專利名稱：一種小分子配基親和層析凝膠的制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程下游領(lǐng)域，抗體分離純化的親和凝膠介質(zhì)的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
目前世界上最通用的抗體純化介質(zhì)為ftOtein A、Protein GJroteinL凝膠介質(zhì)， 該三種介質(zhì)都具有自己的特點，如ftOteinA凝膠對人，兔，小鼠的IgG具有較高的親和吸附。ftOteinG凝膠對山羊IgG具有較高的親和吸附，ProteinL凝膠對IgY具有較高的親和吸附。因而針對要做的實驗或者生產(chǎn)所需要抗體不同，則要選定不同的凝膠。而該小分子配基同時具有對各種抗體都具有很強的親和吸附性。只需要采用不同條件，就可以同時吸附不同的免疫蛋白。對生產(chǎn)過程中的原料采購帶來了簡化方式。并且ftOtein A.Protein G.Protein L凝膠介質(zhì)都具有共同的缺陷(DftOtein A、Protein G、Protein L都是生物大分子，因而他們都對人體具有過敏反應(yīng)，所以用這三種凝膠介質(zhì)純化抗體后，都必須除去殘留。0)Pr0tein A.Protein G.Protein L因為是生物大分子，所以必須通過發(fā)酵法進行生產(chǎn)，其生產(chǎn)成本高，純化難度大。(3)Pr0tein A與IgG的Fc片段發(fā)生特異性的吸附，可以由于其結(jié)合能力過高，往往再洗脫的時候會出現(xiàn)將IgG的Fc片段拉扯出來的現(xiàn)象，從而破壞了蛋白的空間構(gòu)象，導(dǎo)致抗體蛋白失去活性。Protein G.Prote in L同樣也會出現(xiàn)類似的情況。由于很多抗體蛋白的價格極其高昂，因而這樣的現(xiàn)象會導(dǎo)致巨大的虧損與浪費。 (4)抗體作為一種注射用藥，因而再生產(chǎn)中要經(jīng)常做滅菌處理，工業(yè)中介質(zhì)滅菌(包括去除內(nèi)毒素)常用的方式是采用一定濃度的NaOH溶液清洗管道和凝膠。而ftOtein A.Protein G、Protein L作為生物大分子，不耐受高濃度的堿性溶液，因而在使用過幾十個循環(huán)后，凝膠就會失活，導(dǎo)致吸附載量急劇下降。因而需要定期更換凝膠，進而增大純化成本。而本發(fā)明的小分子配基可以非常好的解決以上四種缺陷(1)該小分子配基是生物小分子，首先不會對人體產(chǎn)生過敏反應(yīng)，其次，其沒有毒性，因而在抗體純化后，將該小分子配基去除殘留很簡單。(2)該小分子配基采用多肽合成的方法生產(chǎn)，不僅生產(chǎn)純化簡單，并且更加易于質(zhì)量的管理與控制。(3)該小分子配基的洗脫條件非常溫和，不會出現(xiàn)洗脫時對抗體蛋白的構(gòu)象產(chǎn)生破壞的現(xiàn)象。(4)該小分子配基分子量小，相對于蛋白更加穩(wěn)定，能夠耐受堿性條件。因而使用周期更長。更節(jié)省成本。因而本發(fā)明的小分子配基凝膠具有更優(yōu)秀的理化性質(zhì)，更廣泛的抗體親和吸附能力，生產(chǎn)更為簡單，成本更加低廉。

發(fā)明內(nèi)容
(1)該小分配基的氨基酸序列為(RTY)4K2KG。按照旋光度不同分為左旋 (L-RTY) 4K2KG 和右旋(D-RTY) 4K2KG 兩種。(2)多肽合成方式用于多肽合成原料Fmoc-Gly-wangresin保護氨基酸Fmoc_Lys (Fmoc)-0H，
Fmoc-tyr(otbu) -OH, Fmoc-thr(tbu)-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH.有機溶劑DMF( 二甲基甲酰胺)哌啶，甲醇，乙醚，三氟乙酸。其它試劑Η0ΒΤ，DIC.⑶合成方法Fmoc-Gly-wang resin 1 克用 10 毫升 DMF 溶脹 40 分鐘溶脹后的上述樹脂洗滌三次樹脂加入10毫升含20%的哌啶DMF溶液作用20分鐘，脫掉FMoc保護基團。加入1倍量的Fmoc-Lys(FMoc)-OHjn 1倍量的H0BT，DIC，以及10毫升的DMF，反
