專利名稱：排風(fēng)藤生物堿提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及排風(fēng)藤生物堿提取物及其制備方法和用途，屬藥物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
排風(fēng)藤Solanum cathayanum為茄科茄屬植物，草本藤木，多分枝，長(zhǎng)0.5～3m。莖、葉各部密被多節(jié)長(zhǎng)柔毛。葉互生，多數(shù)為心臟形，葉色淡綠，背青黃，葉多數(shù)全緣不裂，少數(shù)3裂，漿果成熟時(shí)紅色，花果期6-9月。生長(zhǎng)于海拔200～1400m處山坡陰濕處及灌木叢中，產(chǎn)于三峽地區(qū)的巴東、長(zhǎng)陽、秭歸、興山以及神農(nóng)架，全國(guó)大部分地區(qū)均有分布(見中國(guó)科學(xué)院武漢植物研究所.湖北植物志[M].武漢湖北科學(xué)技術(shù)出版社，20023.)。排風(fēng)藤亦為長(zhǎng)江三峽庫(kù)區(qū)民間廣為使用的民間中草藥，藥用全草，具有清熱利濕、解毒消腫之功效。排風(fēng)藤與紅棗的混合煎劑對(duì)小鼠艾利虛腹水癌及梭形細(xì)胞肉瘤的實(shí)體形及腹水有抑制作用，醇提取物對(duì)小鼠肉瘤180有抑制作用(江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海上?？萍汲霭嫔?，1977)。
目前對(duì)排風(fēng)藤的研究較少，如排風(fēng)藤化學(xué)成分研究/謝明霞周媛鄒坤程凡劉蓉；三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//中藥材.-2008，(9).排風(fēng)藤中脂肪酸成分的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析/莊樸偉鄧林勝秦雙玖宋發(fā)友逯平杰周媛；三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥.-2008，(8)，只對(duì)其中的成分進(jìn)行了相關(guān)的報(bào)道。
目前尚無針對(duì)排風(fēng)藤生物堿的相關(guān)報(bào)道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了排風(fēng)藤生物堿提取物，本發(fā)明的另一技術(shù)方案是提供了該排風(fēng)藤生物堿提取物的制備方法和用途。
本發(fā)明提供了一種排風(fēng)藤生物堿提取物，它是由排風(fēng)藤弱堿性生物堿、排風(fēng)藤叔胺生物堿、排風(fēng)藤水溶性生物堿中的一種或兩種以上混合，其重量配比為 排風(fēng)藤弱堿性生物堿0-10份、排風(fēng)藤叔胺生物堿0-10份、排風(fēng)藤水溶性生物堿0-10份，其中排風(fēng)藤弱堿性生物堿、排風(fēng)藤叔胺生物堿、排風(fēng)藤水溶性生物堿的重量不能同時(shí)為0。
其中，所述的排風(fēng)藤弱堿性生物堿在2％H2SO4，2％酒石酸或4％鹽酸的酸性條件下呈游離狀態(tài)、排風(fēng)藤叔胺生物堿在pH9-10條件下呈游離狀態(tài)、排風(fēng)藤水溶性生物堿在pH＞12條件下呈游離狀態(tài)。
其中，所述的排風(fēng)藤生物堿提取物的制備方法為取排風(fēng)藤，粉碎，酸水浸提，過濾，濾液，干燥，得排風(fēng)藤生物堿。
其中，所述的弱堿性生物堿是由上述的濾液經(jīng)氯仿萃取，取氯仿層，揮干氯仿，得弱堿性生物堿；由氯仿萃取后的酸水層，加氨水調(diào)pH值9-10，再經(jīng)氯仿萃取，取氯仿層，揮干，得叔胺生物堿；堿水層加NaOH調(diào)pH大于12，再用正丁醇萃取，取正丁醇層，萃取液揮干，得水溶性生物堿。
所述的排風(fēng)藤來源于茄科植物千年不爛心Solanum cathayanum Wu etHuang的干燥全草。
其中，本發(fā)明還提供了一種制備所述的排風(fēng)藤生物堿提取物的方法，包括如下步驟 a、取排風(fēng)藤，粉碎，酸水浸提，過濾，濾液，干燥，得排風(fēng)藤生物堿； b、將a步驟的濾液經(jīng)氯仿萃取，取氯仿層，揮干氯仿，得弱堿性生物堿；由氯仿萃取后的酸水層，加氨水調(diào)pH值9-10，再經(jīng)氯仿萃取，取氯仿層，揮干，得叔胺生物堿；堿水層加NaOH調(diào)pH大于12，再用正丁醇萃取，取正丁醇層，萃取液揮干，得水溶性生物堿。
本發(fā)明提供了排風(fēng)藤生物堿提取物在制備抗炎藥物中的用途。
本發(fā)明提供了排風(fēng)藤生物堿提取物在制備保肝的藥物中用途。
本發(fā)明還提供了如式I所示的排風(fēng)藤生物堿化合物在制備抗炎、保肝的藥物中的用途，
式1 其中R1為OH；R為CH3、CH2CH3Ar、C5H11O6、CH2CH2OCH3。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的化合物是SCE-1，其結(jié)構(gòu)式為
其中，化合物SCE-1的提取純化工藝如下 a、取排風(fēng)藤，粉碎，酸水浸提，過濾，得濾液； b、將濾液經(jīng)氯仿萃取，取酸水層，加氨水調(diào)pH值9-10，再經(jīng)氯仿萃取，取氯仿層，揮干，得生物堿粗膏； c、將b步驟制備的生物堿粗膏經(jīng)正相硅膠柱層析，以石油醚-丙酮梯度洗脫、Sephadex LH-20(氯仿-甲醇)柱層析分離以及半制備HPLC純化(乙腈-水)，得到化合物SCE-1。
本發(fā)明還提供了一種具有保肝或抗炎的藥物組合物，它是由有效量的上述化合物為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的藥劑。
其中，所述的制劑是口服制劑或注射制劑。
