專(zhuān)利名稱(chēng)：一種布魯氏菌bp26蛋白表位及其單克隆抗體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種布魯氏菌蛋白表位，以及使用該表位刺激得到的抗布魯氏菌蛋白單克隆抗體。本發(fā)明還涉及該細(xì)胞表位抗體及該細(xì)胞表位的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
布魯氏菌病(Brucellosis)是目前世界上流行最廣的人畜共患傳染病之一，近十幾年來(lái)，該病的發(fā)生和流行在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)表明，全世界每年出現(xiàn)50萬(wàn)例人布魯氏菌病，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)30億美元，我國(guó)布病的流行以羊種布氏桿菌為主的混合感染，羊種占流行株的80%。布魯氏菌病目前缺乏特異有效的治療手段，大劑量抗菌素即使長(zhǎng)期治療收效仍有限，尤其難以克服菌株耐藥問(wèn)題，疫苗接種和清除感染宿主是防控的主要手段。布魯氏菌病的免疫制劑種類(lèi)繁多，主要包括弱毒活疫苗、死疫苗、亞單位疫苗、抗獨(dú)特性疫苗和DNA
疫苗等。由于熱滅活菌缺乏活性抗原刺激，不能在體內(nèi)誘發(fā)可檢測(cè)的IL-12，并且抑制 IL-12的產(chǎn)生，免疫效果不佳，而且死菌誘發(fā)的多是無(wú)保護(hù)力的體液免疫應(yīng)答。而亞單位疫苗雖然可起到短期的保護(hù)作用，但并不能誘發(fā)有效的長(zhǎng)期免疫，只有活菌才能誘發(fā)細(xì)胞免疫。我國(guó)主要是以布魯氏菌弱毒菌苗株M5-90來(lái)免疫羊。它對(duì)成年羊有很好的免疫保護(hù)效果，但會(huì)導(dǎo)致妊娠羊流產(chǎn)。蛋白與弱毒菌苗株毒力相關(guān)，并含有保護(hù)性抗原表位， 若將M5-90疫苗株攜帶的基因全部敲除，則影響弱毒菌苗株的免疫效果。另外，由于 M5-90免疫的動(dòng)物和野毒菌株自然感染的動(dòng)物現(xiàn)有診斷方法不能鑒別，嚴(yán)重影響了布魯氏菌病的檢驗(yàn)和疫苗免疫預(yù)防。因此，針對(duì)蛋白的抗原表位進(jìn)行修飾或改造標(biāo)記疫苗， 可建立該表位多肽ELISA診斷方法及其診斷試劑，進(jìn)而解決布魯氏菌病鑒別診斷和基因工程標(biāo)記弱毒菌苗株的技術(shù)難題。關(guān)于bp^蛋白的表位研究，Patricia Seco-Mediavilla等人構(gòu)建了系列的截短多肽的表達(dá)質(zhì)粒，并表達(dá)純化融合蛋白對(duì)抗單克隆抗體進(jìn)行表位篩選，但是篩選出來(lái)的抗原表位段并不明確。(參見(jiàn)Epitope Mapping of the Brucella melitensis bp26 Immunogenic Protein: Usefulness for Diagnosis of Sheep Brucellosis , Seco-Mediavilla, Verger et al. Clin. Vaccine. Immunol. 2003, 10(4):647)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種布魯氏菌蛋白表位。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述蛋白表位在制備診斷、預(yù)防或治療布魯氏菌病診斷試劑或藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供由上述表位刺激產(chǎn)生的單克隆抗體。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供上述單克隆抗體在制備診斷、預(yù)防或治療布魯氏菌病診斷試劑或藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是
布魯氏菌bp^蛋白表位，其序列為QPIYVYPD ( SEQ ID NO :1)。抗布魯氏菌蛋白的單克隆抗體，其制備方法為
1)將上述的布魯氏菌bp^蛋白表位免疫動(dòng)物；
2)取經(jīng)免疫的動(dòng)物脾細(xì)胞與瘤細(xì)胞融合，得到可穩(wěn)定分泌抗布魯氏菌蛋白的雜交瘤細(xì)胞；