應(yīng)45分鐘。反應(yīng)后用茚三酮檢驗連接效率。連接其它氨基酸重復(fù)2-4，不過氨基酸依次使用Fmoc-Lys (fmoc) -0H, Fmoc-tyr (otbu) -OH, Fmoc-thr (tbu) -OH, Fmoc-Arg (pbf) -OH,反應(yīng)完畢，得到連接在樹脂上的多肽分子。反應(yīng)后的多肽樹脂用甲醇清洗，凍干，準(zhǔn)備切割實驗。凍干好了后的樹脂，用95% TFA DCM溶劑浸泡1小時，樹脂上的多肽從樹脂上切掉，進入TFA中。上述溶液迅速倒入預(yù)冷的乙醚中，得到白色沉淀為所需多肽。多肽通過質(zhì)譜鑒定，然后通過HPLC純化，得到純度大于98 %的產(chǎn)品，即為左旋 (L-RTY) 4K2KG。 若上述氨基酸中的 Fmoc-tyr (otbu) -OH, Fmoc-thr (tbu) -OH, Fmoc-Arg (pbf) -OH全部更換為右旋氨基酸，即 Rnoc-D-tyr (otbu) -OH, Fmoc-D-thr (tbu) -OH, Fmoc-D-Arg (pbf) -OH, 則為右旋(D-RTY) 4K2KG。(4)小分子配基和凝膠介質(zhì)交聯(lián)10毫克多臺溶解到碳酸鈉緩沖液中，緩沖液pH為7. 5-8. 0.濃度為2毫克每毫升。取用活化好的瓊脂糖凝膠6B (采用的產(chǎn)品型號為Genarose-eB) 1毫升上述兩者混合反應(yīng)2-3小時，中間用HPLC監(jiān)控反應(yīng)進程，反應(yīng)完畢后，用碳酸鈉緩沖液30毫升洗滌凝膠，得到連接有該小分子配基的瓊脂糖凝膠介質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種小分子配基親和層析凝膠的制備及其應(yīng)用。其特征在于(1)提供一種用于和 IgA, IgE, IgM, IgG IgY都能結(jié)合的小分子配基多肽的合成，以及通過把這種配基結(jié)合到凝膠介質(zhì)上形成一種用于純化抗體的新型親和純化介質(zhì)。( 該小分配基的氨基酸序列為 (RTY) 4K2KG。按照旋光度不同，分為左旋(L-RTY)4K2KG和右旋(D-RTY) 4K2KG。
2.如權(quán)利要求1所述的一種小分子配基親和層析凝膠的制備及其應(yīng)用，其特征在于 該小分子配基兼有ftOteinA，PtoteinG, ProteinL的親和特性，能夠和不同物種的免疫抗體發(fā)生親和作用。只需要采用不同的條件，就可以吸附不同的免疫蛋白，并且具有很優(yōu)秀的親和性。
3.如權(quán)利要求1所述的一種小分子配基親和層析凝膠的制備及其應(yīng)用，其特征在于 該小分子配基采用多肽合成方法生產(chǎn)。采用左旋的氨基酸原料合成可的左旋(L-RTY)4K2KG, 若采用右旋的氨基酸原來合成，即得到右旋(D-RTY)4K2KG。這兩者在親和特性上完全一樣， 只是由于右旋(D-RTY)4K2KG是采用右旋氨基酸合成得到，因此不容易被酶識別，更耐受酶的作用，降解時間要比左旋(L-RTY)4K2KG長三至四倍。
4.如權(quán)利要求1所述的一種小分子配基親和層析凝膠的制備及其應(yīng)用，其特征在于 該小分在配基在人體內(nèi)不會產(chǎn)生過敏反應(yīng)，該分子的毒性試驗表明，即使大量的該分子，也不會造成機體毒性。對動物的實驗結(jié)果為LD50 = 500至2000mg/kg。
5.如權(quán)利要求1所述的一種小分子配基親和層析凝膠的制備及其應(yīng)用，其特征在于 該小分子配基的洗脫條件非常溫和，在特定條件下，可以輕易的將目標(biāo)抗體洗脫下來。
6.如權(quán)利要求1所述的一種小分子配基親和層析凝膠的制備及其應(yīng)用，其特征在于 該小分子配基的結(jié)構(gòu)簡單，即使是不同廠商進行生產(chǎn)，都可以通過質(zhì)譜檢驗和HPLC檢驗， 確保結(jié)構(gòu)完全一致。因此在使用該小分子配基生產(chǎn)的凝膠基本上任何廠家的凝膠的安全性是可以統(tǒng)一保證的。(不同廠商，不同工藝代入的雜質(zhì)另行考慮)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種小分子配基親和層析凝膠的制備及其應(yīng)用，其特征是采用多肽合成的方法生產(chǎn)一種小分子配基，將該小分子配基交聯(lián)到瓊脂糖凝膠上而制得用于純化免疫蛋白的小分子配基親和層析凝膠。
文檔編號C07K1/22GK102234312SQ20101015339
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月22日
發(fā)明者高再興 申請人:高再興