專利名稱：紅樹植物總蛋白的提取以及雙向電泳方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及關(guān)于紅樹植物的蛋白組學(xué)，尤其涉及其總蛋白的提取以及雙向電泳方法。
背景技術(shù)：
紅樹林(mangrove)是一種稀有的木本胎生植物。它生長(zhǎng)于熱帶和亞熱帶陸地與海洋交界帶的灘涂淺灘，是陸地向海洋過度的特殊生態(tài)系統(tǒng)。紅樹林肩負(fù)優(yōu)化環(huán)境和促進(jìn)經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展的雙重使命，有著無可比擬的生態(tài)價(jià)值，在防風(fēng)消災(zāi)、提高生物多樣性、凈化大氣和水體環(huán)境等方面具有重要的生態(tài)意義和巨大經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也是中國(guó)南部沿海區(qū)域生態(tài)平衡最重要的生態(tài)安全保障體系之一。尤其紅樹林生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)、社會(huì)、文化、 再造功能及其他價(jià)值，已在中國(guó)和世界受到廣泛重視。隨著全球氣候的變暖，產(chǎn)生了應(yīng)對(duì)氣候變化紅樹林北移現(xiàn)象。隨著科技的進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)的變化，是導(dǎo)致生命功能失常的直接因素。因此對(duì)紅樹植物耐寒性蛋白的研究對(duì)于應(yīng)對(duì)氣候變化紅樹林北移的研究具有重要意義。雙向電泳是研究蛋白質(zhì)表達(dá)變化最有效的工具之一。它利用等電點(diǎn)和分子量?jī)蓚€(gè)性質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，可以使樣品中的數(shù)千種蛋白質(zhì)得到很好的分離。而蛋白質(zhì)的樣品制備是雙向電泳的關(guān)鍵步驟，但是由于植物組織由于富含色素、多酚、多糖、有機(jī)酸等次生代謝物質(zhì)和蛋白酶，其蛋白樣品制備一直較為困難。紅樹植物又生長(zhǎng)在陸地與海洋交界帶的灘涂淺灘，因其特殊的生長(zhǎng)環(huán)境，在其化學(xué)成分和生理活性方面都具有很多特殊性，其體內(nèi)除含有多種次生代謝物質(zhì)外還含有大量鹽分和單寧，鹽離子的存在嚴(yán)重干擾等電聚焦的進(jìn)行，單寧根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同可分為水解單寧和縮合單寧，縮合單寧能與蛋白質(zhì)結(jié)合并形成復(fù)合物，嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)的提取分離。因此，紅樹植物蛋白質(zhì)提取較其他植物更為困難， 具有其特殊性和復(fù)雜性。而雙向電泳技術(shù)在植物中的應(yīng)用主要集中在水稻、小麥或其他一些草本植物上，在紅樹植物中的應(yīng)用報(bào)道較少。

發(fā)明內(nèi)容
為方便對(duì)紅樹植物蛋白質(zhì)做進(jìn)一步的研究和分析，本發(fā)明提供經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、易行、 快速的適用于紅樹植物的總蛋白的提取以及雙向電泳方法，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)證明該方法樣品制備的重復(fù)性好且圖譜清晰。本發(fā)明提供的紅樹植物總蛋白的提取以及雙向電泳方法，技術(shù)方案是依次進(jìn)行下列步驟