化合物SCE-1為白色結(jié)晶性粉末，熔點(diǎn)202-203.8℃，UVλnmMeOH205.4，228.8，297.2和345.8。分子式為C9H8N2O3，化學(xué)結(jié)構(gòu)通過1H、13C NMR和2D NMR(HSQC和HMBC)確證。該化合物通過對(duì)其成藥性的預(yù)測(cè)可知該化合物其成藥可能性為82.5％，可能的靶標(biāo)為鉀離子通道、NO合成酶、鳥苷酸環(huán)化酶。其ADMET預(yù)測(cè)結(jié)果為水溶性logSw＝-0.336(可溶)，肝毒性概率0.37(無毒)，CYP450酶系2D6模型抑制可能概率0.029(不抑制)，基于原子計(jì)算的脂水分配系數(shù)logP-0.628，血漿蛋白結(jié)合水平等級(jí)為2(較低)，RT3模型計(jì)算的大鼠口服LD505.5g/kg，95％置信區(qū)間下限808.1mg/kg，95％置信區(qū)間上限10g/kg，毒性非常小。初步藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示出了該化合物能顯著抑制脂多糖刺激腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO作用，具有細(xì)胞保護(hù)作用，采用酶法測(cè)定其IC50為60μg/ml。并且該化合物還能顯著降低離體培養(yǎng)中染毒肝細(xì)胞中的ALT水平，對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷具有與聯(lián)苯雙酯相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)作用。
本發(fā)明排風(fēng)藤生物堿提取物藥效明確，可控性強(qiáng)，具有明顯的抗炎、保肝作用，三類生物堿中，尤以排風(fēng)藤叔胺生物堿的藥效最佳。



圖1本發(fā)明排風(fēng)藤提取物的制備工藝流程圖 圖2最大吸收波譜掃描圖 圖3化合物SCE-1的提取分離工藝 圖4排風(fēng)藤水溶性生物堿、叔胺生物堿、弱堿性生物堿對(duì)LPS刺激后巨噬細(xì)胞COX2表達(dá)的影響(其中，圖4A陰性對(duì)照；圖4B模型對(duì)照；圖4C水溶性生物堿濃度250μg/ml；圖4D水溶性生物堿濃度125μg/ml；圖4G弱堿性生物堿濃度250μg/ml；圖4F弱堿性生物堿濃度125μg/ml；圖4I叔胺生物堿濃度250μg/ml；圖4J叔胺生物堿濃度125μg/ml；圖4M阿司匹林濃度250μg/ml；圖4N阿司匹林濃度125μg/ml)
具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1本發(fā)明排風(fēng)藤弱堿性生物堿、叔胺生物堿、水溶性生物堿的制備方法及質(zhì)量控制方法。
1)制備方法 干燥的排風(fēng)藤全草，粉碎，加入2％H2SO4或4％鹽酸浸提，浸提液過濾；濾液用氯仿萃取，氯仿層濃縮得弱堿性生物堿；酸水層用氨水調(diào)節(jié)pH9-10，繼續(xù)以氯仿萃取，氯仿層濃縮得叔胺生物堿；堿水層加氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH＞12，以正丁醇萃取，正丁醇層濃縮得水溶性生物堿。制備工藝流程見圖1。
2)排風(fēng)藤藥材的質(zhì)量檢測(cè)方法 以下面質(zhì)量檢測(cè)方法測(cè)定排風(fēng)藤藥材中生物堿(以化合物SCE-1計(jì))質(zhì)量占生藥的百分比，應(yīng)不少于0.25％。
對(duì)照品溶液的制備準(zhǔn)確稱取化合物SCE-150.0mg，以無水乙醇溶解定容至10mL，制成每毫升含5mg SCE-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。
供試品溶液的制備準(zhǔn)確稱取干燥的排風(fēng)藤全草粉末(過80目篩)10g，加100mL 2％鹽酸，于60℃超聲1.5h，抽濾得提取液，重復(fù)三次，提取液合并，以氨水調(diào)節(jié)pH 9-10，加200ml氯仿在40℃水浴超聲30min萃取三次，萃取液合并，減壓濃縮，所得浸膏用無水乙醇溶解轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶中定容，作為供試品溶液。
溴甲酚綠試劑的配制 稱取溴甲酚綠0.125g，用12.5mL 0.2mol·L-1的NaOH溶解，加入2.55g鄰苯二甲酸氫鉀，以少量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至250ml容量瓶中定容，備用。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與線性關(guān)系 精密吸取對(duì)照品溶液0.1、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8ml，，置已加入10ml氯仿的分液漏斗中，加2ml溴甲酚綠緩沖液，振搖1min，靜置60min，分取氯仿相，于410nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，隨行空白。以吸光度值y對(duì)對(duì)照品溶液濃度C作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝0.009+1.5718c，相關(guān)系數(shù)r＝0.9990。結(jié)果表明，對(duì)照品濃度在0.05～0.40mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。
樣品測(cè)定方法 精密稱取排風(fēng)藤干燥粉末10g 6份，照供試品溶液制備方法制備。分別量取各供試品溶液1.0ml，置入已放入10ml氯仿的分液漏斗中，再精密加入2ml溴甲酚綠緩沖液，震蕩1min，靜置60min至氯仿溶液澄清，分液取氯仿層(如不澄清加少量無水硫酸鈉去除水分)，以溴甲酚綠緩沖液飽和的氯仿液為空白，在410nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算含量。測(cè)定結(jié)果見表1。
