專利名稱：乳清蛋白的規(guī)模純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種乳清蛋白的規(guī)模純化方法。
背景技術(shù)：
α -乳清白蛋白廣泛存在于哺乳動(dòng)物乳中，是β -1,4-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶的調(diào)節(jié)亞基，催化乳糖的合成。α-乳清白蛋白的氨基酸組成中包含大量的人體營(yíng)養(yǎng)所必需的氨基酸，具有重要的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。人α-乳清白蛋白多聚體或折疊變異體能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，有望開發(fā)成治療癌癥的臨床藥物。α-乳清白蛋白是乳清蛋白的一種。中國(guó)專利 200610076242建立了轉(zhuǎn)人α -乳清蛋白基因的重組克隆大型家畜的生產(chǎn)方法，為規(guī)模生產(chǎn)重組人α-乳清蛋白用作臨床藥物和功能食品奠定了基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳液中除重組人乳清蛋白外，還有動(dòng)物自身表達(dá)的乳清蛋白，這類同種異源蛋白結(jié)構(gòu)很相似，理化性質(zhì)接近， 規(guī)模分離制備非常困難。經(jīng)過(guò)對(duì)專利文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00810118961. 7 “異源同種乳清蛋白的分離純化方法”，采用疏水層析和凝膠過(guò)濾層析兩步法純化α -乳清白蛋白，先采用疏水層析得到目標(biāo)蛋白粗品，再用凝膠過(guò)濾層析精制；該純化方法步驟較多，操作復(fù)雜，效率低下。中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00910161153. 3 “乳清蛋白的分離和測(cè)定方法”采用以亞乙基橋雜化 (BEH)顆粒為填料的超高效液相色譜柱的方法將α-乳清白蛋白和β-乳球蛋白分離；美國(guó)專利號(hào)75Μ932酸性條件預(yù)處理后，采用陰離子交換法和梯度洗脫純化α-乳清白蛋白； 美國(guó)專利號(hào)5503864是結(jié)合了等電點(diǎn)沉淀和膜過(guò)濾的方法，雖然操作簡(jiǎn)便，但是選擇性低， 產(chǎn)品純度低。這些方法要么操作步驟多，要么難于進(jìn)行規(guī)模放大實(shí)現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)。因此，需要建立一種簡(jiǎn)便高效、成本低、生產(chǎn)規(guī)模易于放大的重組人乳清蛋白純化方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種乳清蛋白的規(guī)模純化方法，能夠可快速、簡(jiǎn)便、低成本、大批量純化重組人α-乳清白蛋白，降低生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明通過(guò)以人α-乳清白蛋白重組牛乳為原料，經(jīng)預(yù)處理純化蛋白后，用陰離子交換層析分離得到重組人α-乳清白蛋白、牛α-乳清白蛋白和牛乳球蛋白。所述的人α-乳清白蛋白重組牛乳采用市售或取自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)李寧教授實(shí)驗(yàn)
室提供。所述的預(yù)處理是指在有保護(hù)劑的條件下將乳樣品加熱至60°C _95°C并保溫 lOmin-eOmin后，冷卻至室溫并除去沉淀，收集清液富含β-乳球蛋白和α-乳清白蛋白的清液。所述的保護(hù)劑采用濃度為0. 05-0. 4Μ的CaCl2的水溶液。
