天然慶大霉素分子相似的免疫反應(yīng)特性，效果非常好。減少了慶大霉素對(duì)人體健康的危害，節(jié)約了成本，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。


圖1.以慶大霉素抗原模擬表位建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性檢測(cè)范圍為(2. 2-44 ) ng/mL, IC50 為 9. 8 ng/mL。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1.慶大霉素抗原模擬表位的親和淘選及其鑒定I)慶大霉素抗原模擬表位的親和淘選具體方法為用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗慶大霉素單克隆抗體，并以終濃度100 μ g/mL包被96孔酶標(biāo)板，4°C孵育過夜。第二天用 TBST (50 mM NaCl, pH 7. 5 包含 O. 1% Tween-20 (v/v))洗滌 10 次后，加入 300 μ I 封閉液(3% BSA-PBS)4°C孵育2小時(shí)。2小時(shí)后棄封閉液，用TBST洗滌5次，每孔加入100 μ I噬菌體肽庫(kù)(噬菌體展示環(huán)七肽庫(kù)或十二肽庫(kù)，購(gòu)自NEB公司，用TBS 10倍稀釋噬菌體原液，約1. OXlO11 pfu)，22-26°C振蕩反應(yīng)I小時(shí)。棄去未結(jié)合的噬菌體，用TBST洗滌10 次，結(jié)合上的噬菌體用O. 2 M Glycine-HCl (p H 2.2)洗脫，并立即用15 μ I I M Tris-HCl (pH 9.1)中和。取10 μ I洗脫噬菌體測(cè)滴度，其余的用于感染20 mL生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)前期的 Ε. coli ER2738菌株進(jìn)行擴(kuò)增。第三天用PEG/NaCl沉淀純化噬菌體，并測(cè)定擴(kuò)增后噬菌體的滴度。
在第二、第三輪的淘選過程中,包被的抗慶大霉素單克隆抗體濃度分別為75 μ g/ mL和50 μ g/mL,所用的TBST濃度為O. 25%和O. 5%，其余步驟同上。
2)陽性噬菌體克隆的鑒定從第三輪淘選后測(cè)定噬菌體滴度的平板中隨機(jī)挑取20個(gè)曬菌體斑,進(jìn)行曬菌體的擴(kuò)增,采用間接酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法(Indirect Enzyme Linked immunoasorbent assay,1-ELISA)進(jìn)行陽性卩遼菌體克隆的鑒定,具體方法為首先，用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗慶大霉素單克隆抗體，10 Pg/mL包被96孔酶標(biāo)板，4°C孵育過夜。第二天用PBST (10 mM PBS, O. 05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的PBS進(jìn)行封閉，37°C孵育I小時(shí)；投入100 μ 噬菌體斑擴(kuò)增液(1. O X IO11 pfu)，以原始噬菌體肽庫(kù)作為陰性對(duì)照，37 °C孵育I小時(shí)；加入1:5000倍稀釋的HRP標(biāo)記抗M13噬菌體二抗100 μ1，37 °C孵育I小時(shí)；加入ΙΟΟμΙ TMB底物液，避光顯色5min，酶標(biāo)儀(Thermo Scientific Multiskan FC)讀取450 nm處的吸收值。選取OD45c!大于陰性對(duì)照2倍的卩遼菌體克隆為陽性克隆。
3)慶大霉素抗原模擬表位的鑒定采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的方法進(jìn)行慶大霉素抗原模擬表位的鑒定，具體方法為用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗慶大霉素單克隆抗體，10 Kg/mL 包被酶標(biāo)板，4°C 孵育過夜；第二天用 PBST (10 mM PBS, 0. 05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的PBS進(jìn)行封閉，37°C孵育I小時(shí)；投入50 μ 經(jīng)間接ELISA 鑒定為陽性的噬菌體克隆(1.OXlO11 pfu)和50 μ 慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品(濃度范圍為0_20 ng/ ml)，37°C孵育I小時(shí)；加入1:5000稀釋HRP標(biāo)記的抗M13噬菌體二抗100 μ1，37 孵育I 小時(shí)；加入ΙΟΟμΙ TMB底物液，避光顯色5min，讀取OD45tl,能結(jié)合抗慶大霉素單克隆抗體，且能被慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品所阻斷的噬菌體，鑒定為慶大霉素的抗原模擬表位。。