3)收集、純化雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體，即為抗布魯氏菌蛋白的單克隆抗體。優(yōu)選的，產(chǎn)生免疫反應(yīng)的動(dòng)物的血清間接ELISA效價(jià)不低于1 :51200。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明的布魯氏菌蛋白表位，為bp 蛋白的核心表位，疫苗株中該段序列突變后獲得的突變蛋白在免疫羊之后，無(wú)法誘導(dǎo)產(chǎn)生抗該表位的抗體，從而達(dá)到自然感染與疫苗接種免疫的鑒別診斷。本發(fā)明的布魯氏菌bp^蛋白表位，偶聯(lián)之后可用于檢測(cè)羊血清中的布魯氏菌病， 建立P^tide-ELISA檢測(cè)方法，為新型分子標(biāo)記疫苗的研制提供依據(jù)。本發(fā)明的單克隆抗體，對(duì)bp 蛋白具有很好的特異性識(shí)別能力，可以精確地識(shí)別布魯氏菌的表位。本發(fā)明的單克隆抗體及bp 蛋白表位用于布魯氏菌病的診斷，可以很好地鑒別出動(dòng)物是自然感染布病的還是接種免疫的。


圖1是重組蛋白bp^表達(dá)與純化電泳鑒定圖；M :marker ；1 誘導(dǎo)前全菌；2 誘導(dǎo)后全菌；3 超聲后上清；4 超聲后沉淀；5 包涵體洗滌并復(fù)性濃縮
圖2是Wiestern-Blot試驗(yàn)檢測(cè)單克隆抗體bp^_2A4與布魯氏菌疫苗株M5-90中提取的天然膜蛋白的反應(yīng)性結(jié)果。圖3和4是肽矩陣設(shè)計(jì)初步篩選bp^_2A4抗原表位。圖5是競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA測(cè)定單克隆抗體株bp^_2A4抗原表位。圖6是抗原表位多肽及突變肽與單克隆抗體bp^_2A4反應(yīng)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明使用的布魯氏菌M5-90疫苗株購(gòu)自蘭州獸醫(yī)研究所，為本行業(yè)所公知的疫苗株。布魯氏菌重組膜蛋白bp^的制備
將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pETj8a-bp26(新疆石河子大學(xué)陳創(chuàng)夫教授惠贈(zèng))轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21。 將重組菌搖至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，以終濃度ImM IPTG加入誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)后超聲破碎，經(jīng)鑒定目的蛋白主要處于沉淀中。將包涵體以5M尿素濃度的包涵體洗滌液(1 XPBS，5M 脲，1% TritonX-100, lmmol/L EDTA, pH8. 0)洗滌后，目的蛋白純度達(dá)85%以上。將洗滌后的沉淀用6M鹽酸胍(1 XPBS，6M鹽酸胍，pH8. 0)溶解后進(jìn)行梯度透析復(fù)性，復(fù)性后將蛋白濃縮并測(cè)定蛋白濃度(見(jiàn)附圖1，圖中，M :marker ；1 誘導(dǎo)前全菌；2 誘導(dǎo)后全菌；3 超聲后上清；4 超聲后沉淀；5 包涵體洗滌并復(fù)性濃縮)。當(dāng)然，也可以使用其他方法制備得到的布魯氏菌重組膜蛋白bp26，或直接購(gòu)買(mǎi)純化的布魯氏菌重組膜蛋白bp^L制備重組膜蛋白bp^的單克隆抗體 1.小鼠免疫
1)選擇6周齡的純系雌性BALB/c小鼠，用純化的重組bp^蛋白作為免疫抗原免疫小鼠，將蛋白與等體積的弗氏完全佐劑(CFA)乳化后，背部或腹腔皮下多點(diǎn)注射；
2)初次免疫后2周將純化的與等體積的弗氏不完全佐劑(IFA)乳化后，背部或腹腔皮下多點(diǎn)注射；
3)2周后，小鼠尾部取血，離心獲得血清將血清倍比稀釋采用間接-ELISA方法測(cè)效價(jià)，效價(jià)需不低于1 :51200 ；
4)融合前三天，腹腔注射bp^蛋白；
三次免疫抗原的量分別為100 μ g/鼠、50 μ g/鼠、50 μ g/鼠。2.細(xì)胞融合
斷頸處死上述免疫好的BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞按 5:1在50% PEG4000融合劑下融合，融合后以HAT選擇培養(yǎng)基鋪板置于37°C 5%C02培養(yǎng)。3.陽(yáng)性克隆篩選及克隆
利用純化的重組蛋白以間接ELISA方法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，將陽(yáng)性孔擴(kuò)大培養(yǎng)后，用有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞克隆，經(jīng)過(guò)三次克隆獲得1株能穩(wěn)定傳代并分泌抗蛋白的特異性單克隆抗體細(xì)胞株bp^-2A4。單克隆抗體的鑒定
1.單克隆抗體的亞類(lèi)鑒定
參照Hycult Biotechnol公司鼠源抗體分型試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)雜交瘤細(xì)胞bp^_2A4進(jìn)行鑒定，經(jīng)鑒定bp^-2A4重鏈為IgGl，輕鏈為κ鏈。2. Western-Blot 鑒定