所述的陰離子交換層析分離是指用市售的陰離子交換介質(zhì)制成離子交換層析柱，將熱處理后的產(chǎn)物流經(jīng)離子交換層析柱，具體步驟包括在50-150mM，pH 6. 4-8. 4的 Tris-HCl的平衡條件下使得β -乳球蛋白和α -乳清白蛋白不同程度的吸附在離子交換層析柱上，最后用電導(dǎo)6. 9-13. 5ms/cm的NaCl-50mM，pH 7. 4的1Tris-HCl的洗脫液一步洗脫并收集不同的洗脫峰，三種蛋白被分別洗脫下來(lái)，依次得到牛α-乳清白、人α-乳清白和牛乳球蛋白，達(dá)到分離純化人α-乳清白蛋白的目的。本發(fā)明將乳清蛋白生產(chǎn)中步驟減少到了兩步，其中預(yù)處理可以實(shí)現(xiàn)α-乳清白蛋白和β-乳球蛋白總含量達(dá)到99%以上，離子交換處理步驟一步洗脫取得重組人α-乳清白蛋白純度90%以上；因而能夠可快速、簡(jiǎn)便、低成本、大批量純化重組人α-乳清白蛋白， 降低生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1取重組牛奶粉，按1 8(w/v)加入去離子水，離心脫脂，取乳清分裝成多份，分別調(diào) CaCl2 終濃度 0. 0,0. 05，0. 1,0. 15，0. 2,0. 25，0. 3,0. 4M，然后分別加熱至溫度:70°C， 75°C，80°C，85°C，90°C，95°C，保溫 IOmin, 20min, 30min, 40min, 50min, 60min ；反應(yīng)完畢后， 將各管于4°C，9800rpm,離心lOmin，上清轉(zhuǎn)移至新管并加入NaCO3,離心除去CaCl2，用200mL PH 7. 0，IOmM磷酸鈉緩沖液將沉淀洗滌三次后溶起。13. 5% SDS-PAGE分析上清和沉淀蛋白組成，并對(duì)上清進(jìn)行蛋白定量的測(cè)定。濃縮樣品總α-乳清白蛋白和β-乳球蛋白總含量最高可達(dá)到99%以上。表1顯示了乳清樣品在不同濃度CaCl2加熱95°C保溫5min的蛋白濃度結(jié)果；表2顯示了乳清樣品在0. 2M CaCl2條件下加熱不同溫度保溫20min的結(jié)果；表3顯示75°C 了保溫不同時(shí)間的效果。再用5KD再生纖維素復(fù)合膜初步濃縮，去除部分鹽離子，加去離子水除鹽，得乳清預(yù)處理樣品表
權(quán)利要求
1.一種乳清蛋白的規(guī)模純化方法，其特征在于，通過(guò)以人α-乳清白蛋白重組牛乳為原料，經(jīng)預(yù)處理純化蛋白后，用陰離子交換層析分離得到重組人α-乳清白蛋白、牛α-乳清白蛋白和牛乳球蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳清蛋白的規(guī)模純化方法，其特征是，所述的預(yù)處理是指在有保護(hù)劑的條件下將乳樣品加熱至60°C _95°C并保溫lOmin-eOmin后，冷卻至室溫并除去沉淀，收集清液富含乳球蛋白和α-乳清白蛋白的清液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳清蛋白的規(guī)模純化方法，其特征是，所述的保護(hù)劑采用濃度為0. 05-0. 4Μ的CaCl2的水溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳清蛋白的規(guī)模純化方法，其特征是，所述的陰離子交換層析分離是指用市售的陰離子交換介質(zhì)制成離子交換層析柱，將熱處理后的產(chǎn)物流經(jīng)離子交換層析柱。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳清蛋白的規(guī)模純化方法，其特征是，所述的陰離子交換層析分離的具體步驟包括在50-150mM，pH 6. 4-8. 4的Tris-HCl 的平衡條件下使得乳球蛋白和α-乳清白蛋白不同程度的吸附在離子交換層析柱上， 最后用電導(dǎo)6. 9-13. 5ms/cm的NaCl-50mM，pH 7. 4的1Tris-HCl的洗脫液一步洗脫并收集不同的洗脫峰，三種蛋白被分別洗脫下來(lái)，依次得到牛α-乳清白、人α-乳清白和牛β-乳球蛋白，達(dá)到分離純化人α-乳清白蛋白的目的。
全文摘要
一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的乳清蛋白的規(guī)模純化方法，通過(guò)以人α-乳清白蛋白重組牛乳為原料，經(jīng)預(yù)處理純化蛋白后，用陰離子交換層析分離得到重組人α-乳清白蛋白、牛α-乳清白蛋白和牛β-乳球蛋白。本發(fā)明能夠可快速、簡(jiǎn)便、低成本、大批量純化重組人α-乳清白蛋白，降低生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率。
文檔編號(hào)C07K14/76GK102286096SQ20111019173
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月8日
發(fā)明者李榮秀, 李雪, 王一, 翟東改, 霍晨曦, 顏遠(yuǎn)偉 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)