表1樣品中叔胺生物堿含量測(cè)定結(jié)果(n＝6)
測(cè)定方法 精密吸取供試品溶液1.0ml，置已加入10ml氯仿的分液漏斗中，加2ml溴甲酚綠緩沖液，振搖1min，靜置60min，分取氯仿相(如不澄清加少量無水硫酸鈉去除水分)，以溴甲酚綠緩沖液飽和的氯仿液為空白，于410nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。將吸光度數(shù)值代入上述回歸方程計(jì)算，并換算成占生藥的百分比，應(yīng)不少于0.25％ 3)方法學(xué)驗(yàn)證 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精密吸取對(duì)照品溶液0.5ml和供試品溶液1.0ml，分別置于加入10ml氯仿的分液漏斗中，各加入溴甲酚綠緩沖液2ml，振搖1min，靜置60min，分取氯仿層，以氯仿加溴甲酚綠緩沖液為空白，在200～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，兩者在410nm波長(zhǎng)處均有最大吸收(見圖2)。故選擇410nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。
精密度試驗(yàn)及重現(xiàn)性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液0.50ml，共6份，按2.4.項(xiàng)下方法測(cè)定，吸光度值的RSD為0.94％，表明該方法具有高的精密度。
準(zhǔn)確稱取干燥排風(fēng)藤全草粉末6份，每份10g，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液各1.0ml，按2.4項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值，計(jì)算供試品溶液含量，其RSD為2.43％，表明方法具有良好的重現(xiàn)性。結(jié)果見表2。
表2重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果
穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液0.50ml和供試品溶液1.0ml，分別按2.4.項(xiàng)下方法分取有機(jī)相在室溫下避光放置，每隔10-20min測(cè)定吸光度值，至120min。結(jié)果表明在120min內(nèi)兩者吸光度值無明顯變化，RSD分別為1.03％和1.32％。
加標(biāo)回收率試驗(yàn) 精密稱取5g已知含量的干燥排風(fēng)藤粉末9份，分成3組，各組樣分別加入1.00、2.00、3.00ml對(duì)照品溶液(5mg.ml-1)，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取1.0ml，按2.4項(xiàng)下方法測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見表3。結(jié)果表明，平均加標(biāo)回收率為99.28％，RSD值為1.5％，表明該方法的準(zhǔn)確度好。
表3加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果(n＝9)
2、化合物的制備方法及表征化合物結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)。
1)制備方法(見圖3) 干燥的排風(fēng)藤全草，粉碎，加入2％H2SO4或4％鹽酸浸提，浸提液過濾，濾液用氯仿萃取，氯仿層濃縮得弱堿性生物堿；酸水層用氨水調(diào)節(jié)pH9-10，繼續(xù)以氯仿萃取，氯仿層濃縮得叔胺生物堿；堿水層加氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH＞12，以正丁醇萃取，正丁醇層濃縮得水溶性生物堿。制備工藝流程見圖1。將制備的叔胺生物堿相膏經(jīng)正相硅膠柱層析，以石油醚-丙酮梯度洗脫、SephadexLH-20(氯仿-甲醇)柱層析分離以及半制備HPLC純化(乙腈-水)，得到化合物SCE-1。
2)化合物結(jié)構(gòu)確證 化合物SCE-1白色結(jié)晶性粉末，熔點(diǎn)202-203.8℃，與生物堿試劑呈正反應(yīng)。UVλnmMeOH204，227，296和343。HR-ESIMS顯示[M-H]+的m/z為191.0533，可確定其分子式為C9H8N2O3，化學(xué)結(jié)構(gòu)通過1H、13C NMR和2D NMR(HSQC和HMBC)圖譜解析，鑒定為8-羥基-3-甲氧基-5H.吡啶[2，1-c]并吡嗪-5-酮?；衔颯CE-1的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1，HMBC相關(guān)見圖2，NMR數(shù)據(jù)歸屬見表3
式1化合物SCE-1的結(jié)構(gòu)式2化合物SCE-1的HMBC 化合物SCE-1的不飽和度為7，1H和13C的NMR數(shù)據(jù)(表4)表明分子中有三個(gè)不飽和雙建(包括一個(gè)羰基和兩個(gè)烯基)，根據(jù)飽和度的數(shù)據(jù)提示化合物SCE-1是一個(gè)雙環(huán)結(jié)構(gòu)的分子。1H和13C的NMR數(shù)據(jù)(表4)提示化合物SCE-1有一個(gè)甲氧基信號(hào)(δH＝3.90，s；δC＝56.8，q)，四個(gè)亞甲基信號(hào)，包括兩個(gè)成對(duì)的(δH＝7.84，d，J＝9.5Hz；δC＝146.2，d；δH＝6.17，d，J＝9.5Hz；δC＝112.3，d)和兩個(gè)不成對(duì)(δH＝6.75，s；δC＝104.1，d；δH＝7.09，s；δC＝109.9，d)，四個(gè)季碳信號(hào)(δC＝147.4，s；151.7，s；153.7，s；164.2，s)。