按Bio-rad膜蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取布魯氏菌M5-90疫苗株膜蛋白，提取后膜蛋白按1:1加入2X SDS上樣緩沖液，沸水浴中煮5min，12000rpm離心lmin，取上清10 μ 1進(jìn)行分離膠12%，濃縮膠5%的SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，PVDF膜以含5%脫脂奶粉TBST封閉池，隨后以各株單抗的細(xì)胞上清1:3稀釋孵育lh，TBST洗膜三次，每次 IOmin ；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG & IgM作為二抗孵育lh，TBST洗膜后發(fā)光顯影。 試驗(yàn)中以HCV NS3的一株單抗作為陰性對(duì)照。試驗(yàn)結(jié)果顯示bp^5-2A4與天然膜蛋白在約為^KDa處有一明顯條帶，而陰性對(duì)照HCV NS3的單抗不與膜蛋白反應(yīng)(圖2)。
肽矩陣設(shè)計(jì)初步篩選bp^_2A4抗原表位
根據(jù)pETj8a-bp^測(cè)序結(jié)果(見(jiàn)SEQ ID NO :4及SEQ ID NO :5所示的序列)，設(shè)計(jì)并合成了觀條重疊肽，長(zhǎng)度10 16個(gè)氨基酸，每?jī)蓷l多肽之間重疊7個(gè)氨基酸(包括所有 <8個(gè)氨基酸殘基的表位)(表1)。將多肽分為11個(gè)肽池(見(jiàn)表2)，肽池中每條多肽終濃度5 μ g/ml,每孔100 μ 1包被過(guò)夜；洗滌液PBST洗滌4次后，以PBS+4%BSA，每孔200 μ 137°C封閉一小時(shí)；洗滌液洗滌4次后，以50 μ 1各單克隆抗體株細(xì)胞上清+50 μ 1抗體稀釋液(PBST+1%BSA)為一抗37°C孵育45min ；洗滌液洗滌6次后，1:10000抗體稀釋液稀釋的 HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG+IgM為二抗，每孔100μ 1，37°C孵育30min ；洗滌液洗滌6次后，加入 TMB-H2O2，每孔100 μ 1避光顯色I(xiàn)Omin,每孔50 μ 1 2Μ H2SO4終止反應(yīng)。測(cè)量450nm波長(zhǎng)下每孔的光密度(0D)。以小鼠免疫蛋白后血清作為陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照為小鼠免疫前血清。以待測(cè)孔0D450nm彡2. 1倍陰性對(duì)照0D450nm判為陽(yáng)性。經(jīng)過(guò)測(cè)定單抗bp26-2A4僅與P00LY6肽池反應(yīng)(圖3)，所以又分別將bp26-2A4與P00LY6中的四條多肽P06,12，18， 24反應(yīng)，結(jié)果顯示bp^-2A4與多肽12反應(yīng)(圖4)。
權(quán)利要求
1.布魯氏菌bp^蛋白表位，其序列為QPIYVYPD( SEQ ID NO :1)。
2.權(quán)利要求1所述布魯氏菌蛋白表位在制備診斷、預(yù)防或治療布魯氏菌病診斷試劑或藥物中的應(yīng)用。
3.抗布魯氏菌蛋白的單克隆抗體，其制備方法為1)將權(quán)利要求1所述的布魯氏菌蛋白表位免疫動(dòng)物；2)取經(jīng)免疫的動(dòng)物脾細(xì)胞與瘤細(xì)胞融合，得到可穩(wěn)定分泌抗布魯氏菌蛋白的雜交瘤細(xì)胞；3)收集、純化雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體，即為抗布魯氏菌白的單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗布魯氏菌蛋白的單克隆抗體，其特征在于產(chǎn)生免疫反應(yīng)的動(dòng)物的血清間接ELISA效價(jià)不低于1 :51200。
5.權(quán)利要求3或4所述單克隆抗體在制備診斷、預(yù)防或治療布魯氏菌病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了布魯氏菌bp26蛋白表位及其抗體和應(yīng)用，表位的序列為QPIYVYPD。本發(fā)明的布魯氏菌bp26蛋白表位，為bp26蛋白的核心表位，疫苗株中該段序列突變后獲得的突變bp26蛋白在免疫羊之后，無(wú)法誘導(dǎo)產(chǎn)生抗該表位的抗體，從而達(dá)到自然感染與疫苗接種免疫的鑒別診斷。
文檔編號(hào)C07K16/12GK102432673SQ20111041761
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月14日
發(fā)明者丘金浪, 張玲, 王文敬, 黎誠(chéng)耀 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)