專利名稱：內(nèi)嗎啡肽-1類似物及其合成和在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一類新的內(nèi)嗎啡肽-1類似物及其合成；本發(fā)明同時(shí)還涉及該內(nèi)嗎啡肽-1類似物在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所謂的疼痛，是一種復(fù)雜的生理心理活動(dòng)，是臨床上最常見的癥狀之一。 它包括傷害性刺激作用于機(jī)體所引起的痛感覺，以及機(jī)體對(duì)傷害性刺激的痛反應(yīng)。長期疼痛給患者帶來痛苦和不安，劇痛還可以引起失眠或其他生物功能紊亂，影響患者的生活質(zhì)量。因此，疼痛藥物的研發(fā)一直是全球性的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。阿片類藥物因其止痛作用強(qiáng)，在緩解重度疼痛具有無可取代的地位。然而它們?cè)谄鸬芥?zhèn)痛作用的同時(shí)往往伴隨很多副作用， 很大程度上限制了其在鎮(zhèn)痛方面的應(yīng)用。臨床上鎮(zhèn)痛最常應(yīng)用的是阿片藥物，除了眾所周知的副作用外，不同的阿片藥物治療還可產(chǎn)生急性耐受性。因此，發(fā)現(xiàn)新型的低副作用的阿片類鎮(zhèn)痛藥物是目前科學(xué)研究的難點(diǎn)，尤其是能夠產(chǎn)生強(qiáng)效的無耐受現(xiàn)象的鎮(zhèn)痛作用的藥物。阿片類鎮(zhèn)痛藥物主要是通過μ阿片受體發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，所以自從μ阿片受體的內(nèi)源性配體內(nèi)嗎啡肽被發(fā)現(xiàn)后，科學(xué)家們對(duì)其進(jìn)行了廣泛而深入的研究。研究表明內(nèi)嗎啡肽通過與G蛋白偶聯(lián)的μ阿片受體結(jié)合，可參與對(duì)痛覺、呼吸、心血管、胃腸、行為、運(yùn)動(dòng)、內(nèi)分泌及免疫等諸多功能的調(diào)節(jié)，但其主要藥用作用體現(xiàn)在鎮(zhèn)痛功能上。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在中樞給藥情況下，內(nèi)嗎啡肽可產(chǎn)生強(qiáng)度與嗎啡相當(dāng)而副作用較少的鎮(zhèn)痛作用。其中內(nèi)嗎啡肽-1 (Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2)具有優(yōu)于內(nèi)嗎啡肽-2 (Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2)的治療學(xué)特性， 如獎(jiǎng)賞行為與鎮(zhèn)痛作用的分離，耐受的形成較內(nèi)嗎啡肽-2發(fā)展更慢一些，鎮(zhèn)痛劑量明顯低于引起呼吸抑制及心血管作用的劑量等，因此推測內(nèi)嗎啡肽-1比內(nèi)嗎啡肽-2更適于作為新的安全阿片類鎮(zhèn)痛藥物先導(dǎo)化合物。內(nèi)嗎啡肽-KEndomorphin-l，EM-1)具有酶解穩(wěn)定性差，血腦屏障通透能力差的缺點(diǎn)，從而限制其在臨床上的應(yīng)用。因此，通過對(duì)內(nèi)嗎啡肽-1進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，在盡量不降低或提高其親和活力的前提下，提高酶解穩(wěn)定性和血腦屏障通透能力；從而得到外周給藥產(chǎn)生高效鎮(zhèn)痛活性的內(nèi)嗎啡肽-1類似物成為近年研究的方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一類種具有高親和力、酶解穩(wěn)定性好、鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)并且作用時(shí)間長、低副作用的內(nèi)嗎啡肽-1類似物。本發(fā)明的另一目的是提供一種該內(nèi)嗎啡肽-1類似物的合成方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的，就是提供該內(nèi)嗎啡肽-1類似物在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。(一)內(nèi)嗎啡肽-I類似物本發(fā)明的內(nèi)嗎啡肽-1類似物，是以內(nèi)嗎啡肽-1為母體進(jìn)行改造而成，其結(jié)構(gòu)式如下
權(quán)利要求
1.