此外，從NMR數(shù)據(jù)的特征吸收(δH＝7.84，d，J＝9.5Hz；δC＝146.2，d；δH＝6.17，d，J＝9.5Hz；δC＝112.3，d；δC＝164.2，s；151.7，s；153.7，s)提示化合物SCE-1有一個(gè)αβ-不飽和內(nèi)酰胺吡啶環(huán)，并通過從H-6到C-5，C-7和H-7到C-5，C-8，C-8a的HMBC譜對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證。吡啶環(huán)上并有一個(gè)吡嗪環(huán)(δH＝6.75，s；7.09，s；δC＝104.1，d；147.4，s；109.9，s；153.7，s)，如圖1所示，同時(shí)通過H-4/C-3，H-4/C-5，H-4/C-8a，H-1/C-3，H-1/C-7，H-1/C-8，H-1/C-8a(圖2)HMBC相關(guān)譜對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證。通過以上數(shù)據(jù)，化合物SCE-1鑒定為一種吡啶并[2，1-c]吡嗪生物堿。從化合物SCE-1分子式可以推斷在C-8(δC＝151.7，s)位上存在一個(gè)羥基，在HMBC相關(guān)譜上甲氧基上質(zhì)子(δH＝3.90，s)與C-3(δC＝147.4，s)有關(guān)聯(lián)，提示甲氧基連在C-3位。故化合物SCE-1的結(jié)構(gòu)鑒定為8-羥基-3-甲氧基-5H-吡啶[2，1-c]吡嗪-5-酮。化合物SCE-1的NMR數(shù)據(jù)歸屬見表4。
表41H(500MHz)and13C NMR(125MHz)Data for Compound SCE-1in Methanol-d4
實(shí)施例2本發(fā)明藥物組合物的制備 取排風(fēng)藤弱堿性生物堿10g，加入藥學(xué)上常用輔料，制備成膠囊劑。
實(shí)施例3本發(fā)明藥物組合物的制備 取排風(fēng)藤叔胺生物堿10g，加入藥學(xué)上常用輔料，制備成片劑。
實(shí)施例4本發(fā)明藥物組合物的制備 取排風(fēng)藤水溶性生物堿10g，加入藥學(xué)上常用輔料，制備成顆粒劑。
實(shí)施例5本發(fā)明藥物組合物的制備 取排風(fēng)藤弱堿性生物堿10g、排風(fēng)藤叔胺生物堿10g、排風(fēng)藤水溶性生物堿10g，加入藥學(xué)上常用輔料，制備成膠囊劑。
以下通過藥效學(xué)試驗(yàn)證明本發(fā)明的有益效果。
試驗(yàn)例1本發(fā)明藥物抗炎活性試驗(yàn) (1)體外篩選 采用Griess試劑法和免疫細(xì)胞化學(xué)方法研究排風(fēng)藤水溶性生物堿(弱堿性、水溶性)及單體化合物SCE-1對(duì)LPS刺激后巨噬細(xì)胞生成NO的影響以及對(duì)COX2表達(dá)的影響。
Griess反應(yīng) 以蒸餾水配制0.2％萘乙烯二胺，以10％磷酸配制2％磺胺，4℃避光保存，待用時(shí)1∶1混合成為Griess反應(yīng)試劑。
繪制亞硝酸鈉標(biāo)曲線 配置0.08mol/L即(5.52mg/mL)亞硝酸鈉溶液，確定最大吸收波長(zhǎng)。按照二倍稀釋法分別配置0.08，0.04，0.02，0.01，0.005mol/L亞硝酸鈉溶液，于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，繪制亞硝酸鈉標(biāo)曲線。
取小鼠腹腔注射1％的淀粉和1％的羧甲基纖維素鈉的1∶1混合液，每只1毫升，三天后斷頭處死，用70％乙醇浸泡15-20分鐘，無菌條件下腹腔注射PBS液，洗出腹腔細(xì)胞，1000r/min。離心8分鐘。細(xì)胞用PBS洗一次，做細(xì)胞計(jì)數(shù)。用含10％小牛血清的培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度至3×106cell/ml.將細(xì)胞接種于96孔板，每孔100μL，37℃，5％CO2。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，加入不同藥物100μL繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后加LPS刺激，(終濃度為800ng/ml)培養(yǎng)24h，取上清100μL到另一96孔板中，加入100μL Griess反應(yīng)試劑，室溫放置10min，在酶標(biāo)儀530nm處測(cè)其OD值。以NaNO2為對(duì)照品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算NO含量。
免疫細(xì)胞化學(xué)方法 4％多聚甲醛的配制 按照多聚甲醛濃度為4％，用電子天平準(zhǔn)確稱取多聚甲醛顆粒熔入小燒杯中的PBS液中，攪拌均勻，置于70℃以上水浴中，以充分溶解。
含0.3％TritonX-100的PBS的配制 按照TritonX-100濃度為0.3％，用微量取樣槍吸出一定量的TritonX-100，將其融于PBS液中，吹打數(shù)次使其混合均勻，或者置于數(shù)控超聲波清洗儀中超聲幾分鐘使其溶解混合均勻。
2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對(duì)LPS刺激后巨噬細(xì)胞生成NO的影響 排風(fēng)藤水溶性生物堿、叔胺生物堿、弱堿性生物堿及單體化合物SCE-1對(duì)巨噬細(xì)胞生成NO的影響，結(jié)果見表5、6。
表5排風(fēng)藤各提取部位對(duì)LPS刺激巨噬細(xì)胞生成NO的影響(

±s，n＝6)
與模型組比較*p＜0.05，**p＜0.01 表6化合物SCE-1對(duì)LPS刺激巨噬細(xì)胞生成NO的影響(

±s，n＝4)