a、將定量的紅樹植物葉片置于液氮中研磨充分，將粉末轉(zhuǎn)至離心管中，加入4倍體積 20%的TCA-丙酮溶液，渦旋混勻后，置于低溫下沉淀；
b、離心后收集沉淀，將該沉淀用預(yù)冷的丙酮洗滌，于低溫高速渦旋離心后收集沉淀，再將沉淀置于室溫晾干；
C、向步驟b得到的沉淀加入裂解緩沖液，低溫下溶解后離心，取上清液為蛋白提取樣品 ；
d、用Bradford法測(cè)定步驟c得到的蛋白提取樣品的蛋白質(zhì)含量；
e、進(jìn)行第一向固定pH梯度等電聚焦電泳將步驟c得到的蛋白提取樣品以及含電泳指示劑的上樣緩沖液加入聚焦盤中，將IPG膠條膠面朝下放入蛋白提取樣品溶液，加蓋礦物油，設(shè)置好等電聚焦程序；
f、進(jìn)行膠條平衡等電聚焦后的IPG膠條依次在第一平衡緩沖液和第二平衡緩沖液中平衡，然后轉(zhuǎn)移至SDS-聚丙烯酰胺凝膠的上端，瓊脂糖封膠液封頂；
g、進(jìn)行第二向SDS-PAGE電泳先用低電流的恒流電泳，再加大電流直至電泳指示劑到達(dá)膠的底端即可停止電泳。h、取步驟g電泳后得到的凝膠進(jìn)行高靈敏度染色。本發(fā)明所提供的技術(shù)方案可專門適用于紅樹植物的蛋白質(zhì)提取以及雙向電泳方法。因?yàn)門CA和丙酮可用于沉淀蛋白質(zhì)和雙向電泳樣品制備過程中去除單寧和鹽分，但是過高的TCA濃度在酸性條件下與蛋白質(zhì)形成不溶性鹽，且TCA可能滲入高豐度蛋白質(zhì)分子內(nèi)部而難以完全除去，也會(huì)影響高分子蛋白的提取，不易被丙酮徹底抽提，因此TCA的濃度是影響紅樹植物蛋白質(zhì)提取的主要因素，過高或過低的TCA濃度都將影響到蛋白質(zhì)的提取及其后續(xù)電泳的效果。本發(fā)明步驟a使用20%TCA-丙酮溶液提取蛋白質(zhì)，20%的TCA可以更好的去除鹽離子，其中80%濃度的丙酮?jiǎng)t對(duì)蛋白質(zhì)與縮合單寧的復(fù)合物的分離作用效果顯著，可較好分離該復(fù)合物，去除單寧，提高蛋白質(zhì)濃度，用20% TCA-丙酮所提取的紅樹植物蛋白質(zhì)含量較高，2-DE電泳圖譜清晰，且操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，試劑毒性較低。本發(fā)明提供改進(jìn)的紅樹植物的蛋白質(zhì)提取以及雙向電泳方法，在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟e的等點(diǎn)聚焦程序包括依次進(jìn)行下列步驟無電壓慢速水化4小時(shí)，250伏電壓慢速水化0. 5小時(shí)，500伏電壓慢速除鹽0. 5小時(shí)，1000伏電壓快速除鹽1. 5小時(shí)，1000 伏電壓線性升高至10000伏電壓3小時(shí)，10000伏電壓聚焦65000總電壓時(shí)間積，500伏電壓保持18小時(shí)。此改進(jìn)方案是對(duì)第一向固定pH梯度等電聚焦電泳的優(yōu)化，專門適用于紅樹植物的雙向電泳方法第一步無電壓泡脹即被動(dòng)水化4小時(shí)，目的使大部分蛋白進(jìn)入IPG 膠條。但高分子蛋白很難進(jìn)入IPG膠條，故選用低電壓250V主動(dòng)水化0. 5小時(shí)，使大分子蛋白進(jìn)入膠內(nèi)。由于蛋白質(zhì)樣品含鹽量較高，故選用除鹽500伏0.5小時(shí)和除鹽1000伏 1.5小時(shí)，減少鹽離子對(duì)樣品聚焦的影響。因?yàn)镮PG的導(dǎo)電性較弱，需要使用2000伏以上的高電壓才能使蛋白聚焦，故我們?cè)O(shè)定1000伏線性上升3小時(shí)，使電壓緩慢升高至10000伏， 避免電壓過高燒膠膠條。本發(fā)明提供改進(jìn)的紅樹植物的蛋白質(zhì)提取以及雙向電泳方法，步驟c中的裂解緩沖液包括 2mol/L 硫脲，7mol/L 尿素，4% CHAPS,40mmol/L Tris,2mmol/L ΤΒΡ,Ο. 2% Bio-lyte。