實(shí)施例2.慶大霉素抗原模擬表位編碼基因的測(cè)序及其氨基酸序列的確定將經(jīng)過間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA鑒定展示有慶大霉素抗原模擬表位的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，提取噬菌體的DNA測(cè)序模板。簡(jiǎn)要過程如下進(jìn)行噬菌體擴(kuò)增,在第一步離心后,將800 μ 含噬菌體上清轉(zhuǎn)入一新離心管。加入200 μ PEG/NaCl沉淀噬菌體。離心后將沉淀重懸于100 μ 碘化物緩沖液(10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，I mM EDTA, 4 M NaI)，加入250 μ 無水乙醇沉淀DNA，離心后再用70%乙醇洗滌沉淀(DNA測(cè)序模板)。沉淀最終重懸于20 μ 滅菌水， 取2 μ 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析；取5 PL噬菌體模板進(jìn)行DNA測(cè)序，其-96 gill測(cè)序引物為5’ -hoCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’。依據(jù)DNA測(cè)序結(jié)果及密碼子表可獲得慶大霉素抗原模擬表位的氨基酸序列=WHWQffffLQTDAT。
實(shí)施例3.慶大霉素抗原模擬表位作為競(jìng)爭(zhēng)抗原在ELISA中的應(yīng)用 (I)樣品提取稱取5g樣品(谷物及其相關(guān)食品)，加入25毫升60 %的甲醇-PBS溶液，200 rpm振蕩5分鐘；將提取液用whatman I號(hào)濾紙進(jìn)行過濾后，取I毫升濾液加入4毫升PBS (磷酸鹽緩沖液，pH=7. 2)混勻后，即為樣品提取 液，待用。
(2)包被及封 閉用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗慶大霉素單克隆抗體，10 Pg/mL包被酶標(biāo)板，4°C孵育過夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0. 05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的PBS進(jìn)行封閉，37 °C孵育I小時(shí)后，用PBST洗板6次待用。( 3 )標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
取出經(jīng)步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 μ 展示有慶大霉素抗原模擬表位的噬菌體(1. OXlO11 pfu)和一系列不同濃度的50 μ 慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品，37°C孵育I小時(shí)。加入1:5000稀釋HRP標(biāo)記的抗M13噬菌體二抗，37°C孵育I小時(shí)。然后用TMB底物顯色，讀取0D·。以慶大霉素濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，結(jié)合率(加入慶大霉素的孔的OD450/未加入慶大霉素的孔的OD45tlX 100%)為縱坐標(biāo)，建立間接競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。(4)樣品的檢測(cè)
取出經(jīng)步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 μ 展示有慶大霉素抗原模擬表位的噬菌體(1. O X IO11 pfu)和待測(cè)樣品提取液，37°C孵育I小時(shí)。加入1:5000稀釋HRP標(biāo)記的抗M13噬菌體二抗，37°C孵育I小時(shí)。然后用TMB底物顯色，讀取0D·，計(jì)算結(jié)合率，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，倒推出樣品中慶大霉素的含量。實(shí)施例4.慶大霉素抗原模擬表位作為固相抗原在ELISA中的應(yīng)用(I)樣品提取
稱取5g樣品(谷物及其相關(guān)食品)，加入25毫升60 %的甲醇-PBS溶液，200 rpm振蕩5分鐘；將提取液用whatman I號(hào)濾紙進(jìn)行過濾后，取I毫升濾液加入4毫升PBS (磷酸鹽緩沖液，pH=7. 2)
混勻后，即為樣品提取液，待用。(2)包被及封閉
用10 mM PBS (pH 7.4)稀 釋展示有慶大霉素抗原模擬表位的噬菌體(2. OX IO11pfu)，100微升包被于酶標(biāo)板，4°C孵育過夜。第二天用PBST (10 mM PBS, O. 05% Tween-20(v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的PBS進(jìn)行封閉，37 °C孵育I小時(shí)后，用PBST洗板6次待用。(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
取出經(jīng)步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 μ 抗慶大霉素單克隆抗體(O. 5 ng/ml)和一系列不同濃度的50 μ 慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品，37°C孵育I小時(shí)。加入1:2000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗，37°C孵育I小時(shí)。然后用TMB底物顯色，讀取0D45(I。以慶大霉素濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，結(jié)合率(加入慶大霉素的孔的OD450/未加入慶大霉素的孔的OD45tlX 100%)為縱坐標(biāo)，建立間接競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。(4)樣品的檢測(cè)