與模型組比較*p＜0.05，**p＜0.01 由表5、6可知，經(jīng)LPS刺激后，模型組的OD值明顯比空白組的高，說明LPS能夠誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞合成一氧化氮。而加入排風(fēng)藤水溶性生物堿、叔胺生物堿、弱堿性生物堿及單體化合物SCE-1后，OD值較模型組降低，說明排風(fēng)藤水溶性生物堿、叔胺生物堿、弱堿性生物堿對(duì)LPS刺激后巨噬細(xì)胞生成NO均有抑制作用。排風(fēng)藤單體SCE-1濃度在40μg/ml，60μg/ml、80μg/ml時(shí)對(duì)LPS刺激巨噬細(xì)胞引起的NO濃度升高有抑制作用，濃度在60μg/ml、80μg/ml時(shí)對(duì)LPS刺激巨噬細(xì)胞引起的NO濃度與模型組比較差異有顯著性。
排風(fēng)藤水溶性生物堿、叔胺生物堿、弱堿性生物堿對(duì)LPS刺激后巨噬細(xì)胞COX-2表達(dá)的影響 排風(fēng)藤水溶性生物堿、叔胺生物堿、弱堿性生物堿對(duì)LPS刺激后巨噬細(xì)胞COX-2表達(dá)的影響見下圖4 由模型組和空白組的圖像相比可知，經(jīng)LPS刺激后，COX-2表達(dá)明顯增強(qiáng)。而加入排風(fēng)藤各部位提取物后，COX-2的表達(dá)受抑制，特別是排風(fēng)藤叔胺生物堿對(duì)COX-2表達(dá)有很強(qiáng)的抑制作用。排風(fēng)藤水溶性生物堿在高劑量的時(shí)候?qū)OX-2表達(dá)有較強(qiáng)的抑制作用，排風(fēng)藤弱堿性生物堿對(duì)COX-2表達(dá)也有較強(qiáng)的抑制作用。排風(fēng)藤水溶性生物堿、叔胺生物堿、弱堿性生物堿對(duì)LPS刺激后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞COX-2的表達(dá)均有抑制作用。
(2)體內(nèi)篩選 1)實(shí)驗(yàn)方法 排風(fēng)藤醇提取物的體內(nèi)抗炎活性篩選，應(yīng)用角叉菜膠致炎，以其腫脹抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，觀察藥物對(duì)急性炎癥的影響。應(yīng)用佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠模型，以阿司匹林為陽性對(duì)照，蒸餾水為空白對(duì)照，觀察足腫脹和炎性介質(zhì)變化即致炎組織中的PGE2和血清中NO含量。
對(duì)角叉菜膠所致小鼠足腫脹的影響角叉菜膠性足腫脹是眾多篩選抗炎藥物的方法中，應(yīng)用最多的方法之一。
a藥物制備 排風(fēng)藤叔胺生物堿提取物配制濃度為0.344g/ml和0.172g/ml，水溶性生物堿提取物配制濃度為0.344g/ml和0.172g/ml，弱堿性生物堿提取物配制濃度為0.056g/ml和0.028g/ml，以上提取物均用單蒸水溶解，并根據(jù)各自得率折算成原生藥量，4℃冰箱保存；阿司匹林單蒸水溶解，配制濃度為0.011g/ml，4℃冰箱保存。
角叉菜膠(carrageenin)在超凈工作臺(tái)避光條件下，用無菌生理鹽水配成濃度為0.5％后，裝于EP青霉素瓶中，保存于4℃冰箱。
b動(dòng)物分組給藥及方法 取昆明雄性小鼠110只，隨機(jī)分為11組，每組10只； 空白對(duì)照組i.g.單蒸水；模型組i.g.單蒸水；陽性對(duì)照組i.g.阿司匹林0.011g/kg；排風(fēng)藤叔胺生物堿高劑量組i.g.80g/kg；排風(fēng)藤叔胺生物堿低劑量組i.g.40g/kg；排風(fēng)藤水溶性生物堿高劑量組i.g.80g/kg；排風(fēng)藤水溶性生物堿低劑量組i.g.40g/kg；排風(fēng)藤弱堿性生物堿提取物高劑量組i.g.80g/kg；排風(fēng)藤堿性生物堿提取物低劑量組i.g.40g/kg。
以上各組動(dòng)物均每日灌胃給藥一次，連續(xù)3天，末次給藥后0.5h，將0.5％角叉菜膠混懸液20ul注入每只小鼠右后足趾皮下致炎，用自制小鼠足容積測(cè)定儀分別測(cè)定致炎前及致炎后0.5、2、4、的足容積，計(jì)算各組的腫脹度。
c測(cè)定指標(biāo) 以左、右兩側(cè)體積腫脹的差值作為腫脹度。
腫脹率％＝(致炎后右后足容積/左后足容積-1)×100％ d資料統(tǒng)計(jì)分析方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(

±s)表示，應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著性意義。
對(duì)小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的影響佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠模型是RA的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。此模型是細(xì)菌學(xué)家Freund于1950年代創(chuàng)立，多采用小鼠。用卡介苗佐劑在小鼠左足拓部皮下注射，原發(fā)病變主要表現(xiàn)為致炎局部的炎癥反應(yīng)，繼發(fā)病變主要表現(xiàn)為對(duì)側(cè)后足的繼發(fā)性腫脹，一般于致炎后10-20天左右出現(xiàn)，病理改變?yōu)榛は陆M織炎癥，滑膜血管增生，軟骨破壞。佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠的關(guān)節(jié)組織病理學(xué)與人RA相似。
a.藥物制備 排風(fēng)藤叔胺生物堿單蒸水溶解，配制濃度為0.0064g/ml、0.0096g/ml和0.128g/ml；排風(fēng)藤水溶性生物堿單蒸水溶解，配制濃度為0.0075g/ml和0.015g/ml；排風(fēng)藤弱堿性生物堿單蒸水溶解，配制濃度為0.00562g/ml(根據(jù)得率折算成原生藥量)，4℃冰箱保存； 雙氯芬酸鈉腸溶片溶液無菌生理鹽水稀釋至0.25mg/ml后裝于青霉素瓶中于4℃冰箱保存； 卡介苗溶液將同一批號(hào)的卡介苗80℃水浴滅活1h用無菌液體石蠟配成5mg/ml的乳劑，充分研磨混勻即成FCA； 10％磷酸的配制將85％的磷酸稀釋至10％； Griess試劑的配制以蒸餾水配制0.2％萘乙二胺鹽酸鹽，以10％磷酸配制2％對(duì)氨基苯磺酰胺各10ml，待用時(shí)二者以1∶1等體積混合，4℃冰箱避光保存； 30％硫酸鋅溶液的配制以蒸餾水配制濃度為30％的硫酸鋅20ml，4℃冰箱保存。