該配方提供了專用于紅樹植物的蛋白質(zhì)提取的裂解緩沖液，其中各試劑作用分別是尿素用于破壞蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)，打斷非共價(jià)連接的離解劑；硫脲不僅對(duì)膜蛋白有極為明顯的增溶效果，而且對(duì)核蛋白等微溶性蛋白質(zhì)以及對(duì)等電點(diǎn)附近蛋白沉積都有改善，還可抑制蛋白酶活性，但其水中溶解度低，只在高濃度尿素中才溶解，因此濃度為2mol/L硫脲，7mol/L尿素；CHAPS用于兩性離子型去污劑，可打斷蛋白質(zhì)分子或亞基間的疏水作用， 增加蛋白溶解性，CHAPS與尿素、硫脲同時(shí)使用，對(duì)膜蛋白的增溶作用突出；TBP是非離子型還原劑，打開二硫鍵，保持蛋白處于還原狀態(tài)，較低濃度既可提高蛋白溶解性，而且不會(huì)電場(chǎng)中遷移。在等電聚焦過程中保持蛋白還原狀態(tài)，同時(shí)簡(jiǎn)化了兩向轉(zhuǎn)移間的平衡操作； Bio-Lyte是兩性電解質(zhì)，具有在聚焦過程中不改變pH梯度前提下提供穩(wěn)定導(dǎo)電的能力。因兩性電解質(zhì)會(huì)在電場(chǎng)中遷移聚焦，故濃度不應(yīng)過高。本發(fā)明提供改進(jìn)的紅樹植物的蛋白質(zhì)提取以及雙向電泳方法，步驟e中的上樣緩沖液包括 2mol/L 硫脲，7mol/L 尿素，4% CHAPS, 40mmol/L Tris,2mmol/L TBP, 0. 2% Bio-lyte,0. 001%溴酚藍(lán)，上樣緩沖液中的溴酚藍(lán)在電泳里起指示作用，其余試劑與前述裂解緩沖液保持一致，使蛋白質(zhì)提取以及電泳環(huán)境一致，提高蛋白質(zhì)電泳效果得到清晰電泳圖譜。本發(fā)明提供改進(jìn)的紅樹植物的蛋白質(zhì)提取以及雙向電泳方法，其步驟f中的第一平衡緩沖液包括 l%DTT，6mol/L 尿素，2%SDS，50mol/LTris_HCl，Ph8. 8 的 20% 甘油，步驟 f 中的第二平衡緩沖液包括2. 5%碘乙酰胺，6mol/L尿素，2%SDS，50mol/LTris-HCl，Ph8. 8的 20%甘油。該第一和第二平衡緩沖液是針對(duì)紅樹植物特性所做出的試劑配方，能提高蛋白質(zhì)電泳效果并得到清晰電泳圖譜。本發(fā)明提供改進(jìn)的紅樹植物的蛋白質(zhì)提取以及雙向電泳方法，步驟c得到蛋白提取樣品后用clean-up試劑盒純化。經(jīng)clean-up試劑盒純化后的蛋白樣品中所含雜質(zhì)大幅減少，其電泳圖譜背景清晰，蛋白點(diǎn)分離較好。本發(fā)明提供改進(jìn)的紅樹植物的蛋白質(zhì)提取以及雙向電泳方法，步驟e使用的IPG 膠條規(guī)格為PH3-10NL，紅樹植物蛋白質(zhì)pH大都分布在4_7左右，其酸性端和堿性端蛋白分布較少，為了保證大部分蛋白得到很好的分離且不丟失酸堿兩端的少量蛋白，采用PH 3-10 NL的IPG膠條。此種膠條的pH非線性分布，在pH 4_7范圍分布較寬，在pH 3_4和7_10范圍分布較窄，這樣既保證了紅樹植物大多數(shù)蛋白點(diǎn)的較好分離，又不會(huì)丟失酸堿兩端蛋白， 真正做到蛋白質(zhì)的完全分離。本發(fā)明所稱的紅樹植物包括木欖、秋茄、桐花等品種。下面結(jié)合附圖、具體實(shí)施例以及對(duì)比例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為實(shí)施例一紅樹植物秋茄蛋白質(zhì)提取以及雙向電泳方法所獲的圖譜。圖2為實(shí)施例二紅樹植物秋茄蛋白質(zhì)提取以及雙向電泳方法所獲的圖譜。圖3為實(shí)施例三紅樹植物桐花蛋白質(zhì)提取以及雙向電泳方法所獲的圖譜。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一