取出經(jīng)步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 μ 抗慶大霉素單克隆抗體(O. 5 ng/ml)和一系列不同濃度的50 μ 慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品，37°C孵育I小時(shí)。加入1:2000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗，37°C孵育I小時(shí)。然后用TMB底物顯色，讀取0D45(I。以慶大霉素濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，結(jié)合率(加入慶大霉素的孔的OD450/未加入慶大霉素的孔的OD45tlX 100%)為縱坐標(biāo)，建立間接競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線
實(shí)施例5.慶大霉素抗原模擬表位作為固相抗原在膠體金免疫層析分析中的應(yīng)用(I)樣品提取
稱取5g樣品(谷物及其相關(guān)食品)，加入25毫升60 %的甲醇-PBS溶液，200 rpm振蕩5分鐘；將提取液用whatman I號(hào)濾紙進(jìn)行過濾后，取I毫升濾液加入4毫升PBS (磷酸鹽緩沖液，pH=7. 2)
混勻后，即為樣品提取液，待用。(2)噬菌體及控制線的點(diǎn)陣
用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋展示有慶大霉素抗原模擬表位的噬菌體(2. OX IO11pfu)，用點(diǎn)陣儀或微量移液器將噬菌體劃線于硝酸纖維素膜上(孔徑O. 2-0. 45微米)，作為檢測(cè)線；將0. 5 mg/ml的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗，用點(diǎn)陣儀或微量移液劃線于同一張硝酸纖維素膜上(位于檢測(cè)線的上方，距離大于5毫米)，作為控制線。( 3 )膠體金標(biāo)記慶大霉素抗體
將慶大霉素抗體逐滴加入膠體金溶液(pH=8. 2)中，邊滴邊攪拌，30分鐘后，取1% PEG加入上述溶液中，繼續(xù)攪拌15分鐘后加入十分之一體積的10% BSA溶液，攪拌15分鐘后，靜置30分鐘，離心后去上清，得到膠體金標(biāo)記的慶大霉素抗體溶液。(4)膠體金檢測(cè)卡的組裝
將膠體金標(biāo)記的慶大霉素抗體點(diǎn)噴于膠金墊上(1.O微克/毫升)，將樣品墊、膠金墊，點(diǎn)陣了檢測(cè)線和控制線的硝酸纖維素膜和吸收紙進(jìn)行組裝，切成試紙條，裝入檢測(cè)卡中待用。 (5)樣品的檢測(cè)
將樣品提取液加入樣品墊中，靜置10分鐘，若樣品中含有慶大霉素且超過膠體金檢測(cè)試紙的檢測(cè)閾值，則檢測(cè)線區(qū)域不顯色，而控制線區(qū)域顯色；若樣品中不含有慶大霉素且低于膠體金檢測(cè)試紙的檢測(cè)閾值，則檢測(cè)線區(qū)域顯色，控制線區(qū)域也顯色。若控制線區(qū)域不顯色，表明試紙條失效。實(shí)施例5慶大霉素抗原模擬表位的大量制備
(I)以曬菌體擴(kuò)增的方式
將展示有慶大霉素抗原模擬表位的噬菌體加入至20 ml接種有ER 2738的培養(yǎng)物中，37度220 rpm振蕩培養(yǎng)4. 5 h。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入另一離心管中，4 V 10000 rpm離心10 min，將上清的上部80 %轉(zhuǎn)入一新鮮管中，加入1/6體積的PEG/NaCl，4 °C下靜置120 min。4°C10000 rpm離心PEG/NaCL靜置溶液15 min。棄上清，短暫離心后吸去殘留上清液。加入ImL TBS進(jìn)行重懸，即為噬菌體擴(kuò)增液。(2)以慶大霉素抗原模擬表位-融合蛋白的方式進(jìn)行制備
A.PCR擴(kuò)增慶大霉素抗原模擬表位的外源編碼基因
PCR反應(yīng)體系(50 μ
10 X Pyrobest Buffer (Mg2+ plus)5 M-L
dNTP Mixture (each for 2. 5 mM)4 M-L
M13KE insert extension primer (10 mM)I M-L
-96 gill sequencing primer (10 mM)I M-L
噬菌體DNA模板I μ
Pyrobest DNA Polymerase0. 5 M-L
滅菌 ddH2037. 5 μ PCR反應(yīng)條件
95 0C5 min接著 95 30 sec, 55°C 30 sec, 72°C 40sec，72°C 10 min 共 30 cycles采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，微量核酸定量?jī)x定量。慶大霉素抗原模擬表位的編碼基因序列為 TGG CAT TGG CAG TGG TGG TTG CAG ACG GAT GCG ACG。B.外源編碼基因及表達(dá)載體的雙酶切