b.動(dòng)物模型的制作 致炎前用容積測(cè)定儀測(cè)定小鼠左、右后踝關(guān)節(jié)以下容積(ml)，然后除正常組外各鼠左后足趾皮內(nèi)注射20μl FAC致炎。
c.動(dòng)物分組給藥及方法 選有用昆明小鼠88只，雄性，6～8周齡。隨機(jī)分成11組空白對(duì)照組，模型組，雙氯芬酸鈉陽性藥物組；排風(fēng)藤叔胺生物堿40、60、80g/kg組；排風(fēng)藤水溶性生物堿40、80g/kg組；排風(fēng)藤弱堿性生物堿40g/kg組，每組8只。
致炎前用容積測(cè)定儀測(cè)定小鼠左、右后踝關(guān)節(jié)以下容積(ml)，然后除正常組外各鼠左右后足趾皮內(nèi)注射20μlFAC致炎。致炎前3天開始灌胃給藥，連續(xù)28天，并檢測(cè)致炎側(cè)身(左側(cè))、非致炎側(cè)(右側(cè))足腫脹，每8天次，以致炎前后足容積差為腫脹度。于造模后第28天摘眼取血處死小鼠，檢測(cè)小鼠血液中NO及致炎組織中PGE2、NO的含量。
血漿中NO的測(cè)定方法對(duì)小鼠進(jìn)行眼球取血裝于EP管中，1500r/min離心5min，取上清液0.3ml于新EP管中，加入0.9ml蒸餾水，再加入0.06ml30％硫酸鋅溶液，離心(4000r/min，15min)，用移液槍向96孔板中加入上清液和試劑各100μl，室溫放置10min，用酶標(biāo)儀在524nm下測(cè)其吸光光度值。
組織中NO的測(cè)定方法剪下致炎組織并剪碎后用生理鹽水3ml浸泡，2小時(shí)后取出，3000r/min離心浸泡液5min；取上清液0.5ml于新EP管中，加入0.5ml蒸餾水，再加入50μl30％硫酸鋅溶液，離心(5000r/min，15min)向96孔板中加入上清液和Griess試劑各100μl，室溫放置10min，用酶標(biāo)儀測(cè)其吸光度值； 組織中PGE2的測(cè)定方法取上清液0.2ml于新EP管中，加0.5ml/LKOH-甲醇溶液0.2ml，50℃水浴異構(gòu)化20min后，加甲醇1.6ml稀釋，用移液槍取100μl于紫外板中，于278nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。
d.測(cè)定指標(biāo) 致炎前用容積測(cè)定儀測(cè)定小鼠左、右后踝關(guān)節(jié)以下容積(ml)，，以致炎前后足容積差為腫脹度。于造模后第28天摘眼取血處死小鼠，檢測(cè)小鼠血液中NO及致炎組織中PGE2、NO的含量。
e.資料統(tǒng)計(jì)分析方法 方法同上 2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對(duì)角叉菜膠所致小鼠足腫脹的影響排風(fēng)藤弱堿性生物堿、水溶性生物堿、叔胺生物堿萃取物對(duì)角叉菜膠所致小鼠足腫脹的影響結(jié)果見表7。
表7排風(fēng)藤生物堿堿提取物對(duì)角叉菜膠致炎小鼠足腫脹度的影響(

±s，n＝10)
與模型組比較*p＜0.05，**p＜0.01 排風(fēng)藤叔胺生物堿提取物高、低劑量組，排風(fēng)藤水溶性生物堿提取物高、低劑量組均對(duì)小鼠足腫脹有抑制作用，其抑制腫脹率0.5h時(shí)分別為67％、15％，61％、49％；2h時(shí)分別為69％、53％，56％、26％；4h時(shí)分別為35％、31％，35％、9％。
對(duì)小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的影響小鼠腫脹率在第21天時(shí)達(dá)到峰值，排風(fēng)藤叔胺生物堿組均能降低關(guān)節(jié)處的腫脹率；結(jié)果見表8、9、10。
對(duì)致炎組織中的PGE2和血清中NO含量的影響排風(fēng)藤叔胺生物堿、水溶性生物堿、弱堿性生物堿都能降低致炎組織中的PGE2和血清中的NO的含量，其中叔胺生物堿有較好的效果。結(jié)果見表11、表12。
表8排風(fēng)藤提取物對(duì)小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎腫脹率的影響(％)(

±s，n＝8)
表9排風(fēng)藤提取物對(duì)小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎腫脹率的影響(％)(

±s，n＝8)
表10排風(fēng)藤提取物對(duì)小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎重量的影響(

±s，n＝8)
表11小鼠致炎組織中PGE2和NO吸光度值(

±s，n＝8)
表12血清中NO的吸光度值(

±s，n＝8)
與模型組比較**＜0.01＜*＜0.05 與空白組比較**＜0.01＜*＜0.05 試驗(yàn)例2本發(fā)明藥物保肝活性的試驗(yàn) 1)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法 a藥物制備排風(fēng)藤叔胺生物堿單蒸水溶解，配制濃度為0.0064g/ml和0.0128g/ml，排風(fēng)藤水溶性生物堿配制濃度為0.0258g/ml和0.0344g/ml。(根據(jù)得率折算成原生藥量)，4℃冰箱保存； 聯(lián)苯雙酯BDP陽性藥在超凈工作臺(tái)避光條件下，無菌生理鹽水稀釋至0.255mg/ml后裝于青霉素瓶中于4℃冰箱。
b.動(dòng)物模型的制作 給藥4天后腹腔注射0.2ml四氯化碳-玉米油以建立小鼠急性肝炎模型。
c.動(dòng)物分組及給藥方法 選有用昆明小鼠56只，雄性，6～8周齡。隨機(jī)分成7組空白對(duì)照組，模型組，BDP陽性藥物組，排風(fēng)藤叔胺生物堿40、80g/kg組，排風(fēng)藤水溶性生物堿60、80g/kg組，每組8只。