2.如權(quán)利要求1所述內(nèi)嗎啡肽-1類似物的合成方法，包括以下工藝步驟(1)單芐氧羰酰脒基吡唑的合成以二氯甲烷與N，N-二甲基甲酰胺的混合液為溶劑，在三乙胺或二異丙基乙胺的作用下，脒基吡唑鹽酸鹽與芐氧羰酰氯以1 1 1 1.3的摩爾比于室溫反應(yīng)0.5 1.5小時(shí)， 反應(yīng)完全后減壓濃縮除去溶劑，用乙酸乙酯溶解，依次用質(zhì)量濃度為3 8 %的檸檬酸、飽和氯化鈉洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮；粗產(chǎn)物用乙酸乙酯與石油醚的混合液結(jié)晶，得白色晶體——單芐氧羰酰脒基吡唑；所述乙酸乙酯與石油醚的混合液中二者的體積比為1 4;所述三乙胺或二異丙基乙胺的用量為脒基吡唑鹽酸鹽的1. 5 3倍；(2)雙芐氧羰酰脒基吡唑的合成以四氫呋喃為溶劑，在氬氣保護(hù)下，將單芐氧羰酰脒基吡唑與氫化鈉以1 3 1 5 的摩爾比于0 5°C反應(yīng)20 40分鐘，再加單芐氧羰酰脒基吡唑摩爾量1. 5 2. 5倍的芐氧羰酰氯，于室溫反6 10小時(shí)；反應(yīng)完全后，用0 5°C冰水淬滅反應(yīng)，反應(yīng)完全后減壓濃縮除去四氫呋喃，用乙酸乙酯萃取，再依次用質(zhì)量濃度為3 8 %的檸檬酸、飽和氯化鈉洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮，粗產(chǎn)物依次用乙酸乙酯、乙醚、正己烷結(jié)晶，得白色晶體——雙芐氧羰酰脒基吡唑；(3)Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-OH 的合成以無水甲醇為溶劑，在鈀碳催化劑和持續(xù)通氫氣的作用下，將Cbz-Tyr-D-Ala-OH于室溫反2 4小時(shí)，抽濾，除去鈀碳，減壓抽去甲醇，得到油狀物，即為脫保護(hù)二肽—— Tyr-D-Ala-OH ；將雙芐氧羰酰脒基吡唑與脫保護(hù)二肽Tyr-D-Ala-OH以1 1 1 1.3的摩爾比溶解于無水N，N- 二甲基甲酰胺中，加入雙芐氧羰酰脒基吡唑摩爾量2 5倍的三乙胺， 室溫反應(yīng)48 72小時(shí)；反應(yīng)完全后，用乙酸乙酯溶解，依次用質(zhì)量濃度3 8%檸檬酸、 飽和NaCl水溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮，硅膠柱層析純化，得無色油狀化合物—— Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-OH ；(4)Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-R)-NH2或Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Trp-NH2 的合成將 Cbh-Amidino-Tyr-D-AIa-OH 與 N-羥基琥珀酰亞胺以 1 1 1 1. 3 的摩爾比溶于四氫呋喃或二氯甲烷中，于O 5 °C下反應(yīng)10 20分鐘；再加入 Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-OH摩爾量1 1. 2倍的N，N，_ 二環(huán)己基碳二亞胺，于O 5°C下反應(yīng)20 40分鐘，然后于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6 10小時(shí)，得Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-0H的活化酯溶液，即Cbz2GUPy-Tyr-D-AIa-OSU溶液；將 Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-OH 摩爾量 1. 1 1. 3 倍的 Boc-Gly-Phe (4-R)-NH2 或 Boc-Gly-Trp-NH2用乙酸乙酯溶解，在O 5°C下加入乙酸乙酯體積0. 2 0. 5倍的濃鹽酸， 反應(yīng)20 40分鐘后，室溫下反應(yīng)1. 