分別采用ACC65I和Eag I酶對(duì)外源編碼基因和表達(dá)載體(pMAl-pIII，NEB公司，可表達(dá)MBP融合蛋白)進(jìn)行雙酶切。C.酶切后產(chǎn)物的連接及轉(zhuǎn)化
將質(zhì)粒pMal-ΡΙΙΙ和目的片段以1: 10(摩爾比)混勻，于16 °C水浴連接12 h,取
10μ L連接產(chǎn)物加至100 μ L感受態(tài)細(xì)胞TBl中，充分混勻。冰浴30 min后，42 V水浴熱激90 S，立即冰浴5 min后補(bǔ)加600 μ L LB液體培養(yǎng)液，37 °C, 200 rpm培養(yǎng)I h，10000rpm離心2 min,吸去上清留取約200 μ L,涂布于LB-A固體(Ampr)培養(yǎng)基中，37 °C過夜培養(yǎng)，得到陽性克隆。慶大霉素抗原模擬表位-MBP融合蛋白的表達(dá)
將上述獲得的陽性克隆子，從平板上挑一單菌落接種于5 mL LB-A，0. 2%蔗糖中，37°C，220 r/min，振蕩培養(yǎng)過夜，將過夜培養(yǎng)物按I %接種量(v/v)接種于50 mL的LB_A，0. 2 %蔗糖培養(yǎng)基中，分別接種3瓶，37 °C，220 r/min振蕩培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)物細(xì)菌濃度0D600達(dá)到O. 6時(shí)，向三瓶培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為O. 2 mmol/L,220 r/min振蕩培養(yǎng)，將誘導(dǎo)物(PEG溶液)于4 0C, 4000 g，離心20 min收集菌體沉淀，棄上清。重懸細(xì)胞于400 mL 30mM Tris-HCl，20%蔗糖，pH 8.0 (80 mL/g細(xì)胞濕重)，加入EDTA至I mM，室溫下震蕩5-10min,8000 g,4°C,離心20 min,棄上清,沉淀重懸于400 ml預(yù)冷的5 mM MgS04,冰上震蕩10min,8000 g,4°C,離心20 min ,保留上清，向上清液中加入8 mL I M Tris-HCl, pH 7. 4,獲得慶大霉素抗原模擬表位-MBP融合蛋白。SEQUENCE LISTING
<110>南昌大學(xué)
〈120〉慶大霉素的抗原模擬表位及其應(yīng)用
〈130〉I
〈160〉2
<170>PatentIn version 3.3
〈210〉I
〈211〉12
〈212〉PRT〈213〉人工序列
〈400〉I
Trp His Trp Gln Trp Trp Leu Gln Thr Asp Ala ThrI510
〈210〉2
〈211〉36
``〈212〉DNA〈213〉人工序列
〈400〉 2
tggcattggc agtggtggtt gcagacggat gcgacg3權(quán)利要求
1.慶大霉素的抗原模擬表位，其特征在于氨基酸序列為WHWQWWLQTDAT。
2.編碼權(quán)利要求1所述抗原模擬表位氨基酸序列的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，為TGGCAT TGG CAG TGG TGG TTG CAG ACG GATGCG ACG。
4.如權(quán)利要求1所述抗原模擬表位的制備方法，其特征在于通過噬菌體擴(kuò)增、化學(xué)合成或基因工程重組表達(dá)的方式進(jìn)行大量制備；所述噬菌體擴(kuò)增是指將展示有慶大霉素抗原模擬表位的噬菌體，通過生物擴(kuò)增的方式，大量繁殖生產(chǎn)展示有慶大霉素抗原模擬表位的噬菌體粒子；所述化學(xué)合成指依據(jù)模擬表位模擬表位氨基酸序列，通過化學(xué)合成多肽的方式進(jìn)行多肽合成；所述基因工程重組表達(dá)的方式是指將編碼模擬表位的基因，通過克隆至表達(dá)載體，以多肽-融合蛋白的形式進(jìn)行慶大霉素抗原模擬表位的大量制備。
5.權(quán)利要求1所述抗原模擬表位在免疫學(xué)檢測(cè)分析中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于慶大霉素抗原模擬表位以固相抗原或競(jìng)爭(zhēng)抗原在免疫學(xué)檢測(cè)分析中的應(yīng)用。
7.如如權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于慶大霉素抗原模擬表位作為固相抗原在膠體金免疫層析檢測(cè)分析中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及慶大霉素的抗原模擬表位，其氨基酸序列為WHWQWWLQTDAT。本發(fā)明慶大霉素抗原模擬表位可以替換價(jià)格昂貴且毒性強(qiáng)的慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品，并作為競(jìng)爭(zhēng)抗原或固相包被抗原應(yīng)用于慶大霉素的免疫學(xué)檢測(cè)，該抗原模擬表位具有與天然慶大霉素分子相似的免疫反應(yīng)特性，效果非常好。減少了慶大霉素，對(duì)人體健康的危害，節(jié)約了成本，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C07K7/08GK103044527SQ201210561218
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月21日
發(fā)明者何慶華, 許楊 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)