從第一天開始灌胃給藥，連續(xù)四天，第四天灌胃給藥后，除空白對(duì)照組外，其它各小組給藥4天后腹腔注射0.2ml四氯化碳-玉米油以建立小鼠急性肝炎模型。小鼠禁食不禁水饑餓過夜16個(gè)小時(shí)。第五天灌胃給藥半小時(shí)后，取眼球血于EP管中離心，并將小鼠斷頸處死。開始離心時(shí)的轉(zhuǎn)速為1000r/min離心10min，后用3000r/min離心10min。用注射器吸取上層血清于新EP管中，送到三峽大學(xué)二門診測(cè)其總膽紅素(TBILI)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的含量。
d.測(cè)定指標(biāo) 檢測(cè)血清中的膽紅素(TBILI)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的含量。
e.資料統(tǒng)計(jì)分析方法 方法同上 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析，納入56鼠，均進(jìn)入結(jié)果分析，無脫失值。
肝功能 結(jié)果表明，排風(fēng)藤叔胺生物堿提取物能顯著降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和總膽紅素具有肝保護(hù)作用。
排風(fēng)藤叔胺生物堿提取物對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠具有一定的保肝活性。排風(fēng)藤叔胺生物堿對(duì)小鼠體重沒有明顯影響，降低四氯化碳所致小鼠肝損傷后谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和總膽紅素和活性的升高，提示排風(fēng)藤叔胺生物堿萃取物對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠具有一定的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表13。
表13血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和總膽紅素的含量(

±s，n＝8)
與模型組比較**P＜0.01，*P＜0.05；叔胺生物堿和水溶性生物堿的藥量根據(jù)得率折算成原生藥量分別為40、80g/kg。
與正常組比較，模型組小鼠肝臟指數(shù)呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，排風(fēng)藤各劑量組與模型組比較呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。與正常組比較，模型組小鼠血清ALT和AST水平顯著升高，排風(fēng)藤各劑量組呈現(xiàn)一定降低趨勢(shì)，其中叔胺生物堿，水溶性生物堿均能降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和總膽紅素的含量，并且叔胺生物堿的效果比水溶性生物堿萃取部位的更好。
2)體外實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果 體外實(shí)驗(yàn)方法 a藥物制備 排風(fēng)藤叔胺生物堿配制濃度為300μg/ml，番茄堿、脲基甲酸乙酯配制濃度為200μg/ml，京尼平苷配制濃度為100μg/ml，用無菌PBS對(duì)倍稀釋成相應(yīng)的5個(gè)濃度，SCE-1、BDP陽性藥配制濃度為75μg/ml，裝于青霉素瓶中于4℃冰箱。
b模型的制作 選取新生小鼠，禁食24h后，斷頭取血，無菌分離肝臟，置PBS液中，沖洗肝臟至灰白色，將肝臟剪成1mm左右的組織快，并用尼農(nóng)網(wǎng)碾磨，1000r/min離心5min，去上清，加入培養(yǎng)液，用槍頭輕吹成肝細(xì)胞懸液。取上述肝細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，設(shè)正常對(duì)照組，CCl4模型組(濃度為1.6ul/ml)，不同劑量給藥組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，37℃孵育3個(gè)小時(shí)后，2000r/min冷凍離心5min，收集肝細(xì)胞上清。
c測(cè)定指標(biāo) 按賴氏法測(cè)定肝細(xì)胞中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的活性。
d資料統(tǒng)計(jì)分析方法 方法同上 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果 排風(fēng)藤提取物和生物堿化合物SCE-1抗體外CCl4所致急性肝損傷的作用，試驗(yàn)結(jié)果見表14及表15。
表14肝細(xì)胞中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性(

±s，n＝6)
與模型組比較**P＜0.01，*P＜0.05； 表15肝細(xì)胞中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性(

±s，n＝6)
與模型組比較**P＜0.01，*P＜0.05；SCE-18-hydroxy-3-methoxy-5H.pyrido[2，1-c]pyrazin-5-one為新化合物 與正常組比較，模型組小鼠肝細(xì)胞中ALT水平顯著升高，叔胺生物堿、水溶性生物堿與模型組比較呈現(xiàn)降低趨勢(shì)且降低的效果呈劑量依賴性；從叔胺生物堿中得到的8-羥基-3-甲氧基-5H.吡啶[2，1-c]并吡嗪-5-酮、脲基甲酸乙酯對(duì)小鼠肝細(xì)胞中ALT水平表現(xiàn)出良好的降低作用。