采用Eppendorf超速離心機(jī)、雙向電泳PROTEANIIXi/XL Cell (美國(guó)BIO-RAD公司)
(1)采集秋茄新鮮葉片(倒二對(duì)嫩葉)；
(2)稱取Ig葉肉，置于液氮中研磨充分；將粉末轉(zhuǎn)至離心管中，加入4倍體積20%的 TCA-丙酮中溶液中，渦旋，4°C沉淀過夜；
(3)4°C,12000r/min離心30min后收集沉淀，將該沉淀用4°C預(yù)冷的丙酮(含2%β -巰基乙醇)洗滌，渦旋，4°C，12000r/min離心IOmin后收集沉淀，重復(fù)三次，沉淀置室溫晾干；
(4)向步驟(3)得到的紅樹植物秋茄葉片全蛋白粗提物中加入裂解緩沖液(2mol/L硫脲，7mol/L 尿素，4% CHAPS, 40mmol/L Tris,2mmol/L TBP, 0. 2% Bio-lyte)后，4°C溶解過夜，4°C，12000r/min離心30min，取上清即為秋茄葉片蛋白溶液；
(5)用clean-up試劑盒純化蛋白，得到紅樹植物秋茄葉片全蛋白雙向電泳樣品液；
(6)蛋白質(zhì)定量用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，用吸光光度計(jì)測(cè)量波長(zhǎng)595nm，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定蛋白濃度；
(7 )測(cè)得蛋白濃度為11. 5μδ/μ ,樣品進(jìn)行雙向電泳試驗(yàn)；
(8)第一向固定ρΗ梯度等電聚焦電泳采用低電壓膠內(nèi)泡漲法，將400ug蛋白樣品與上樣緩沖液(2mol/L 硫脲，7mol/L 尿素，4% CHAPS, 40mmol/L Tris,2mmol/L TBP, 0. 2% Bio-lyte, 0. 001%溴酚藍(lán))共300ul混合后加入聚焦盤中，選用pH3_10 NL、17cm膠條，IPG 膠條膠面朝下放入水化液，加蓋3mL礦物油。聚焦參數(shù)見下列表1 : 表1 IEF電泳參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種紅樹植物總蛋白的提取以及雙向電泳方法，其特征在于依次進(jìn)行下列步驟a、將定量的紅樹植物葉片置于液氮中研磨充分，將粉末轉(zhuǎn)至離心管中，加入4倍體積 20%的TCA-丙酮溶液，渦旋混勻后，置于低溫下沉淀；b、離心后收集沉淀，將該沉淀用預(yù)冷的丙酮洗滌，于低溫高速渦旋離心后收集沉淀，再將沉淀置于室溫晾干；C、向步驟b得到的沉淀加入裂解緩沖液，低溫下溶解后離心，取上清液為蛋白提取樣Pm ；d、用Bradford法測(cè)定步驟c得到的蛋白提取樣品的蛋白質(zhì)含量；e、進(jìn)行第一向固定pH梯度等電聚焦電泳將步驟c得到的蛋白提取樣品以及含電泳指示劑的上樣緩沖液加入聚焦盤中，將IPG膠條膠面朝下放入蛋白提取樣品溶液，加蓋礦物油，設(shè)置好等電聚焦程序；f、進(jìn)行膠條平衡等電聚焦后的IPG膠條依次在第一平衡緩沖液和第二平衡緩沖液中平衡，然后轉(zhuǎn)移至SDS-聚丙烯酰胺凝膠的上端，瓊脂糖封膠液封頂；g、進(jìn)行第二向SDS-PAGE電泳先用低電流的恒流電泳，再加大電流直至電泳指示劑到達(dá)膠的底端即可停止電泳；h、取步驟g電泳后得到的凝膠進(jìn)行高靈敏度染色。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅樹植物總蛋白的提取以及雙向電泳方法，其特征在于所述步驟e的等電聚焦程序包括依次進(jìn)行下列步驟無電壓慢速水化4小時(shí)，250伏電壓慢速水化0. 5小時(shí)，500伏電壓慢速除鹽0. 5小時(shí)，1000伏電壓快速除鹽1. 5小時(shí)，1000伏電壓線性升高至10000伏電壓3小時(shí)，10000伏電壓聚焦65000總電壓時(shí)間積，500伏電壓保持18 小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的紅樹植物總蛋白的提取以及雙向電泳方法，其特征在于所述步驟c中的裂解緩沖液包括2mol/L硫脲，7mol/L尿素，4% CHAPS, 40mmol/L Tris,2mmol/L ΤΒΡ,Ο. 2% Bio-Iyte0