5 2小時(shí)；然后用堿液調(diào)Wi至9 10，得脫保護(hù)二肽溶液，即 Gly-Phe (4_R) -NH2 或 Gly-Trp-NH2 溶液；將上述 Cbz2GUPy-Tyr-D-AIa-OSU 溶液加入到 Gly-Phe (4-R) -NH2 或 Gly-Trp-NH2 溶液中，于O 5°C下反應(yīng)20 40分鐘后，再于常溫反應(yīng)6 10小時(shí)；反應(yīng)完全后，減壓濃縮除去四氫呋喃，用乙酸乙酯溶解，再依次用質(zhì)量濃度3 8%檸檬酸、飽和碳酸氫鈉溶液、飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮，硅膠柱層析分離，得Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe (4-R) -NH2 或 Cbh-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Trp-NH2 ；(5)N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-R)-NH2或 N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Trp-NH2 的合成將 Cbh-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe 0-R)-NH2 或 Cbh-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Trp -NH2溶于無水甲醇中，加入鈀碳催化劑，通氫氣攪拌反應(yīng)1 2小時(shí)，真空抽濾除鈀碳，減壓濃縮濾液，柱層析分離，得白色固體化合物，即為目標(biāo)產(chǎn)物脫保護(hù)四肽N-Amidin0-Tyr-D-AI a-GIy-Phe (4-R) -NH2 或 N-Amidino-Tyr-D-AIa_GIy-Trp-NH2。
3.如權(quán)利要求2所述內(nèi)嗎啡肽-1類似物的合成方法，其特征在于步驟(1)所述二氯甲烷與二甲基甲酰胺的混合液溶中，二氯甲烷與二甲基甲酰胺的體積比為1 0.5 1 1.5。
4.如權(quán)利要求2所述內(nèi)嗎啡肽-1類似物的合成方法，其特征在于步驟(3)所述鈀碳催化劑的含鈀量為10 40% ；鈀碳的用量為Cbz-Tyr-D-Ala-OH質(zhì)量的20 40%。
5.如權(quán)利要求2所述內(nèi)嗎啡肽-1類似物的合成方法，其特征在于步驟(3)所述硅膠柱層析純化采用的展開劑石油醚、乙酸乙酯、冰乙酸的體積比為50 85 2。
6.如權(quán)利要求2所述內(nèi)嗎啡肽-1類似物的合成方法，其特征在于步驟(4)所述硅膠柱層析分離采用的展開劑為乙酸乙酯、石油醚、甲醇的體積比為2 1 0.2。
7.如權(quán)利要求2所述內(nèi)嗎啡肽-1類似物的合成方法，其特征在于步驟(5)所述柱層析分離采用的展開劑乙酸乙酯、甲醇、氨水的體積比為45 20 8。
8.如權(quán)利要求2所述內(nèi)嗎啡肽-1類似物的合成方法，其特征在于步驟(3)所述 Cbz-Tyr-D-Ala-OH 的合成如下將Cbz-Tyr-OH與N-羥基琥珀酰亞胺以1 1 1 1. 3的摩爾比溶于無水四氫呋喃或二氯甲烷中，于0 5°C下攪拌15-20分鐘后，加入Cbz-Tyr-OH摩爾量1 1. 2倍的N， N’-二環(huán)己基碳二亞胺，反應(yīng)5 15分鐘，室溫下攪拌反應(yīng)6 10小時(shí)，過濾，除去反應(yīng)生成的環(huán)二己基脲，得到化合物Cbz-Tyr-OSU的四氫呋喃溶液；將Cbz-Tyr-OH摩爾量1. 1 1. 3倍的D-丙氨酸溶于2mol/L的NaOH水溶液，調(diào)節(jié)PH值至9 10，于0 5°C下加入到上述化合物Cbz-Tyr-OSU的四氫呋喃溶液中，先在0 5°C下反應(yīng)20 40分鐘后，再于室溫反應(yīng)6 10小時(shí)；反應(yīng)完全后，減壓濃縮、過濾除去四氫呋喃，用乙酸乙酯溶解，再依次用質(zhì)量濃度3 8%檸檬酸、飽和碳酸氫鈉溶液、飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮，硅膠柱層析純化，既得Cbz-Tyr-D-Ala-OH ；所述硅膠柱層析分離采用的展開劑乙酸乙酯、石油醚、甲醇的體積比為2 1 0.2。