排風(fēng)藤叔胺生物堿、水溶性生物堿、單體化合物SCE-1與谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)結(jié)合，使得小鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力下降。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)經(jīng)常地被用作判定肝損傷程度的重要指標(biāo)。說明排風(fēng)藤叔胺生物堿和水溶性生物堿具有肝保護(hù)作用，單體化合物SCE-1肝保護(hù)作用好，其降低ALT水平與聯(lián)苯雙酯相當(dāng)。
權(quán)利要求
1.排風(fēng)藤生物堿提取物，其特征在于它含有排風(fēng)藤弱堿性生物堿、排風(fēng)藤叔胺生物堿、排風(fēng)藤水溶性生物堿中的一種或兩種以上混合，其重量配比為
排風(fēng)藤弱堿性生物堿0-10份、排風(fēng)藤叔胺生物堿0-10份、排風(fēng)藤水溶性生物堿0-10份，其中排風(fēng)藤弱堿性生物堿、排風(fēng)藤叔胺生物堿、排風(fēng)藤水溶性生物堿的重量不能同時(shí)為0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的排風(fēng)藤生物堿提取物，其特征在于所述的排風(fēng)藤弱堿性生物堿在2％H2SO4，2％酒石酸或4％鹽酸的酸性條件下呈游離狀態(tài)、排風(fēng)藤叔胺生物堿在pH9-10條件下呈游離狀態(tài)、排風(fēng)藤水溶性生物堿在pH＞12條件下呈游離狀態(tài)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的排風(fēng)藤生物堿提取物，其特征在于所述的排風(fēng)藤生物堿提取物的制備方法為取排風(fēng)藤，粉碎，酸水浸提，過濾，濾液，干燥，得排風(fēng)藤生物堿。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的排風(fēng)藤生物堿提取物，其特征在于所述的弱堿性生物堿是由權(quán)利要求3所述的濾液經(jīng)氯仿萃取，取氯仿層，揮干氯仿，得弱堿性生物堿；由氯仿萃取后的酸水層，加氨水調(diào)pH值9-10，再經(jīng)氯仿萃取，取氯仿層，揮干，得叔胺生物堿；堿水層加NaOH調(diào)pH大于12，再用正丁醇萃取，取正丁醇層，萃取液揮干，得水溶性生物堿。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的排風(fēng)藤生物堿提取物，其特征在于所述的排風(fēng)藤來源于茄科植物千年不爛心Solanum cathayanum Wu et Huang的干燥全草。
6.一種制備權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的排風(fēng)藤生物堿提取物的方法，包括如下步驟
a、取排風(fēng)藤，粉碎，酸水浸提，過濾，濾液，干燥，得排風(fēng)藤生物堿；
b、將a步驟的濾液經(jīng)氯仿萃取，取氯仿層，揮干氯仿，得弱堿性生物堿；由氯仿萃取后的酸水層，加氨水調(diào)pH值9-10，再經(jīng)氯仿萃取，取氯仿層，揮干，得叔胺生物堿；堿水層加NaOH調(diào)pH大于12，再用正丁醇萃取，取正丁醇層，萃取液揮干，得水溶性生物堿。
7.權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的排風(fēng)藤生物堿提取物在制備抗炎藥物中的用途。
8.權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的排風(fēng)藤生物堿提取物在制備保肝的藥物中用途。
9.如式I所示的排風(fēng)藤叔胺生物堿化合物在制備抗炎、保肝的藥物中的用途，
式1
其中R1為OH；R2為CH3、CH2CH3Ar、C5H11O6、CH2CH2OCH3。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于所述的化合物是SCE-1，其結(jié)構(gòu)式為
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于化合物SCE-1的提取純化工藝如下
a、取排風(fēng)藤，粉碎，酸水浸提，過濾，得濾液；
b、將濾液經(jīng)氯仿萃取，取酸水層，加氨水調(diào)pH值9-10，再經(jīng)氯仿萃取，取氯仿層，揮干，得生物堿粗膏；
c、將b步驟制備的生物堿粗膏經(jīng)正相硅膠柱層析，以石油醚-丙酮梯度洗脫、Sephadex LH-20(氯仿-甲醇)柱層析分離以及HPLC純化(乙腈-水)，得到化合物SCE-1。
12.一種具有保肝或抗炎作用的藥物組合物，其特征在于它是由權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的排風(fēng)藤生物堿提取物或權(quán)利要求9-11任意一項(xiàng)所述的化合物SCE-1為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的藥劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥劑是口服制劑或注射制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了排風(fēng)藤生物堿提取物，它是由排風(fēng)藤弱堿性生物堿、排風(fēng)藤叔胺生物堿、排風(fēng)藤水溶性生物堿中的一種或其混合而成。本發(fā)明還提供了該提取物的制備方法和用途。本發(fā)明還提供了一種從排風(fēng)藤生物堿中分離的化合物的用途。本發(fā)明藥物藥效明確，可控性強(qiáng)，具有明顯的抗炎、保肝作用。
文檔編號(hào)C07G5/00GK101830935SQ20101014878
公開日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月9日
發(fā)明者周媛, 鄒坤, 汪鋆植, 程凡, 郭志勇, 楊進(jìn), 但飛君, 陳劍鋒, 謝明霞, 董文娟 申請(qǐng)人:三峽大學(xué)