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的紅樹植物總蛋白的提取以及雙向電泳方法，其特征在于 所述步驟e中的上樣緩沖液包括2mol/L硫脲，7mol/L尿素，4% CHAPS, 40mmol/L Tris， 2mmol/L TBP, 0. 2% Bio_lyte，0. 001% 溴酚藍(lán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的紅樹植物總蛋白的提取以及雙向電泳方法，其特征在于 所述步驟e中的上樣緩沖液包括2mol/L硫脲，7mol/L尿素，4% CHAPS, 40mmol/L Tris, 2mmol/L TBP, 0. 2% Bio-lyte,0. 001% 溴酚藍(lán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的紅樹植物總蛋白的提取以及雙向電泳方法，其特征在于 所述步驟f中的第一平衡緩沖液包括l%DTT，6mol/L尿素，2%SDS，50mol/LTris-HCl，Ph8. 8 的20%甘油，所述步驟f中的第二平衡緩沖液包括2. 5%碘乙酰胺，6mol/L尿素，2%SDS， 50mol/LTris-HCl, Ph8. 8 的 20% 甘油。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的紅樹植物總蛋白的提取以及雙向電泳方法，其特征在于 所述步驟c得到蛋白提取樣品后用clean-up試劑盒純化。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的紅樹植物總蛋白的提取以及雙向電泳方法，其特征在于 所述步驟e使用的IPG膠條規(guī)格為PH3-10NL。
全文摘要
本發(fā)明提供經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、易行、快速的適用于紅樹植物的總蛋白的提取以及雙向電泳方法，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)證明該方法樣品制備的重復(fù)性好且圖譜清晰，其技術(shù)方案可專門適用于紅樹植物的蛋白質(zhì)提取以及雙向電泳方法。本發(fā)明使用20%TCA-丙酮溶液提取蛋白質(zhì)，20%的TCA可以更好的去除鹽離子，其中80%濃度的丙酮?jiǎng)t對(duì)蛋白質(zhì)與縮合單寧的復(fù)合物的分離作用效果顯著，可較好分離該復(fù)合物，去除單寧，提高蛋白質(zhì)濃度，用20%TCA-丙酮所提取的紅樹植物蛋白質(zhì)含量較高，2-DE電泳圖譜清晰，且操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，試劑毒性較低。
文檔編號(hào)C07K1/14GK102321149SQ20111027552
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者于馮, 仇建標(biāo), 劉偉成, 周志明, 施夢(mèng)茄, 李尚魯, 艾為明, 謝起浪, 鄭春芳, 陳少波, 陳驍, 馬小偉, 黃麗 申請(qǐng)人:浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所