9.如權(quán)利要求2所述內(nèi)嗎啡肽-1類似物的合成方法，其特征在于步驟(4)所述 Boc-GIy-Phe (4-R) -NH2 或者 Boc-GIy-Trp-NH2 的合成如下在0 5°C下，將Boc-Gly-OH與N-羥基琥珀酰亞胺以1 1 1 1.3的摩爾比溶于四氫呋喃或二氯甲烷中，加入Boc-Gly-OH摩爾量為1. 1 1. 3倍量的N，N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺，先在O 5°C下反應(yīng)20 40分鐘后，再于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6 10小時(shí)，得化合物 Boc-Gly-OH的活化酯溶液，即Boc-Gly-OSU溶液；將Boc-Phe G-R)-OH或Boc-Trp-OH與苯并三氮唑-N，N，N' , N'-四甲基脲-六氟磷酸鹽以1 1 1 1.3的摩爾比溶于N，N-二甲基甲酰胺中，加入Boc-Phd4-R)-0H 或Boc-Trp-OH摩爾量1 1. 2倍的1-羥基苯并三氮唑；再加入Boc-Phe (4-R) -OH或 Boc-Trp-OH摩爾量1. 5 3倍的二異丙基乙胺，于室溫反應(yīng)10 30分鐘；然后加入N， N- 二甲基甲酰胺體積2 5倍的濃氨水，攪拌反應(yīng)6 10小時(shí)；反應(yīng)完全后抽去氨水，再用乙酸乙酯溶解，依次用質(zhì)量濃度3 8%的檸檬酸、飽和NaHCO3、飽和氯化鈉洗滌，無水硫酸鈉干燥，得白色固體；用PE EA = 5 1結(jié)晶得白色固體，即為徹廣？！^^-幻巧吐或 Boc-Trp-NH2 ；將Boc-Phe G-R)-NH2或Boc-Trp-NH2溶解于乙酸乙酯中，在O 5°C下加入乙酸乙酯體積0. 2 0. 5倍的濃鹽酸，反應(yīng)1 2小時(shí)；再用堿液調(diào)Wi至9-10，得脫保護(hù)氨基酸 Phe (4-R) -NH2 或者 Trp-NH2 溶液；在O 5°C，將Boc-Gly-OSU溶液加入到上述Phe(4-R)_NH2或者Trp-NH2溶液，反應(yīng) 20 40分鐘；再于室溫反應(yīng)6 10小時(shí)；反應(yīng)完全后，減壓濃縮除去四氫呋喃，用乙酸乙酯萃取，依次用質(zhì)量濃度3 8%檸檬酸、飽和碳酸氫鈉溶液、飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮，柱層析分離，得Boc-GIy-Phe (4-R) -NH2或Boc-GIy-Trp-NH2 ；所述柱層析的展開劑為石油醚乙酸乙酯=1 2。
10.如權(quán)利要求1所述內(nèi)嗎啡肽-1類似物用于制備鎮(zhèn)痛藥物。
全文摘要
本發(fā)明合成了四個(gè)新型的內(nèi)嗎啡肽-1類似物，屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。該內(nèi)嗎啡肽-1類似物是將內(nèi)嗎啡肽-1的一位Tyr進(jìn)行N端胍基化；二位Pro被D-Ala替換；三位Trp被Gly替換；四位Phe分別被Trp替換或是Phe的苯環(huán)對(duì)位氯化、氟化修飾或未修飾。本發(fā)明合成的內(nèi)嗎啡肽-1類似物通過放射配體受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，離體器官生物活性鑒定實(shí)驗(yàn)，離體酶解穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，溫浴甩尾鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)和藥物耐受實(shí)驗(yàn)等一系列的生理學(xué)和藥理學(xué)活性鑒定，顯示出了高親和活性，高酶解穩(wěn)定性，高鎮(zhèn)痛活性及不易引起耐受性。因此，可以用于制備臨床鎮(zhèn)痛藥物。
文檔編號(hào)C07K1/06GK102241737SQ201110089179
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月6日
發(fā)明者劉星, 王一青, 王銳 申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)